实验一还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法.docx

1、实验一还原糖和总糖的测定35二硝基水杨酸比色法生物化学实验指导书适用专业：生物科学、食品科学、生物工程、农学、园艺、环境科学孝感学院生命科学与技术学院 生物化学实验细则 为了保证生物化学实验的顺利进行， 培养同学们掌握良好、 规范的生物化学基本实验技能， 特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。 1. 实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。 2. 严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本实验组的同学不准进入实验室。 3. 进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台后，保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实验台随便走动。绝对禁止用实验仪器或药物嬉耍。 4.

2、实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。 5. 实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。 6. 使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。 7. 做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。 8. 实验后，要及时完成实验报告。目 录实验一 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法实验二 油脂酸价的测定实验三 蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)实验四 淀粉酶活力的测定实验五酶的激活和抑制作用实验六 氨基酸的分离鉴

3、定纸层析法实验七 基因组DNA的快速提取-碘化钾法实验八 琼脂糖凝胶电泳技术DNA样品检测实验一 还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖

4、含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料小麦面粉(1000 g) 2主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20 mL11 （2） 滤纸 （3）烧杯：100 mL2 （4）三角瓶：100 mL1 （5）容量瓶：100 mL3 （6）刻度吸管：

5、1mL1；2 mL2；10 mL1 （7）恒温水浴锅 （8）煤气炉 （9）漏斗 （10）天平 （11）分光光度计3 试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘

6、和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。（5） 6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分别取59.19 mL 37%浓盐酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步骤1. 制作葡萄糖标准曲线取7支20 mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作管 号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值 （OD540nm）0021.5010.21.8

7、1.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540 nm，用0号管调零点，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。光密度值葡萄糖标准曲线葡萄糖含量（mg）2. 样品中还原糖和总糖的测定（1）还原糖的提取准确称取3.00 g食用面粉，放入100 mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50 mL蒸馏水，搅匀，置

8、于50恒温水浴中保温20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在100 mL的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。（2）总糖的水解和提取准确称取1.00 g食用面粉，放入100 mL三角瓶中，加15 mL蒸馏水及10 mL 6 M HCl，置沸水浴中加热水解30 min, 取出12滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6 mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100 mL，过滤取滤液10 mL于100 mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于

9、总糖测定。（3）显色和比色取4支20 mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5 min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20 mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540 nm，用0号管调零点，测出710号管的光密度值。表2 样品还原糖测定管 号还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）光密度值（OD540nm）查曲线葡萄糖量（mg）平均值70.51.51.580.51.51.59111.510111.5五、结果与计算计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的葡

10、萄糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量(以葡萄糖计)。还原糖（%）=查曲线所得葡萄糖毫克数 提取液总体积测定时取用体积100样品毫克数总糖（%）=查曲线所得水解后葡萄糖毫克数稀释倍数0.9100样品毫克数六、注意1. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。2. 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题1.在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？而在其测定前，叉为何要用NaOH中和？2.标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？比色时设0号管有什么意义？3. 绘制标准曲线的目的是什么？实验二 油脂酸价的测定一、

11、目的与要求 初步掌握测定油脂酸价的原理和方法；了解测定油脂酸价的意义。 二、实验原理 油脂在空气中暴露过久，部分油脂会被水解产生游离脂肪酸和醛等物质，并且这些物质具有刺激性气味，使油脂产生酸价。酸败的程度使以水解产生的游离脂肪酸的多少为指标的，常以酸价或者是酸值来表示。同一油脂若酸价高，则说明水解产生的游离脂肪酸就多。酸价是指中和1g油脂中游离脂肪酸所需的氢氧化钾的毫克数。酸价越高，油脂的质量也越差。三、主要仪器、实验材料和试剂1. 锥形瓶（250 mL）3个。 2. 量筒（50 mL）1支。3. 碱式滴定管1支。4. 花生油、菜油、芝麻油等。5. 乙醇-乙醚混合液(1:1,V/V)。6. 0

12、.1 KOH（1克KOH溶于1000 mL纯水中）。四、操作步骤1. 准确称取12 g油脂于250 mL锥形瓶中。2. 在瓶内加入乙醇乙醚混合液50 mL，充分振荡，使油脂样品完全溶解成透明溶液。待油样完全溶解后，加入1酚酞指示剂35滴，立即用0.1 KOH标准溶液滴定至溶液成微红色（放置30 S内不褪色）为终点，并记录用去的KOH的体积，并按下式进行计算。酸价2(V2-V1)/W V2 ：滴定油样时耗用氢氧化钾溶液的毫升数 V1 ：滴定空白对照耗用氢氧化钾溶液的毫升数 W：油样重(g)注：滴定过程中如出现混浊或分层，表明由碱液带进水过多，乙醇量不足以使乙醚与碱溶液互溶。一旦出现此现象，可补加

13、乙醇，促使均一相体系的形成。 五、实验结果油脂名称起始刻度终点刻度体积 （ mL）酸价备注空白对照六、思考题测定油脂酸价时，装油的锥形瓶和油样中均不得混有无机酸，这是为什么？ 实验三 蛋白质的提取及浓度测定(紫外吸收法)一、目的与要求掌握蛋白质的提取方法；学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。二、实验原理大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm波长处

14、。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD280nm与其浓度呈正比关系，可作定量测定。三、实验材料、主要仪器和试剂1. 试验材料：萌发3天的小麦种子 2. 主要仪器（1）紫外分光光度计，（2）离心机（3）试管与试管架，（4）刻度吸量管 （5）研钵 （6）100 mL容量瓶3试剂：标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/ mL（0.5克标准牛血清蛋白纯水定容至500 mL）的溶液。四、操作步骤1蛋白质（淀粉酶）的提取称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残

15、渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取1520 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3,000 r/min转速下离心10min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为蛋白质原液，用于蛋白质浓度的测定。2. 标准曲线制作按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在280 nm波长处测定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。表1 蛋白质标准曲线制作管号标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280nm104020.53.50.12531.03.00.2541.5

16、2.50.37552.02.00.5062.51.50.62573.01.00.7584.001.03.样品测定取提取的蛋白质溶液，按上述方法测定280 nm的光密度，并从标准工作曲线上查出提取蛋白质溶液的浓度。若提取蛋白质溶液的浓度大于2.0，超出测量范围，则稀释后再测，计算蛋白质浓度时乘以稀释倍数。蛋白质浓度=五、思考题1. 为何要在280 nm波长下测定蛋白质浓度？2. 如果考虑核酸的存在，蛋白质浓度的实际的值比测量值是大还是小？为什么？ 实验四 淀粉酶活力的测定一、目的与要求学习和掌握测定淀粉酶（包括-淀粉酶和-淀粉酶）活力的原理和方法。二、实验原理淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和

17、动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶两种。-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的

18、麦芽糖的量表示酶活力。淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在7015min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化-淀粉酶，测出-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（-淀粉酶活力+-淀粉酶活力），再减去-淀粉酶的活力，就可求出-淀粉酶的活力。三、实验材料、主要仪器和试剂1. 实验材料萌发的小麦种子（芽长约1cm）2. 仪器（1）离心机（2）离心管（3）研钵（4）电炉（5）容量瓶：5

19、0mL1, 100 mL1（6）恒温水浴（7）20mL具塞刻度试管13（8）试管架（9）刻度吸管：2 mL3, 1 mL2, 10 mL1 （10）分光光度计3. 试剂（均为分析纯）（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20 mL 2 mol/L NaOH溶液中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液 A液：（0.1mol/L

20、 柠檬酸）：称取C6H8O7H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O72H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。四、操作步骤1. 麦芽糖标准曲线的制作取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：表1 麦芽糖标准曲线制作试 剂管 号1234567麦芽糖标准液（mL）00.20.61.01.41.82.0蒸馏水（mL）2.01.81.41.00.60

21、.20麦芽糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.03,5-二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0吸光度值摇匀，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20 mL。以1号管作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。2. 淀粉酶液的制备称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1 cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取1520 min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/m

22、in转速下离心10min，将上清液倒入100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于-淀粉酶活力测定。吸取上述淀粉酶原液10 mL，放入50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。3. 酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。表2 酶活力测定取样表操 作 项 目 淀粉酶活力测定 -淀粉酶活力测定 - 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6淀粉酶原液（mL） 1.0 1.0 1.0 0 0 0钝化-淀粉酶 置70水浴15min，冷却淀粉酶稀释液（mL） 0 0 0 1.0 1.0 1.03,5-二硝基水杨酸（mL

23、） 2.0 0 0 2.0 0. 0预保温 将各试管和1%淀粉溶液分别置于40恒温水浴中保温10 min1%淀粉溶液（mL） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0保温 在40恒温水浴中准确保温5min3,5-二硝基水杨酸（mL） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0将各试管摇匀，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20 mL。以1号管（做标准曲线时用过的）作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度，记录测定结果。 管号- 1- 2- 3- 4- 5- 6吸光度麦芽糖含量五、结果计算计算- 2、- 3光密度平均值与- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦

24、芽糖含量（mg），按下列公式计算- 淀粉酶的活力。计算- 5、- 6光密度平均值与- 4光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（）淀粉酶总活力(单位同上)。（）淀粉酶总活力-淀粉酶活力（）淀粉酶总活力-淀粉酶活力六、附注（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。（2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过0.5。（3）如果条件允许，

25、各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。七、思考题1为什么要将- 1、- 2、- 3号试管中的淀粉酶原液置70水浴中保温15 min？2为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40水浴中保温？ 实验五 酶的激活和抑制作用一、实验目的初步认识酶的性质，了解酶促反应的激活剂与抑制剂； 学习检定激活剂和抑制影响酶反应的方法和原理。二、实验原理酶是具有高效专一催化活性的蛋白质，其活性常受温度PH及些物质的影响。 某些物质可以增加其活性，称为激活剂；某些物质能降低其活性，称为抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影

26、响酶的活性，而且这种作用常常具有特异性。但要注意的是激活剂和抑制不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂时却为另一种酶的抑制剂，而在高浓度时则为该酶的激活剂（如NaCl）。淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈蓝色，紫色，暗色或红色。最简单的糊精遇碘不呈蓝色。三、实验步骤激活剂和抑制的认识：取4支试管，按下表加试剂： 管号 12340.1%淀粉（mL）1.51.51.51.51%CuSO4（mL）0.5/1%NaCl（mL）/0.5/1%Na2SO4（mL）/0.5/水/0.5稀淀粉酶（mL）0.50.50.50.5保温（37）10分钟后KII223滴23滴23滴23滴

27、现 象 四、思考题 1、激活剂抑制剂实验中淀粉酶要最后加，为什么？ 2、加入淀粉时要小心，不要沾到试管壁；另外，摇匀时也不宜用力过猛，使淀粉溶液或淀粉粒过多地沾在试管壁上，这样会影响结果的观察，误差较大，为什么？实验六 氨基酸的分离鉴定纸层析法 一、实验目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。二、实验原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：Rf = 原点到层析中心的距离 / 原点到容剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、器材1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、小烧杯 6、长颈漏斗7、层析滤纸(新华一号) 8、电吹风四、试剂1、扩展剂 正丁醇:88%甲酸:水15:2.5:2.5（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。每组配制40 mL。2、氨基酸溶液 05的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液及它