第一章植物组织培养的基础理论与基本知识doc文档格式.docx

1、2.器官培养将植物的器官如胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织接种在无菌培养基上进行培养，也称为植物离体培养。例如马铃薯、兰花、丽格海棠。3.离体胚培养将分化过程中成熟或未成熟的胚取出进行培养。4.细胞培养将外植体接种在人工培养基上，由于植物生长调节剂的存在，而其细胞脱分化形成愈伤组织，然后通过再分化形成再生植株。它是最为常见的。5.原生质体培养 原生质体培养是指将植物细胞的细胞壁通过机械、物理或化学的方法去除，然后再进行培养。70年代以后有关植物原生质体培养和体细胞杂交的研究得到了很诀发展，如烟草、曼陀罗、颠茄、胡萝卜、油菜等能从其原生质体经培养再生分化长成胚或完整的植物，利

2、用原生质体融合已经能使烟草属和矮牵牛属的杂种细胞增殖分化成杂种植株。6.基因转化植物基因工程是指利用重组DNA、细胞组织培养等技术，将外源基因导入植物细胞或组织，使遗传物质定向重组，从而改良植物性状，培育优质高产的植物新品种。自1983年世界第一株转基因烟草诞生至今，二十多年的植物基因转化实践证明，外源基因可以通过不同的转化方法进入植物基因组进而整合并表达，迄今获得成功转化的植物已超过120种。随着转基因技术在作物品种改良、抗病虫害育种和植物医药工程等领域的广泛应用。第二节 植物组织培养的生理依据一、植物细胞全能性细胞全能性（cell totipotency）：植物体的每一个细胞都携带有一套完

3、整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。1.细胞全能性的认识过程 1902年，德国植物学家Haberlandt在自然界再生作用的启迪下，提出假说。 1958年，由Steward等人证明：胡萝卜细胞（一小块愈伤组织）在适宜的条件下（液体悬浮培养）下会形成体细胞胚（胚状体），其发育阶段与合子胚相似，最后形成小植株。此后又证实了胡萝卜单一的细胞（不必依赖于其他细胞的参与）亦具有这种能力。Mature plant Root cells culture Cultured cells Cells in culture divide to form embryoid bodies Torpedo st

4、age Cotyledonary stage is planted Plantlet forms roots Mature plant2.植物细胞全能性的概念： 植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下如同受精卵一样，具有发育成完整植物体的潜在能力。两个含义：1）植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息。2）每个植物细胞均具有发育成完整植物体的潜在能力。 为什么植物细胞具有“全能性”，而动物细胞不表现“全能性”呢可能与动物、植物在营养需要、代谢类型和发育方式上的不同有着密切的关系。（1）动物、植物在营养需要上的不同植物是自养的，可以进行光合作用，还可以选择性吸收各

5、种无机营养和水分。动物所需要的养分和水分，完全是由外界供给的。植物是自养的，它仅要求简单的无机营养并可通过自身的光合作用制造有机营养。动物除要求无机营养外，还要求供给复杂的大分子有机营养。（2）动物、植物的代谢类型不同植物养分及水分的吸收和运输，依靠简单的输导组织，运往身体各个部位，由韧皮部将光合产物运往植物体内各个部位。动物摄入各种有机、无机营养和水分后，要通过各种复杂的系统送往全身。植物可以吸收稀薄的养分，进行自身浓缩来满足植物体生长发育的需要。动物是在浓缩的环境中生活，不满足这种条件，动物的生长发育就会受到影响。（3）动物、植物发育方式的不同植物具有顶端分生组织和次生分生组织。因此，植物

6、器官的建成，可以多次重复，是无限的。动物器官建成是在发育的早期阶段，一次发育形成不能重复。植物胚胎是通过胚柄与母体相连，通过胚柄吸收营养，同时还通过吸收胚乳的营养来发育。动物胚胎是通过胎盘与母体相连，通过血液循环吸收营养。二、植物细胞分化和脱分化1.植物细胞的分化 细胞分化现象普遍存在于植物界。 细胞分化：由于细胞的分工而导致的细胞结构和功能的改变，或发育方式永久性改变的过程。细胞分化的结果：导致形态发生，从而形成不同器官，不同器官又执行着不同功能。根结构：表皮细胞排列整齐，没有细胞间隙，形状扁 平，细胞壁薄，不具有叶绿体；功能是选择无机营养和水分。叶结构：表皮细胞外壁，由一层脂肪性物质组成的

7、角质层所覆盖；气孔由一对新月型细胞构成，叶肉细胞位于表皮和皮层之间，排列整齐，细胞内含由叶绿体；功能是进行光合作用，合成有机营养.细胞的结构和功能的不同或发育方式的不同，从而产生分工的不同。 分子遗传学观念如何解释细胞分化 植物个体发育的过程，表现为染色体上的不同基因，按一定顺序，选择性活化和阻遏。由于不同基因活化的结果，表现为合成不同的酶和蛋白质分子。即，当同一个基因型的细胞合成不同酶和蛋白质时，即出现细胞的分化。2.植物细胞的脱分化和再分化脱分化：失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团即愈伤组织的现象。再分化：由无分化的愈伤组织的细胞再转变成为具有一定结构，执行一

8、定生理功能的细胞团和组织，构成一个完整的植物体或植物器官的现象。三、细胞再分化和形态（器官、胚）建成1.再分化实现途径一种是胚胎发生形成双极性的胚状体；另一种是器官发生，形成单极性的芽或根，进一步发育成完整植物体的过程。再分化脱分化离体的植物器官、组织、细胞 愈伤组织 根、芽 植株胚状体游离单细胞或原生质体人工种子 胚状体植株胚状体：对应于种子胚而言。在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结2.植物细胞脱分化和再分化的条件1）植物细胞的机械隔离和生理隔离 由切割而造成的机械和生理隔离对细胞脱分化、再分化是十分重要的，也可以说是植物细胞全能性表现的重要措施。2）植

9、物激素的作用植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、脱落酸、乙烯等生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强弱为2,4-DNAAIBAIAA。细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。常用的有Zip、KT、6-BA、ZT等作用强弱顺序为。ZipKT6-BAZT。赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为GA3。植物激素与植物细胞的再分化：生长素与细胞分裂素的配比创伤和外源激素可以改变分生细胞的遗传信息： 使形成

10、层细胞（分生细胞）改变了控制细胞分化的遗传信息，从而改变了代谢路线，使形成层细胞朝着“胚性细胞”的发现分化。第三节 植物组织培养的意义及应用一、植物组织培养的意义 在生产应用上和理论研究上，具有十分重要的意义。组织培养是本世纪发展起来的一门新技术，由于科学技术的进步，尤其是外源激素的应用，使组织培养不仅从理论上为相关学科提出了可靠的实验证据，而且一跃成为一种大规模、批量工厂化生产种苗的新方法，并在生产上越来越得到广泛的应用。二、植物组织培养的特点1.研究材料单一，无性系遗传信息相同；2.经济方便，效率高；3.培养条件可控，可周年实验或生产；组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基质和小气

11、候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。4.生长快，周期短，重复性强；植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30d为一个周期。所以，虽然植物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗或脱病毒种苗。5.管理方便，利于自动化生产。植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高

12、密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。三、植物组织培养在农业中的应用植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位以外，还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。1.优良品种的快速繁殖用植物组织培养的方法进行快速繁殖（rapidpropagation）是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。快速繁殖

13、可用下列手段进行：通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。试管快速繁殖应用在下列生产或研究中：（1）繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系等。（2）繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。（3）繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。组织培养突出的优点是“快”，通过这一方法在较短时期内迅速扩大植物的数量，以一个茎尖或一小块叶片为基数，经组织培养一年内可增殖到10000100000株。2.植

14、物茎尖脱毒及脱毒苗的再繁育植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重，甚至会造成极严重的后果。自从Morell952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗（virus free）后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用，如马铃薯，甘薯，草莓，苹果，香石竹，菊花等。而且已有不少地区建立了无

15、病毒苗的生产中心，这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个规范的系统程序，从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。3.体细胞无性系变异和新品种培育植物组织培养过程中往往存在大量的变异，这种变异称为体细胞无性系变异。具有如下特点：1.变异的无方向性：既有有利的变异，也有有害的变异既有形态变异，也有生理变异。2.变异的普遍性：变异在组织培养中经常发生，出现在组织培养的各个时期。既有数量性状变异，又有质量性状变异。既有农艺性状变异，又有经济性状变异；既有表型变异，又有生理变异。与自然变异与辐身诱变相比，体细胞无性系变异广泛而普遍。且易于获得纯合个体。3.植物体细胞无性

16、系变异的类型：一类为可遗传变异，主要是由于遗传物质的变化引起的（尤以基因突变为主）。另一类是不可遗传的变异，为生理型变异。往往是由于培养过程中外加的激素及其它化学物质的刺激引起。如叶形、育性等。4.引起植物体细胞无性系变异的原因：激素的刺激为主要原因。高浓度的GA和IAA，会造成畸形胚的高频发生，TDZ可使植株产生白化苗或玻璃化植株。2，4-D则使培养细胞发生染色体数量变化。随培养时间的延长，染色体变异频率升高，变异的性状和范围手扩大。5.植物体细胞无性系变异的利用价值及途径：它是一种重要的遗传变异来源，是一种重要的遗传资源。对于育种有重要的应用价值。 单倍体育种花药、花粉的培养在苹果、柑橘、

17、葡萄、草莓、石刁柏、甜椒、甘蓝、天竺葵等约20种园艺植物得到了单倍体植株。在常规育种中为得到纯系材料要经过多代自交，而单倍体育种，经染色体加倍后可以迅速获得纯合的二倍体，大大缩短了育种的世代和年限。4.基因工程应用基因工程，就是用改变生物遗传的方法，获得新的遗传个体，从而改变物种或产生新物种。按照人们预先设计的蓝图，定向培育新物种以及所希望的性状或新的功能。转基因生物就是将外源基因转入动物或植物，使其表达出原来没有的某种新性状，由此而得到的新型生物便称为转基因动物或转基因植物。动物转基因重组初显端倪。中国科学家已成功地通过外源基因移植，将牛、羊的生长激素基因导入鲤鱼的受精卵中，获得第一代转基因

18、鱼。在此基础上，又将从大马哈鱼中提取的生长激素基因导入鲤鱼，培育出世界上第一代“全鱼转基因鱼”。其生长速度比普通鲤鱼要快好几倍，而且体躯很大，滋味鲜美。世界科学家已在54种植物中试验转基因成功。粮食作物如水稻、玉米、马铃薯，经济作物如棉花、大豆、油菜、亚麻等蔬菜作物如番茄、黄瓜、芥菜等；并且成功地将抗病毒、抗虫害、抗除草剂等有实用价值的基因转入部分农作物。细胞工程是将一种生物细胞中携带遗传信息的细胞核或染色体整个地转移给另一种生物细胞，使新细胞产生具有人们所需要的新功能，从而改变体细胞的遗传性状，广义地讲，也包括细胞核和卵移植、动物和植物组织培养技术等。美国科学家采用细胞融合技术将番茄和马铃薯

19、的细胞融合在一起，培育出称之为“番茄薯”或“薯番茄”的新型植物。植株地上部结番茄，地下部生长根茎，产量高，品质好。获得成功的属间体细胞杂种植物还有：烟草大豆、甘蔗高粱、芥菜紫芸苦等，这些属间杂种采用有性杂交的方法是难以得到的。中国科学家利用细胞融合技术已培育出普通烟草与黄花烟草、普通烟草与粉蓝烟草、烟草与矮牵牛、烟草与天仙子等种间和属间体细胞杂种植株，为远缘杂交育种开辟了新途径。5.种质保存用植物组织培养技术保存种质具有以下优点：（1）在较小的空间内可以保存大量的种质资源。（2）具有较高的繁殖系数。（3）避免外界不利气候及其他栽培因素的影响，可常年进行保存。（4）不爱昆虫、病毒和其他病原体的影

20、响。（5）有利于国际间的种质交换与交流。四、植物组织培养在化工业、医药业的应用 运用组织培养方法可以在比较简单易观察的条件下研究细胞、组织或器官的繁殖、生长和分化，以及各种外界因素对它们的影响，从而为解决农业生产和药物生产中的某些问题开辟了广阔的前景，目前已有若干重要成果应用于生产实践中，一为营养繁殖系的快速繁殖，如以甘蔗为例，原来每亩要用蔗种0.51吨，用组织培养快速繁殖的幼苗进行栽培可节省大量蔗种。又如贝母繁殖率非常低，而用组织培养分化出的三个月左右的鳞茎，其大小就相当于用种子繁殖二年生的鳞茎，另一为药物和生物制品的工业生产，药用植物的有效成分一般都从植物体提得，其产量和质量难免要受到植物

21、的遗传性、生长条件、收获时间及贮藏和运输等因素所影响，如果能采用类似培养微生物产生抗菌素的方法生产有效成分，就可克服这些缺点，这对生长条件要求严格、生长缓慢、产量低、价值贵重的植物药更有意义。如近年来已大量培养人参组织，并提取有效成分，因此利用组织培养生产药用成分，探索天然药物生产工业化的途径是当前药物生产的一个新方向，随着大规模人工培养技术的成功，就有可能用组织培养法来代替全植物提取有效成分，这项工作将是未来研究植物药的中心课题之一。目前中国有关单位已成功地将麦角菌、灵芝、猴头菇等真菌进行工业化生产，高等植物组织培养在工业化中的应用也正在研究。总之，植物组织培养这一新技术在中草药方面应用的前

22、途是无限广阔的，它不仅有利于探讨和阐明药用植物生理、遗传和成分生物合成等一系列理论问题，而且一旦工业化生产问题得到解决，将可以为防病治病做出很大的贡献。第四节 植物组织培养的发展概况及展望一、植物组织培养发展概况植物组织培养的研究可以追溯到20世纪初期，根据其发展情况，大体可以分为三个时期。1.萌芽阶段 组织培养技术的蓬勃发展只是近50年的事，但它的整个历史可以追溯至19世纪末和上世纪初。20世纪初，在Schleiden和Schwann所发展起来的细胞学说的推动下，1902年德国植物学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点，以及植物细胞全能性的理论，即植物的体细胞

23、，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。1904年E Haming进行胚培养并发表了第一篇胚培养论文，萝卜未成熟的胚可以发育完整植株。1908年 S Kimcn 白杨嫩芽、茎培养愈伤组织发生和根芽的形成。1912年，Habefiandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。Robins用含无机盐、葡萄糖或果糖的琼脂培养基，培养了长度为1.453.75cm的豌豆、玉米和棉花的茎尖，形成了一些缺绿的茎和根。1922年 W Kot

24、t进行豌豆和玉米的茎尖培养。 1925年Laibach将亚麻种间杂交不成活的胚取出培养，使杂交胚成熟，继而萌发。2.技术和理论的发展时期（20世纪30年代初50年代末） 生长素的发现，在植物组培的利用，推动植物组培向前发展，并取得成熟。自Haberlandt的实验之后，直到1934年美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。这之后，White又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，

25、其成分均为已知化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。与此同时，Gautherer（1934）在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织， Nobecourt由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。后来，White于1943年发表了植物组织培养手册专著

26、，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。40年代Skoog和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即这一比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化。在寻找促进细胞分裂的物质过程中，Miller等人于1956年发现了激动素。不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。结果上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展。1952年；Morel和Martin通过

27、茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株。19351945年Muir把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。1948年 SKoog和崔澄确定腺嘌呤与生长素的比值是控制根、芽形成的重要条件。 1952年 法国 Morel获得去病毒大丽花植株。 1953年Muir用烟草的愈伤组织产生了单细胞和小细胞群，并可继代繁殖。 1955年，Miller和SKoog发现了激动素（KT）可代替腺嘌呤和生长素控制根芽的分化。 1958年英国 Steward将胡萝卜髓细胞通过体细胞胚胎发生途径培养成为完整植株。同年M.

28、Wickson发现外源细胞分裂素可使休眠的侧芽启动，长成完整植株。3.快速发展和应用阶段（60年代初现在）1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者做出了重要贡献。1962年印度Guha等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究。1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，其

29、繁殖系数极高。由于这一方法有很大的应用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。1973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。1962年 印度 K.kanta开创植物试管受精技术。1964年 印度Guha和Maheshwari成功的培养蔓陀罗花药获得单倍体再生植株。1971年，Takebe 等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。1972年，Carlson 等通过两个烟草物种（粉蓝烟草长花烟草）原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。1973年在英国成立国际植物组织培养协会（IAPTC），现更名