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1、6基因工程阶段四、发酵工业的范围： 现代发酵工业涉及领域按微生物发酵产品的性质分为以下几个方面。1 微生物菌体发酵2微生物酶发酵：3 微生物代谢产物发酵4微生物的生物转化发酵：生物转化与化学反应相比优点：反应条件温和，对环境无污染。5微生物特殊机制的利用（1）利用微生物消除环境污染环境恶化（2）利用微生物发酵保持生态平衡（3）微生物湿法冶金：（4）利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域五、发酵工业的特点1.发酵原料的选择2.微生物菌种得选育及扩大培养3.发酵设备选择以及工艺条件控制发酵工艺控制关键：发酵全过程的无菌状态的保持，防杂菌污染，设备冲洗，培养基灭菌，空气过滤。4. 发酵产物的分离提取5.

2、发酵废物的回收和利用第二章 发酵培养基第一节 培养基的类型及功能 培养基：是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。（人工配制的含有营养物质的供微生物生长的介质。）发酵培养基作用：满足菌体生长+促进产物形成。一、培养基的营养成分及来源1、能源 2、碳源 3、氮源 4、有机盐 5、特殊生长因子 二、培养基的类型和用途1、按物质来源分：自然培养基（化学成分不清楚，异养微生物完全培养基）、合成培养基（化学成分和数量已知配制，实验室用生长慢）、半合成培养基（天然碳、氮、生长因子和化学药品，多数微生物使用）合成培养基：由已知组成成分的各种营养物质组合的培

3、养基叫合成培养基。复合培养基（天然+半合成）：由一些组成成分不完全明确的天然有机物与一些无机盐组合的培养基。2、按物理性状态分：固体培养基、半固体培养基、体培养基固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 。半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8% ,主要用于微生物的鉴定。液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。3、按生产工艺用途分：从发酵生产应用考虑）孢子培养基、种子培养基、发酵培养基，工业中常用种子和发酵培养基用生产。（1）孢子培养基：供制备孢

4、子用的。孢子：某一生长阶段中，在营养细胞内形成一个圆形，卵圆形或圆柱形的休眠体叫孢子。（2）种子培养基：供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。（3）发酵培养基：是供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。三、发酵培养基的选择： 培养基供菌生长、繁殖、代谢、合成产物的营养物质。培养基成分和配比的适合与否影响菌的生长代谢，对产物的工艺质量和产量影响大。1、选择和培植发酵培养基对应考虑的基本原则：（1）、必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。（2）、有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。（3）、有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。（4）、有利于提

5、高产物的合成速度，缩短发酵周期。（5）、尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。（6）、原料价格低廉，质量稳定，取材容易。（7）、所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。（8）、有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。2、工业化发酵培养基选择步骤：（1）、了解菌种来源、生活习惯，理化特性和营养要求。（2）、了解生产菌种的培养条件、生物合成代谢途径、代谢产物化学性质、结构、工艺、产品质量要求。（3）、选化学合成培养基进行摇瓶试验每小发酵罐培养，氮、碳产物代谢能力情况的摸索，选择适宜的pH值。（4）、确定培养基配比确定金属（非）离子的影响无机要素

6、营养要求，按高低、适中进行确定做复合培养基试验做发酵条件与培养基关系试验用碳酸钙调pH值中间补料法控制碳、氮、养料、前体类物质代谢引导发酵向合成产物的途径发展。四、配制工业发酵培养基的一般要求：1、营养物组成较丰富，浓度适当，能满足菌丝体菌种发芽和生长繁殖成大量具有生理功能的需要（产物合成潜力提高）2、在一定条件下，各种原材料彼此不产生化学反应，理化性相对稳定。3、粘度适中，渗透压适当。4、原材料品种及浓度对代谢产物生物合成过程要有利于主产物的生物合成，高产率维持时间长，副产物合成率要降至最低。5、不影响发酵过程的通气和搅拌，便于产物的分离纯化。6、原材料尽量选质优价廉、成本低。 第二节 发酵

7、培养基的成分及来源 培养基原料：C（50%）、N、无机盐、微量元素、水、生长因子、前体。一、碳源：（微生物自身细胞物质、糖类、脂、蛋白质等和能源构成菌体的主要元素及各代谢产物的主要原料。定义：凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称碳源。功能：提供能量的重要元素。碳源：糖（碳水化合物）、脂肪、有机酸、醇、碳氢化合物（烃类）1、碳水化合物（糖类）（1）单糖：葡萄糖（实验室培养基）所有的微生物都能利用葡萄糖；但是会引起葡萄糖效应；工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标；糖蜜：糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%75%。一般糖蜜

8、分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。（2）双糖：乳糖、麦芽糖、蔗糖（3）多糖：糊精、淀粉及其水解液，工业化过程常用淀粉水解物酶法水解为发酵糖。 （4）淀粉、糊精：使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类缺点：难利用、发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应2、脂肪：霉菌和放线菌利用油脂作碳源，其具有消沫和补充碳源的双重作用。3、无机酸、醇：在单细胞蛋白、氨基酸、维生素、抗生素发酵中作碳源和补充碳源

9、。4、碳氢化合物（烷烃）：微生物表面糖脂吸收系统乳化后利用碳。二、氮源（细菌、酵母菌氮含量大，霉菌含蛋量低，NH2基存在不提供能量）：指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。1、主要功能：构成微生物细胞和含氮的代谢产物，补充碳源，是细胞合成蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸及抗生素等重要代谢物成分。2、有机氮源（有碳有氮）：含有蛋白质、肽类、游离氨基酸、糖类、脂肪、无机盐、生长因子。微生物对这类氮源的利用具有选择性。土霉素生产中玉米浆和氨基酸的利用率增加；选择有机氮时要注意品种、产地、加工方法对质量的影响。3、有机氮源：氨基酸、蛋白质水解物及尿素。4、无机氮源（无碳有氮）：铵盐、硝酸盐及氨气、氯

10、化铵。5、实验室用培养基氮源：蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等蛋白水解物。6、工业化生产常用氮源：硫酸铵、尿素、氨水、黄豆粉、花生粉、鱼粉、棉籽粉、玉米浆、酒精水及屠宰场废水等。氮源使用的一些相关问题：有机氮源和无机氮源应当混合使用；早期：容易利用易同化的氮源无机氮源；中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质；有些产物会受氮源的诱导和阻遏例： 蛋白酶的生产有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力；开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴的课题；三、无机盐和微量元素1、定义：是微生物代谢所需的重要物质。2、功能：构成菌体成分，作为酶的辅基或激活剂，调节微生物体内氧化还原电位、pH值及维持渗透压。无机元

11、素对菌体生长的影响： 浓度降低促进生长；浓度提高抑制生长3、无机盐：磷酸、硫酸盐、氯化物、钠、钾、钙、镁、铁。4、微量元素：一般参与酶的组成或使酶活化。微量元素缺乏，导致细胞生理活性下降，甚至停止生长。 P：构成菌体核酸、核蛋白及磷脂成分，组成高能磷酸化合物及许多酶的活性基，参与氧化磷酸化反应必须元素。Fe：是细胞色素及其氧化酶的激活剂。Zn（脱氢酶）、Mg（糖化酶）、Co（B2辅酶 ）：是某些酶的辅酶或激活剂。Na：维持细胞渗透压。K：影响细胞膜透性。Ca：调节细胞透性作用。使用注意事项：1、对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑铁离子 青霉素发酵中，铁

12、离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理使用时注意盐的形式（pH的变化）黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，P对酶活的影响 pH 酶活不加 4.25 120分钟加 K2HPO4 5.45 30分钟加 KH2PO4 4.62 75分钟四、生长因子、消沫剂、前体和产物促进剂1、生长因子：微生物生长必需而少量的，自身不能合成或少量合成，以满足机体生长需要的有机化合物，如维生素。构成辅酶的组成部分，促进生命活动进行。如维生素B族是各种酶的活性基的组成部分，没有维生素B，E就不能活动。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长

13、因子。2、消沫剂：工业化生产中消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌，保证生产的正常运转。常用的消沫剂：植物油、动物油、高分子化合物。3、前体：在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质称为前体。前体可自身合成（缬氨酸、半胱氨酸青霉素合成时用）；外源性前体（苯乙酸青霉素G）青霉素：分子量356 苯乙酸:分子量136 作用：前体有助于提高产量和组份 用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率4、产物促进剂 所谓产物促进

14、剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。 促进剂提高产量的机制尚不清楚。 有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；五、水：是培养基的主要组成成分，是构成菌体细胞的主要成分，是营养物质传导介质。水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的，并且水直接参与代谢作用中的许多反应。对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及

15、矿物质组成和含量。对于酿造行业，水的重要性不言而喻。对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。六、 影响培养基质量的因素工业发酵过程中，生产水平波动大，菌体代谢异常等现象。1、原材料质量的影响2、水质的影响3、灭菌的影响4、其他影响因素 第三节 发酵培养基的设计和优化一、培养基成分选择的原则 菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导1000.22.0、合适的C、N比、pH的要求 二、培养基实验设计：培养基成分的含量最终都是通过实验获得的；合理的实验方法：多因子实验；多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等；在筛选培养基中使用的原材料种类和浓度配比时，经常采用的方法：单因子试验法、正

16、交试验设计和均匀试验设计。1、单因子试验法：适用培养基组成和单一营养成分的选择（费时，准确性低）2、均匀试验法：试验点均匀分散特点，实验组数与因素的水平数相同，试验结果分析采用计算机对试验数据进行多元回归系统处理，求得一回归方程定量预测最优的条件和结果，最佳培养基组成和浓度由菌种的生长情况、C/N代谢规律、pH值变化、产物合成速率决定。3、正交试验设计: 是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。三、培养基设计的步

17、骤 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑； 的问题，初步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分； 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。例1：类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化原培养基:初步确定可能的培养基成分（以碳源为例）通过单因子实验确定适宜的培养基成分（以碳源为例）考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源进一步：乙酸钠的浓度2%比较好结果：乙酸钠 0. 2%；氮源：氯化铵 0.2%； 酵母膏0.03%；无机盐: 复合无机盐0.05%例2：正交设计确定优化的配方例3： 发酵培养基

18、改进后培养基的发酵结果；摇瓶水平到反应器水平的优化配方；摇瓶、反应器培养基研究的两个层次；摇瓶培养基设计的第一步；反应器最终的优化的基础配方 第三章 工业发酵的染菌及灭菌第一节 发酵染菌的危害发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。所谓“杂菌”， 是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。一，染菌对不同品种发酵的影响青霉素；疫苗；柠檬酸；谷氨酸；肌苷、肌苷酸；酶制剂二，不同种类的杂菌对

19、发酵的影响青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大；链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大；四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大；柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌；肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大；谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体；高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大；三，不同染菌时间对发酵的影响种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌及发酵后期染菌。四，不同染菌途径对发酵的影响种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性；空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐；培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延

20、续性；设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大；五，染菌对产物提取和产品质量的影响对过滤的影响：发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加；造成的后果：过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率；对提取的影响有机溶剂萃取工艺：染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开。离子交换工艺：杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量。对产品质量的影响对内在质量的影响：染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。对产品的纯度有较大影响。对产品外观的影响：一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，

21、放置后会出现混浊，影响产品的外观。六，染菌对三废处理的影响使过滤后的废菌体无法利用；发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间第二节 发酵过程中染菌的检查判断一、染菌的检查与判断 目前生产上常用的杂菌检查方法有：显微镜检查：染色 ； 镜检平板划线检查：到平板空培养待测样品划线培养观察。酚红肉汤培养检查：无菌肉汤培养基空培养 接入样品 培养观察1、显微镜检查（镜检）：革兰氏染色法2、平板划线培养或斜面培养检查法3、肉汤培养检查法判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据无菌试验的目的：1，监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底；2，监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入；3，了解

22、整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角；二，各种检查方法的比较显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜检取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养（一般要过夜）才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确；三，杂菌检查中的问题检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据；平板划线和肉汤培养应做三个平行样；要定期取样；酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，确定为无菌时方可弃去；取样时防止外界杂菌混入的措施；表4-1四，发酵异常现象判断是否染菌 除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据以下

23、参数的异常变化来判断是否染菌溶解氧、pH值、尾气中CO2含量1、发酵异常现象判断是否染菌：溶解氧、pH、二氧化碳含量及菌体酶活力。溶氧浓度（谷氨酸发酵时）谷氨酸发酵时止常利J异常的溶解氧曲线正常发酵溶解氧曲线；异常发酵溶解氧曲线；一异常发酵光密度曲线发酵初期：菌体适应期溶氧浓度不变耗氧量 染好氧杂菌溶解氧接近于0发酵中期：菌体对数生长期溶氧浓度耗氧量 染厌氧杂菌溶解氧耗氧量发酵后期：菌体衰老期溶氧浓度耗氧量 2）二氧化碳的含量杂菌染菌糖耗二氧化碳含量；噬菌体染菌糖耗二氧化碳含量耗气性发酵排气中二氧化碳含量与糖代谢有关。第三节 发酵染菌和染菌原因分析一、发酵染菌率发酵染菌率：指一年内发酵染菌的批

24、数与总投料发酵批数之比。 总染菌率（一年内） = 发酵染菌批数 / 总投料批数 100%发酵染菌率以发酵罐染菌批（次）为基准，染菌罐批（次）应包括染菌重消后的重复染菌的罐批（次）在内。设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率，有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因。不同发酵阶段的染菌率：将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计其染菌率。有助于查找染菌的原因。季节染菌率：统计不同季节的染菌率，可以采取相应的措施制服染菌。操作染菌率：统计操作工的染菌率，分析染菌原因，考核操作工灭菌操作技术水平。二、发酵染菌和

25、染菌原因分析 避免在发酵生产中污染杂菌应以预防为主。“防重于治”，事前防止胜于事后挽救。 如果一旦发生染菌现象就要尽快找出原因及时纠正、堵塞漏洞才能减少损失，并从中吸取经验教训，避免以后有类似情况发生，保持生产的正常进行。但在发酵生产中，往往因为生产过程的环节很多，同时各工厂的生产设备、产品种类和管理措施不尽相同，引起染菌的原因比较复杂，有时不能及时找出而耽误了生产。1、国外一抗生素发酵染菌原因的分析 2、国内一制药厂发酵染菌原因的分析国外一抗生素发酵染菌原因的分析国内一制药厂发酵染菌原因的分析染菌原因百分率%种子带菌9.64蛇管穿孔5.89外界带入杂菌（取样、补料带入）8.20操作违反规程1

26、.60接种时罐压跌零0.19接种管穿孔0.39设备穿孔7.600.60培养基灭菌不透0.79阀门泄漏1.45空气系统带菌26.00原因不明35.0019.96罐盖漏1.54停电罐压跌零搅拌轴密封泄漏2.09其他设备漏10.13接种11.00泡沫冒顶0.48操作问题10.15蒸汽压力不够或蒸汽量不足夹套穿孔12.3624.91管理问题7.09 3，从染菌的规模幅度来分析染菌原因 大批（多个）发酵罐染同一种菌：空气系统问题 部分发酵罐（或罐组）染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的个别发酵罐连续染菌：设备问题（如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损），

27、设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。 4，从染菌的时间来分析发酵前期：种子、无菌空气 、培养基、设备灭菌不彻底、 接种操作不当、设备或管道有死角。中间补料、操作不合理问题、设备渗漏。5，从染菌的类型来分析浅绿色菌落（革兰氏阴性杆菌） ：发酵罐的冷却管、夹套渗漏或水污染。 耐热性芽孢杆菌：死角、培养基、设备灭菌不彻底。 球菌、酵母、不耐热无芽孢杆菌：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的、种子带菌、设备渗漏、操作问题。 霉菌：无菌室及灭菌不彻底或操作不严格问题第四节 发酵杂菌污染途径及防止一、种子带菌的原因及防止1、种子带菌原因问题培养基及用具灭菌不彻底，灭菌温度达不到要求。菌种在移接过程，操作和管理不当。菌种在培养过程