乳糖酶生产线设计终稿Word格式.docx

1、前乳糖酶原由位于氨基末端的信号肽域、前导肽域、胞外域、疏水的跨膜锚定区、羧基末段的胞内段组成，在信号肽引导下进入内质网通过一系列修饰，乳糖酶原进入高尔基体后被糖基化，然后经历细胞内和肠腔的2次裂解后形成成熟的乳糖酶。1.3 乳糖酶的应用1.3.1 在乳产品中的应用1.3.1.1 解决结晶咨询题 由于乳糖结晶在浓缩乳制品或者冷冻制品中往往造成产品的（砂状组织）缺陷，若在加工中添加20%30%的乳糖水解酶，不但能够防止结晶现象发生，还能够增加产品的甜度，减少蔗糖用量。1.3.1.2 发酵乳制品中的应用 用乳糖水解乳制造酸乳，能够缩短乳凝固时刻约15%20%，且由于乳酸菌生长快，菌数多，能延长酸乳的

2、货架期，产品黏度也较大，若水解程度较大时，甜度也增加。因此，在制作水果酸乳时不仅可减少糖的用量，而且水果的风味也会增强；用乳糖水解乳加工干酪时，可缩短凝乳时刻，并使凝块坚实，还可减少排除乳清时造成的缺失，产量可增加10%。1.3.1.3 作为替代添加剂 乳清和超滤乳清中的乳糖部分水解可增加产品的甜味，提升糖的溶解度。不同比例的葡萄糖和半乳糖混合物的甜度相当于蔗糖甜度的65%80%，溶解度增加 34倍，这种糖浆的总固形物含量达75%，可代替卵蛋白和蔗糖制作面包、饼干和蛋糕等，还可代替加糖浓缩牛乳制作牛乳软糖等，且可不能显现纹理、沙包、乳糖结晶和焦糖等现象。乳糖溶液经乳糖酶水解形成半乳糖和葡萄糖的

3、混合液，称为半乳糖葡萄糖糖浆。其甜度与等质量分数的蔗糖相近。可代替蔗糖用于各种点心、饮料、罐头食品及冰淇淋和雪糕的加工，成效专门好。1.3.1.4 低聚半乳糖的生产 低聚半乳糖是以牛乳中的乳糖为原料，经-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷键，生成半乳糖和葡萄糖，并通过转半乳糖苷的作用，将水解下来的半乳糖苷转移到乳糖分子生成的。低聚半乳糖具有较强的耐酸性、耐热性，可不能因为在加工过程中的高温杀菌及人体胃酸所分解而失去其本来应有的特性，而且能有效地被双歧杆B菌和乳酸杆A菌同时利用，因此低聚半乳糖的生产和应用也相当广泛，专门是在日本，随着人们越来越注重健康，低聚半乳糖将会有专门大市场。1.3.2 在医药领域

4、的应用乳糖酶可作为助消化类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如原发性乳糖酶缺乏，因胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生儿腹泻等，且对新生儿无毒害作用。用于治疗乳糖不耐受的乳糖酶药物还可与其他抗生素联用，与杜迪和思密达治疗轮状病毒肠炎能明显有效地缩短病程，疗效确切，治愈率高。此类药物可调整肠道正常菌群，拮抗轮状病毒，对肠黏膜上皮细胞损害有一定治疗成效。专门多药物中都含有乳糖酶，如乳糖酶冻干酵母制剂、酵母乳糖酶肠溶微囊制剂等。医学上乳糖氢呼吸检查被广泛用于诊断乳糖酶缺陷，最常见的是乳糖不耐受症状的诊断，Oberacher M 等通过3个呼吸实验讲明那个呼吸测试对乳糖酶缺陷具有良好的敏锐性和特异

5、性，呼吸实验能够简化但时刻无法缩短。研究发觉对乳糖的分解能力也可作为一些疾病发生风险的标志，实验测试者对乳制品食物消化后，双歧杆菌和大便乳酸菌的检测表明某些疾病的发生风险和乳制品食物的摄入有关。关于乳糖不耐受的治疗，用乳酸杆菌和半乳糖苷酶治疗乳糖不耐症的病人，通过氢呼吸实验的结果可知，乳酸杆菌和半乳糖苷酶都强烈提升胃肠道对乳糖的摄入吸取。由此可知益生菌关于乳糖不耐受治疗连续性较好1.3.3 乳糖酶基因在基因工程中的应用1.3.3.1 在载体构建中的应用 乳糖酶基因编码的产物水解底物 X-gal，可出现蓝色，易于检测和观看，在构建表达载体LacZ基因置于启动子下游，通过蓝白斑来选择阳性重组载体。

6、1.3.3.2 作为报告基因的应用 乳糖酶是一种常用的报告基因分子，经常与荧光素酶报告基因一起转染细胞，被用作荧光素酶报告基因检测的内参照，从而排除因为质粒的转染效率不同而带来的误差。汪国忠等以-galactosidase 质粒为报告基因，将其与自制氟碳气体微泡黏附，制备载基因微泡。利用诊断性超声破裂微泡进行体外心肌细胞基因转染，采纳原位染色及酶学定量检测 -galactosidase 表达水平，同时进行细胞活性检测。其作为报告基因还用于研究启动子的效能和启动子不同位点突变对表达效能的阻碍。陈晓月等为检测构建的枯草芽胞杆菌分泌表达载体pGPST 中启动子和信号肽的活性，将-半乳糖苷酶基因插入表

7、达载体的多克隆位点，构建含有-半乳糖苷酶基因的重组质粒 pGPST-lacZ。1.3.3.3 构建产乳糖酶基因工程菌利用基因工程技术，能够将活性高的乳糖酶基因导入易于培养、生产繁育迅速的微生物体内，从而降低乳糖酶生产成本。1.4 中国乳糖酶市场分析1.4.1 -半乳糖苷酶的市场情形随着科学技术的进展和人们对乳糖酶的进一步研究，乳糖酶的应用范畴越来越广，今后乳糖酶的应用就不仅仅局限于解决乳糖不耐受咨询题，还将在食品、医药、环保、基因治疗等各个领域发挥重要作用，具有宽敞的市场前景。由于近年来低温乳糖酶的研究成为热点，乳糖酶的生产成本也将大幅降低，乳糖酶的适应性也将提升。目前，研究人员也正在从我国冰

8、冷地区的土样中对低温乳糖酶产生菌株进行选择同时将克隆其基因到大肠埃希菌中表达，随着研究的深入，低温乳糖酶的工业化生产及其在各个方面的应用将会逐步实现。乳糖酶在乳品加工中的潜力远在上世纪初即为人们所知，但到50年代，人们对乳糖不耐受症的进一步认识才逐步被重视。60年代，由微生物中制取的乳糖酶商品化生产后，乳糖酶的应用才得以推广，关于乳糖酶的使用也得到了深入广泛的开展。1.4.1.1 解决乳糖酶缺乏者食用乳制品的咨询题 乳制品中的乳糖需经位于小肠严密上皮细胞的乳糖酶水解为半乳糖和葡萄糖后才能被集体吸取利用。集体乳糖酶缺乏可分为3类：（1）先天性乳糖酶缺乏，指出生时乳糖酶活性即低下或缺乏，这是一种罕

9、见的常染色体隐性遗传病；（2）继发性乳糖酶缺乏，指由于各种缘故致小肠上皮损害而导致的临时性的乳糖酶活性低下，常见病因如感染性腹泻、局限性回肠炎、免疫球蛋白缺乏症、营养不良等，多于机体疾病康复后复原正常；（3）原发性乳糖酶缺乏，是由于乳糖酶活性随年龄逐步降低而引起的，无其他阻碍，是最常见的一种乳糖酶缺乏，发生时刻因种族和地区不同而不同，有的在婴儿断乳后开始发生，有的20岁左右才开始显现，我国多发于7-8岁时发生。乳糖酶缺乏随不同国家，不同种族人群的变化而变化，亚洲6090%，澳大利亚白人06%，欧洲30%以上，非洲90100%，美国白人12%，黑人70%，日本人100%。3-13岁中国儿童乳糖酶

10、缺乏发生率为87%。食物中的乳糖进入小肠后，由于乳糖酶的缺乏，乳糖不能被分解为单糖而吸取进入血液，称为乳糖消化不良或乳糖吸取不良。1.4.2 酶制剂生产厂家的产销情形本项目通过对世界生化制剂公司的先驱Gist-brocade B.V，在食品营养价值、保健因子、食品风味、安全性、组织结构，延长保质期以及环保等方面的研究和生产情形的进行调查；另外，荷兰Gist-brocade B.V下三大公司（FIS）食品原辅料公司的乳制品原辅料部（FSD）和DIG，专门是DIG的产品差不多上差不多成为世界性的所有乳制品原料的提供商。另外哈尔冰美华生物技术股份有限公司的乳糖酶项目，自2002年来的运作概况，也做了

11、跟踪和调查，在本土生产此项目具有专门高的工业前景，效益专门高。1.4.3 国内市场需求推测我国是世界上牛奶产量增长最快的国家，今后几年的产量仍连续快速增长。据国家农业部统计，2001年全国奶牛存栏达687万头牛，牛奶宗长亮增加到1229万吨，液态奶产量355.14万吨。国家统计局数据显示，2005年2-12月，全国乳制品产量为1310万吨，较上年同比增长27.97百分点。世界人均牛乳年消费量94公斤，亚洲人均40公斤，我国人均24.89公斤，相差甚远，除了经济进展水平外，还有一个重要缘故，确实是我国人群中存在着乳糖消化不良、乳糖不耐症等，然而乳糖奶消费，在我国差不多上还属于空白。按照国际市场的

12、消费情形，低乳糖的开发提升了奶制品的消费量。从2005年2到12月，国内消费结构，酸奶消费增长，可能与新的消费增加有关。目前，2006年全国总奶产量在1500万吨，按生产百分之10 到百分之20 的低乳糖制品运算，每年的产量可达150到300万吨，以一公斤乳糖酶产品处理加工1吨乳制品估算，乳糖酶的年产量可达1500到3000吨。2015年需求量可达2000到4000吨。1.4.4 本产品更新的特点从理论上来讲，针对乳糖不耐症有多种方式，例如，添加乳酸杆菌发酵、工业再加工等，能在一定程度上解决该咨询题，但从节约和降低成本，以及工艺配套简便等角度来看，乳糖酶依旧最简便易行，从调查情形来看，该项目在

13、短时刻内还不存在专门有竞争力的替代产品。1.5 生产乳糖酶的一样方法1.5.1 利用胞外酶利用絮状酿酒酵母和黑曲霉中含有编码分泌胞外乳糖酶的LacA基因构建重组菌株，使重组酿酒酵母菌株能够分泌可高效利用乳糖的乳糖酶。Ibrahim 等使用化学诱变剂对两株双歧杆菌、乳植杆菌和嗜热链球菌进行诱变，选择高产菌株，长双歧的诱变菌株产酶量比野生型增加2倍多。为了获得高产菌株，新基因工程菌持续显现。生产酶的工程菌以大肠埃希菌、酵母菌为主，还有嗜热链球菌、乳杆菌等。1.5.2 利用胞内酶酶水解法，即利用外源性乳糖酶将乳糖降解为易被人体吸取利用的单糖。该法水解条件温顺、产物简单、口感可不能破坏牛乳中其他营养成

14、分，是目前乳制品加工中所采纳的好方法。EC 3.2.1.23通常被称为乳糖酶。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。1.6 乳糖酶生产的局限性和该项目乳糖酶的优点1.6.1 生产局限性1）乳糖酶的单位产量低；2）市场销售的乳糖酶多源于酵母，酶的耐热性差，适用范畴窄；3）且酵母来源的乳糖酶为胞内酶，需要破裂细胞才能得到，成本昂贵适用范畴窄，不能满足食品和乳制品工业多方面的需要。1.6.2 该项目乳糖酶的优点1）该项目的乳糖酶为胞外酶，不需要细胞破裂就能得到，提取纯化工艺简单，加工成本低。在水解牛奶的应用试验中，在不同的温度下，（6到60摄氏度中）不同时刻内均有较好的乳糖水解成效，水解率达百分之80到

15、百分之92。国外酵母来源具有较高质量的乳糖酶，在3740摄氏度，pH 6.6的条件下对牛乳中的乳糖水解率高。2）具有较好的机械强度，能够搅拌或装柱的方式下进行作用；3）可用于工业化生产，适应连续化、自动化生产 4）产物纯度高、副反应少、因此产率高；5）可反复使用，提升酶利用率，降低了生产成本；6）安全性好，幸免了想天然牛奶中添加外援物质，食品安全性高7）该乳糖酶与商业化的乳糖酶相比，在比活，pH稳固性，pH范畴、热稳固性、金属离子及化学试剂稳固性、Km上均具有优越性；8）与商业化酵母来源的乳糖酶相比，具pH适用范畴，热稳固性强等优点。该项目的酶具有优越的酶性质，使其应用在不同的乳制品加工中生产

16、多种类型的产品。生产过程具有良好的安全性，无抗药性标记，培养过程中不分泌有毒物质和热源。发酵工艺简单，培养基均为工业所适用的。1.6.3 项目综合评判结论本项目通过充分论证和市场调研，项目产品技术含量高，知识产权明晰、生产技术先进、符合国家和当地产业政策，项目产品有较宽敞的市场前景和丰厚的投资回报。项目投资估算合理，资金来源明确、资金预算科满足项目建设和运营的要求。拟建方案、建设条件、产品方案、工艺技术、经济效益、社会效应、等差不多完备，具有相当的可行性。1.7 -半乳糖苷酶的生产工艺1.7.1 生产工艺流程图图1-1 生产工艺流程图 1.7.2 项目技术路线图图1-2 项目技术路线图1.8

17、工厂组成企业采纳有限责任公司形式，下设生产部、质量治理部、研发部、修理部、化验部、化验室、以及各个车间1.8.1 生产车间由上游原料选择和处理（原料选择、上游处理、摇床培养、HPLC、补料发酵）、提取（过滤、脱色、干燥）、精制（蒸发浓缩、模拟移动床（SMB）色谱分离系统、储存）等组成。1.8.2 辅助车间废水处理、渣处理（副产品加工）、产品仓库、原料仓库、材料仓库、机修等。1.8.3 动力车间由锅炉房、变电所、空气处理系统。1.8.4 行管部门要紧办公室、中心实验室、汽车库、传达室等。1.9 厂址选择与建设条件1.9.1 厂址选择 项目建设的具体地点为南京浦口高新技术开发区。按照投资方与南京市

18、政府以及浦口区高新技术开发区治理委员会协商，并通过南京市设计院的初步勘查和测量，南京浦口区高新技术开发区将在该区内提供能够买足该项目的建设及后续生产经营的需要的土地。具体设计方案及图纸由*另行出具。1.9.2 建设条件1.9.2.1自然条件南京市位于11846 北纬:3203，属于亚热带温润季风区，年平均温度15.4C，年平均降水量1106毫米，气候宜人，景色秀丽。高新区地处长江三角洲，地势平坦，地质结构优良，地耐力达18-30吨/平方米，海拔高度50米左右。该区地层发育完整，储存较好。 由古中元古代之浅变质岩系（张八岭岩群、埤城岩群）组成基底。 新元古生代之南华纪至中生代三叠纪，由海相碳酸盐

19、岩和碎屑岩相间组成盖层，构成宁镇、茅山、宜兴等山脉，厚达万米以上，不整合于中元古代地层之上。其内部，各层间多为整合、或少数呈平行不整合接触。中生代中三叠世至中侏罗世由内陆河、湖相碎屑岩组成，厚度变化较大（05000米），平行不整合不整合于老地层之上。中生代晚侏罗世至白堊纪，则为陆相火山喷发重要时期，由红色碎屑岩间大量中、酸性火山岩组成，分布局限，厚度变化极大，厚者可达万米。与下伏地层为平行不整合接触、整合接触或不整合接触。新生代之古近纪新近纪，该区仍处陆相环境，形成杂色碎屑岩，夹基性火山岩堆积，以苏北盆地为发育，厚可达数千米。不整合于前第三纪地层之上。该区，前第四纪岩石地层，自下至上共分61个

20、单位，包括4个群、51个组、2个段、相当段级4个。厂址所在区域，地势平坦，地质结构优良，无不适合项目建设之缺陷。1.9.2.2 基础设施条件厂址地处南京市区北部，在京沪高铁和京沪高速途经之处，南京东依上海，本身又是江苏省会，全国排名前十的都市，位置优越，交通便利。1.9.2.3所处地区的要紧经济情形南京的工业以电子信息、石油化工、汽车机械、生物制药、食品饮料、仪器外表等产业占有重要地位。2008年规模以上工业总产值6472.23亿元。最新评定，制造业“十大强市”南京列第一。排行榜中，南京的都市制造业经济制造能力排名为第六，科技创新能力排名为第一，环境资源爱护能力排名为第五。1.9.2.4社会经

21、济条件2008年，南京市实现消费品零售总额1651.82亿元。南京的要紧商业区有新街口、湖南路、夫子庙、珠江路等。新街口位于南京市中心，在民国时期进展为商业区，目前集中了大批大型店铺。湖南路位于鼓楼区，要紧是1990年代以后兴起的新商业区。夫子庙位于秦淮区，是南京最古老的传统商业区之一，自1985年起连续改建为仿古街市，以餐饮娱乐为特色。珠江路位于玄武区并为区政府所在地，是华东地区规模最大的IT产品集散地之一。2008年度，全市实现旅行总收入714.3亿元人民币。2004年末，全市拥有4A级旅行景点5个，旅行星级宾馆饭店113家，其中五星级宾馆8家，各类旅行社三百余家，其中从事国际旅行业务的旅

22、行社27家。南京市也是中国评出的第一批优秀旅行都市之一。1.9.2.5 原材料及要紧辅助材料供应本产品的原材料、要紧辅助材料，要紧是农副产品和无机化学原料等。所有这些消耗品的市场供应均十分便利，在当地可提供。1.9.2.6 燃料动力及其他公共设施的供应本项目在浦口高新技术开发区实施，交通便利，开发区配套企业提供包括水、点、热、燃气等有关的生产所需，保证满足项目建设和投产后的生产经营和生活的需求。第二章 生产工艺2.1 乳糖酶生产工艺利用毕赤酵母系统表达有生物活性的乳糖酶，使得乳糖酶高效分泌到细胞外，而无需破裂细胞来提取，降低了乳糖酶的生产成本，简化了生产工艺，具体如下：采纳30 m3容积的发酵

23、罐进行生产，需要三级发酵，将摇瓶培养的种子按1：10的比例接入一级种子罐，由一级种子罐再接入二级种子罐，再接入30 m3容积的发酵罐中好氧发酵，发酵过程中适时补料，监控菌体生长、产酶情形，防止污染。待发酵终止后，放罐，将菌体与发酵液分离，通过分离纯化获得酶制剂产品。流程图如图1所示：图2-1 乳糖酶生产工艺流程图2.1.1 原料取大麦和小麦若干，用水洗净，浸泡612小时，置于15阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每晚早、中、晚淋水一次，麦根延长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。具体工艺流程：麦芽谷物粉碎 蒸煮糖化静置冷却麦芽液过滤调剂pH 粉碎：麦芽的粉碎方法：采纳干法粉碎法，将

24、麦芽投进辊式粉碎机进行粉碎2.1.2 蒸汽喷射液化 喷射液化法液化平均，完全且连续化生产。此液化法要紧受到蒸汽方面的阻碍, ，蒸汽的高低直截了当阻碍液化进料的速度, 从而阻碍质量及产量。将粉碎的麦芽粉加进喷射液化器，通过高温喷射液化成糖。2.1.3 过滤 板框式压滤机是由容钠糖化醪的框和分离麦汁的滤布及收集麦汁的滤板各若干组组成过滤元件，再配以顶板、支架、压紧螺杆或液压系统组成。2.1.4 连续灭菌将配制好的培养基用泵连续输入由直截了当蒸汽加热的加热器，使其在短时刻内达到灭菌温度130。然后进入坚持罐，使在灭菌温度下坚持57分钟后再进入冷却罐，使其冷却至接种温度30并直截了当进入已事先灭菌（空

25、罐灭菌）过的种子罐和发酵罐内。要紧设备：加热器、坚持罐、冷却罐2.2 发酵车间2.2.1 菌种处理工段2.2.1.1培养基的制备毕赤酵母在试验室培养时期一样多采纳米曲汁或麦芽汁来做培养基。由于其中含有丰富的碳、氮及其它营养物质，专门适宜于酵母菌繁育。将市售麦芽磨碎后，加水，于5560糖化4小时，再过滤，将滤液浓度调整为l012Bx。如果要制作固体培养基时，可加入2 的琼脂，溶化后分装试管，灭菌后取出斜放，待冷凝后，于30培养两天，观看有无杂茵生长，如无，就能够做接种用。采纳平板划线法接种。麦芽汁的pH值一样可操纵在44.5左右，如果太高，可用H2SO4或磷酸调整。2.2.1.2 实验室扩大培养

26、流程毕赤酵母活化斜面试管一级种子培养二级种子培养2.2.1.2.1 毕赤酵母活化应先将菌体接入新奇斜面试管进行活化，以便酵母菌处于旺盛的生活状态。在无菌条件将原菌下接人新奇斜面试管，于28-30保温培养3-4天，待斜面上长出白色菌苔，即培养成熟，培养基为：葡萄糖、酵母粉、琼脂糖。2.2.1.2.2 三角瓶培养采纳三角瓶培养，可视其容量选用不同的培养基。如用250毫升小三角瓶，可装入l00 ml米曲汁，如3000 ml大三角瓶，则可装入米曲汁和通过过滤的酒母糖化醪各500 ml，经灭菌后备用。2.2.1.2.3 一级种子培养采纳卡氏罐培养，卡氏罐培养基可使用酵母糖化醪，以使毕赤酵母逐步适应大生产

27、培养条件。卡氏罐用的糖化醪应单独杀菌后备用，如果工厂卫生治理条件较好，也可不杀菌。2.2.1.2.4 二级种子培养将一级种子罐的种子转移的二级种子罐培养。2.2.2 发酵罐发酵2.2.2.1发酵工艺流程发酵过程采纳流加操作（补料分批式操作），是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加一种或多种成分的新奇培养基的培养方法，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方式，是一种操纵发酵的好方法，现已广泛用于发酵工业。在培养过程中持续补加浓麦芽汁,使得在整个培养过程中培养液保持较低的糖的质量浓度。采纳此方法,既可获得较高的酵母得率,又可获得高的酵母浓度。甲醇也是碳源，流加甲醇时，菌体以甲醇为碳源诱导表达外源

28、蛋白。由于过高浓度的甲醇抑制细胞的生长和产物的表达，因此通过合适的策略操纵甲醇的流加是提升外源蛋白表达量的关键。流加氨水能够调剂pH，同时提供氮源。2.2.2.2培养温度的操纵酵母菌在适宜生长温度范畴内，高温比低温繁育稍快。但高温培养酵母易于衰老。酒精生产中酒母培养温度为2830。由于酵母菌在生长代谢过程中还要产生一定热量，故应注意加大冷却，以保证酵母菌健壮生长。2.2.2.3 pH操纵糖化完成后可适当加大风量使发酵进入旺盛产酸期。在产酸期内操纵风量使产酸速率坚持在2-3 g/hL，不得过快，以进一步利用糖化作用和防止菌体过早衰老。2.2.2.4 选择通风培养毕赤酵母在生长繁育过程中需要消耗大量能量，这种能量来源要紧是靠葡萄糖的有氧分解来获得。因此，在有氧条件下培养酵母菌，利用能量高，糖分消耗少，在酵母培养过程中通入适量的无菌空气，对酵母繁育是有利的。在实际流加培养过程中，前期应操纵较低的搅拌转速（600 r/min）以提供较低的kLa值，如此迟滞期可相对缩短；在对数生长期后期应迅速增大搅拌转速（提升到1200 r/min），4 kLa值达到800（1/h）以上，以满足细胞快速生长对溶氧的要求，提升产率；在培养末期应调剂搅拌转速至800 r/min左右。2.3 分离车间2.3.1 过滤过滤采纳板框压滤机进行过滤，将发酵好的发酵液加进板框