生物工艺总复习09版文档格式.docx

1、1、微生物选择性分离方法包括哪些步骤？如何利用选择性分离的方法从自然界分离筛选到蛋白酶产生菌？如何利用选择性分离的方法从自然界分离筛选到纤维素酶产生菌？微生物选择性分离方法步骤：含微生物材料（样品分离源）的选择。分离源材料的预处理。所需菌种的选择性分离。所需菌种的选择性培养。菌落的选择和纯化。利用选择性分离的方法从自然界分离筛选蛋白酶产生菌： 从蛋白质加工厂（豆制品厂、肉制品厂）附近的土壤中采集样品分离源。 用富含蛋白质的原料（豆饼）为培养基对样品分离源进行富集培养，使目的菌数量和生长势达到优势。 样品分离源经富集培养后制成菌悬液，适当稀释后涂布于以酪蛋白为唯一氮源的平板培养基。经保温培养一定

2、时间后，选择分解酪蛋白形成透明圈的菌落。将透明圈直径与菌落直径之比值大的菌落编号后移接于试管斜面培养基，经保温培养长出丰厚的菌落。将试管斜面培养基长出各菌株，按编号分别进行小型发酵试验，通过测定发酵结果的蛋白酶活力，筛选出产酶活力高菌株。利用选择性分离的方法从自然界分离筛选纤维素酶产生菌：从富含纤维素原料的加工厂（棉花加工厂、秸秆加工厂）附近的土壤中采集样品分离源。 用富含纤维素的原料（秸秆）为培养基对样品分离源进行富集培养，使目的菌数量和生长势达到优势。 样品分离源经富集培养后制成菌悬液，适当稀释后涂布于以纤维素粉为唯一碳源的平板培养基。经保温培养一定时间后，选择分解纤维素形成透明圈的菌落。

3、将试管斜面培养基长出各菌株，按编号分别进行小型发酵试验，通过测定发酵结果的纤维素酶活力，筛选出产酶活力高菌株。2、筛选具有潜在工业应用价值的微生物应考虑哪些指标？（1）菌的营养特征，能适应廉价的培养基和来源丰富的原料。（2）耐较高的培养温度，尽量选择生长温度高于40的菌种，这可以大大降低大规模发酵的冷却成本。（3）对所采用设备和生产过程的适应性强。（4）菌的遗传稳定性强，不易变异。（5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度要高。（6）容易从培养液中回收产物。3、何谓菌种的分离、筛选？分离：是指获得纯的或共生的混合培养物，其目的是将目标菌种与分离源中混杂的其它菌种分开。筛选：就是鉴别能产生所需产物

4、或具有某种特定生化反应的目标菌。4、何谓富集培养？富集培养：是指能增加混合菌群中所需菌种数量的一种技术。方法要领是给混合菌群提供一些有利于所需菌种生长或不利于其他菌种生长的条件。5、何谓分批富集培养和连续富集培养？连续富集培养适合分离哪些特性的工业微生物菌种？分批富集培养：采用分批培养的方法把富集培养物分次移接到新鲜的同一种培养基并保持相同的培养条件以维持选择压力的培养方法。关键是移种的时间，应在所需菌种占优势的情况下移种。连续富集培养：采用连续培养法，通过改变限制性基质浓度可以控制不同菌种的比生长速率来富集所需菌种的技术。连续富集培养可分离出适用于连续发酵生产的菌种，并可筛选出能共生的稳定混

5、合培养物。6、筛选鉴别抗生素产生菌、抗肿瘤药物产生菌和生长因子产生菌的原理和方法？（1）筛选鉴别抗生素产生菌原理：产生抗生素的菌株会抑制病原菌的生长。方法：用含有试验菌的平板培养基培养待筛菌株可以鉴定产生菌抗病原菌的作用。用液体培养基培养待筛菌株，检测其无细胞滤液的抗病原菌活性。采用联合试验菌，可分离出对某种试验菌抗菌活性低，对其他试验菌抗菌活性高的新的抗生素产生菌。（2）筛选鉴别抗肿瘤药物产生菌抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质。微生物的核酸结构及其生物合成方式与人类有许多共同之处。因此，抗肿瘤药物也具有抗菌活性。用对抗肿瘤药物敏感的试验菌筛选抗肿瘤药物产生菌，具有高灵

6、敏度和简便快速的特点。利用DNA修复基因突变株为试验菌生物细胞一般有2个以上的DNA修复基因，DNA修复基因突变株由于DNA修复基因突变，对抗肿瘤药物很敏感、易被致死，可作为试验菌用于抗肿瘤药物产生菌的筛选。生化诱导分析法（BIA）测定溶原性噬菌体阻遏物支配下的启动子控制的转录和表达的酶活性。将大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因（LacZ）经重组连接在噬菌体PL启动基因后，用重组噬菌体的宿主菌为筛选抗肿瘤药物产生菌的试验菌。当抗肿瘤药物对试验菌中噬菌体的DNA损伤时，会诱发噬菌体的调节基因突变或缺失，诱发阻遏蛋白（CI）分解或缺失，使得噬菌体的PL启动基因启动LacZ基因转录和表达。这样，通过测定表达

7、的-半乳糖苷酶活性，即可检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在。（3）筛选鉴别生长因子产生菌通过观察待筛菌株能否促进营养缺陷型试验菌的生长，便可检出生长因子产生菌。生长因子产生菌的初筛一般在固体培养基上进行。将含有3050个待筛菌株菌落的分离平板复制到能支持待筛菌株生长并能产生所需生长因子的固体培养基上约23天，用uv线杀死长好的待筛菌株菌落，然后在其上面铺上一层含营养缺陷型（缺陷所需产物）试验菌悬液的琼脂，在37培养16小时后，试验菌可能在某一待筛菌株菌落的周围有一生长圈，这样便可以从原来被复制的平板上分离到所需的目标菌株。第三章作业：1、菌种选育的作用和意义。作用：从自然界经分离筛选获得的有潜

8、在工业应用价值的野生菌种，在应用于生产之前，必须经人工选育以获得具有较高生产能力和优良生产性能的生产菌种。工业生产现用菌种的提纯复状，经人工选育进一步提高生产能力并改善其生产性能。意义：菌种选育不仅为发展工业生产提供各种类型的突变株，提高发酵单位，还可以改进产品质量，去除多余的代谢产物和合成新产品，同时它又涉及一系列微生物潜在资源的广泛利用和开发。2、何谓自然选育？简述自然选育的一般程序和步骤。自然选育：不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。自然选育的一般程序和步骤： 无菌水 原种斜面活化培养单孢子或单细胞悬浮液稀释平板涂布分离经初筛挑取部分单菌落于试管斜面纯化复筛

9、发酵试验测定生产能力稳定性试验和菌种特性考查中试考查生产应用。3、何谓自然突变？自然突变的原因有哪些？自然突变：指某些生物在没有人工参与的自然条件下所发生的那些突变。自然突变的原因：多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。（1）多因素低剂量效应：指自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应。 （2）互变异构效应：指四种碱基的第六位或第四位上酮基与烯醇基或氨基与亚氨基间的互变从而导致碱基配对的变化。4、解释自然分离及其作用。自然分离：由于自然突变的存在，为确保生产水平不致下降，生产菌种经过一定时期使用后须经分离纯化，淘汰衰退的，保存优良的。生产上现用菌种的提纯复壮。5、何谓突

10、变？突变的类型和原因有哪些？突变：所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。类型包括：染色体畸变：指染色体或DNA片断的缺失、易位、逆位、重复等。基因突变：是指DNA分子结构中的某一部位发生碱基配对或碱基排列顺序的变化（又称点突变）。突变的原因： 自然突变：指在没有人工参与的自然条件下所发生的突变。诱发突变：指采用各种物理、化学和生物因素人工诱发的突变。6、诱变育种的一般步骤和应注意的问题。一般步骤：出发菌种斜面活化培养单细胞或单孢子悬浮液诱变处理稀释涂布平板培养出单菌落挑取单菌落纯化摇瓶初筛发酵试验挑出高产菌斜面菌种保藏斜面活化摇瓶复筛发酵试验稳定性考查中试考查生产应用应

11、注意的问题；选择好出发菌株；复合诱变因素的使用；适宜剂量的选择；变异菌株的筛选；高产菌株的获得需要选择性筛选条件的配合。7、抗噬菌体育种常采用的方法有哪些？（1）利用自然突变来筛选抗性菌株以噬菌体为筛子，利用微生物的自然突变来筛选抗性菌株，敏感菌株不经任何人工诱变处理由其自然突变为抗性菌株，这种方法获得的抗性菌株频率很低。（2）利用诱发突变来筛选抗性菌株敏感菌株先经人工诱变处理，然后将处理过的细胞或孢子液分离在含有高浓度噬菌体的平板培养基上，经诱变后存活的细胞或孢子中，若存在抗性变异菌株就能在此平板上生长，人工诱变可以提高抗性菌株出现的频率。还可将敏感菌株的细胞或孢子经人工诱变处理后接入种子培

12、养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体继续培养几天，再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取再生菌丝进行平板分离，从中筛选出抗性菌株。8、何谓杂交育种？杂交育种的目的。杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经吻哈（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状的菌株。 杂交育种的目的： 使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）。 通过杂交把不同菌株的优良性能集中于重组体中，克服长期诱变处理造成的菌株生长活力下降等缺陷。 通过杂交，可扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种。分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规

13、律，促进遗传学理论的发展。9、何谓原始亲本、直接亲本？何谓营养缺陷型菌株？原始亲本：经考察选定的准备用来配对杂交的菌株称为原始亲本，常是具有应用潜力的野生菌株或需要进一步改良的现用生产菌株。直接亲本：微生物杂交育种直接用来配对杂交的菌株称为直接亲本。直接亲本由原始亲本经诱变获得，经诱变后带有适当的遗传标记，常用的遗传标记有颜色、营养要求和抗药性等。营养缺陷型菌株：是微生物经诱变处理后，由于基因突变，它丧失了合成某种必须物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，需要补加该种必须物质后才能生长。10、放线菌杂交遗传物质交换和重组的过程。亲本 混合培养异核体部分合子异核系重组

14、体亲本 11、放线菌杂交玻璃纸转移法的条件和原理。本法必须备两个条件：直接亲本之一带有一种营养要求和抗药性（如抗链霉素）；另一个直接亲本则为对该药物敏感和带有另一种营养要求。选择性培养基是带有抗性药物的补充培养基。 方法要领：在选择性培养基上挑选异核系菌落。 基本原理：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含有链霉素的选择性培养基上不能生长。敏感性亲本和抗药性亲本因为营养要求得不到满足，也不能在该选择性培养基上生长。而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该选择性培养基上生长，繁殖成异核系菌落。12、霉菌准性生殖及其遗传物质交换和重组过程。准性生殖：是指真菌中不通过有性生殖的基因重组

15、过程。准性生殖遗传物质交换和重组过程：异核体的形成，杂合双倍体的形成，体细胞重组（包括染色体交换和染色体单倍化），重组体的形成。 13、何谓原生质体融合？原生质体融合育种的一般步骤。原生质体融合：在等渗条件下将两亲本的原生质体混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。原生质体融合育种的一般步骤：融合育种亲株的选择，细胞培养和预处理，原生质体制备，原生质体融合，融合子的再生，重组子筛选。14、菌种保藏的意义和常用方法。菌种保藏的意义：首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设

16、法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方向转化。菌种保藏原理：根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。菌种保藏常用方法：试管斜面冰箱保藏法，沙土管保藏法，石蜡油封存法，真空冷冻干燥保藏法，液氮超低温保藏法。第四章作业：1、微生物代谢调节的生化本质。在细胞内有两种不同的调节机制，酶合成调节和酶活性调节。两者均由低分子量的化合物介入，称小分子效应物，这些化合物或以中间代谢物形式存在细胞内，或从环境中摄入细胞。两种调节机理均涉及一类特有的蛋白质称为变构蛋白

17、，变构蛋白是这样一种蛋白质，若某种特殊的小分子与它相合，它的性质便改变，因此，变构蛋白可用于控制代谢变化，这种变化是由小分子效应物引起的。有两种变构蛋白：一种为变构酶，当与小分子效应物结合，其活性便改变酶活性调节。另一种为调节变构蛋白质，无催化活力，这种蛋白质连接在细菌染色体结构基因附近，从而控制基因的表达，以调节酶的合成酶合成调节。2、何谓酶活性的变构调节和共价修饰调节，两者的相互关系？酶活性的变构调节：变构酶活化型与钝化型之间的转换是通过酶的空间构象改变来实现的，这种改变是酶与小分子效应物相互作用的结果。变构酶两种状态之间的转换，并没有涉及共价键的形成或断开。酶活性的共价修饰调节：有些酶的

18、活化型和钝化型的差别在于有无与酶蛋白共价连接的化学物质。活化型与钝化型之间的转换是共价键的形成或断开的结果，它是由酶催化的。两者的相互关系：酶活性的共价修饰调节的机理同酶活性的变构调节并不矛盾。实际上，催化共价修饰作用的酶本身也受变构调节控制。因此，酶活性的共价修饰调节是变构调节的表现形式。3、微生物代谢调节的机制有哪些？分述其概念和作用机理。微生物代调协调机制有：诱导作用，分解代谢物阻遏作用，反馈阻遏作用，反馈抑制作用。（1）诱导作用：生物细胞与一种化学物质诱导物相接触的结果大大地增加了异化该物质所需酶的合成速率。诱导作用保证能量和氨基酸不浪费，不把它们用于制造那些无用的酶，而是定向合成异化

19、基质所需的酶。诱导作用机理：JacobMonod模型有4个基因位于DNA上，调节基因R、启动基因P、操纵基因O、结构基因S。启动基因P是RNA聚合酶的启动点，该酶负责将DNA转录给信使RNA（mRNA）。无诱导物存在时，调节基因R编码生成的阻遏物与操纵基因O结合，则RNA聚合酶不能移动，不会制造互补于结构基因S的DNA序列的mRNA，所以没有酶形成。有诱导物存在时，诱导物（基质）与调节基因R编码生成的阻遏蛋白结合，使得阻遏蛋白变构而不能与操纵基因O结合，RNA聚合酶便可从启动基因P移动，并转录结构基因S，进而合成异化基质所需的酶。（2）分解代谢物阻遏作用：所有可迅速代谢的碳源其分解代谢物会阻遏

20、异化另一被缓慢利用的碳源所需酶的合成，这一现象称为分解代谢物的阻遏作用。分解代谢物阻遏作用机理：分解代谢物阻遏作用是由CAMP不足造成的。 CAMP促进酶的大量合成，并且是这样一类mRNA合成所必须的，这类mRNA是由细胞内可诱导的操纵子转录的。在可诱导的操纵子上的启动基因至少由两个部分组成，一个是同RNA聚合酶连接，另一个是与蛋白质（CAP）-CAMP复合物连接。CAP -CAMP复合物在启动基因位点上的连接是RNA聚合酶连接到它的位点上所必须的。（3）反馈阻遏作用：某代谢途径终点产物（或其衍生物）的过量积累会阻遏该途径一系列酶的合成。反馈阻遏作用机理：受反馈阻遏作用控制的酶，是调节基因R编

21、码的阻遏蛋白作用的结果。在正常情况下（无终点产物积累），调节基因R编码的阻遏蛋白无活性，RNA聚合酶能转录结构S基因合成酶。在终点产物积累的情况下，阻遏物蛋白可被辅阻遏物（终点产物）激活，被激活的阻遏蛋白然后与操纵基因O结合，从而妨碍RNA聚合酶转录结构S基因合成mRNA，酶的合成过程被阻遏。有时终点产物的衍生物，而不是终点产物本身，是辅阻遏物。（4）反馈抑制作用反馈抑制：某代谢途径终点产物的过量积累抑制该途径前面第一步或第二步酶的活性。反馈抑制作用机理：一般来说，一已知代谢途径前面第一步或第二步的酶是变构酶，是该途径终点产物的专一抑制对象。当该途径终点产物（效应物）过量积累时，它就会与变构酶

22、的变构位点结合，使变构酶发生空间构像的改变，而使酶的活性由活化型转变成钝化型。总结：以上4种代谢调节机制都是变构蛋白与效应物作用的结果，现将各种调节机制所涉及的变构蛋白和效应物总结如下：调节机制 变构蛋白 效应物诱导作用 阻遏蛋白 诱导物分解代谢物阻遏作用 CAP（CAMP受体蛋白） CAMP反馈阻遏作用 阻遏蛋白 终点产物反馈抑制作用 变构酶 终点产物4、何谓诱导酶和组成型酶？何谓组成型突变？诱导酶：有些酶只有它们所作用的基质（或其结构类似物）存在于培养基中时才被合成。组成型酶：细胞不管生长在什么培养基内，为维持细胞的正常生命活动有些酶总是适量存在，这种类型的酶称组成型酶。何谓组成型突变：在

23、DNA上，调节基因R和操纵基因O的突变可干扰阻遏蛋白的形成或结合。这样，RNA聚合酶不需要诱导物便能工作，这类作用称“组成型”突变作用。组成型酶就是通过这样的系统生成的，在这些系统中调节基因R不起作用或制造出一种无活性的阻遏蛋白，或操纵基因O对阻遏蛋白无亲和力。5、分支的代谢途径有哪些代谢调节方式？并分别解释。（1）同工酶的特异性调节：一分枝代谢途径分枝点前共同步骤的第一步可由多种酶催化，但受不同终点产物的抑制。（2）协同反馈调节：一分枝代谢途径分枝点前共同步骤的第一步只有一种酶催化，但要抑制或阻遏这种酶需要多个终点产物同时过量积累，单个终点产物不产生或产生很小的反馈调节作用。（3）累积反馈调

24、节：一分枝途径分枝点前共同步骤的第一步只有一种酶催化，某一终点产物的过量积累只有部分抑制或阻遏作用，终点产物的联合显示出累积的效果。（4）顺序反馈抑制：导向不同终点产物的分枝代谢途径，每个终点产物只反馈抑制分枝点后其所在分枝途径第一步的酶，共同途径第一步的酶受分枝点处中间体的的反馈抑制。（5）联合激活或抑制：一种生物合成的中间体受两个完全独立的代谢途径的调节控制。6、以肌苷酸的生产为例说明如何避开固有的调节机制实现中间产物的积累？ （1）目的产物肌苷酸（IMP）所在的代谢途径嘌呤核苷酸生物合成途径如下： 磷酸核糖基焦磷酸（PRPP） PRPP酰胺转移酶 IMP SAMP合成酶 IMP脱氢酶 S

25、AMP XMP黄嘌呤 AMP GMP鸟嘌呤（2）谷氨酸棒杆菌中该途径原有的代谢调节机制为：终点产物AMP（腺苷酸）和GMP（鸟苷酸）施加累积的反馈抑制和阻遏PRPP酰胺转移酶，AMP反馈抑制S-AMP合成酶，GMP反馈抑制和阻遏IMP脱氢酶。 （3）实现肌苷酸生产的措施菌种选育：通过诱变获得一缺失S-AMP合成酶的AMP营养缺陷型突变株，这种菌变成需要AMP以供生长。培养控制：菌种保藏和种子培养培养基需提供充足的AMP以保证菌种生长。生产培养基提供生长限量的AMP，则菌株不会在细胞内积累AMP而达到反馈调节的浓度，AMP和GMP对PRPP酰胺转移酶的累积反馈调节作用被解除，于是菌把更多的碳和氮

26、转化为IMP（肌苷酸）。而IMP脱氢酶仍被GMP反馈抑制和阻遏，只有一小部分IMP转化为GMP，大部分IMP积累并分泌出来。7、以赖氨酸的生产为例说明如何避开固有的调节机制实现终点产物的积累？（1）在谷氨酸棒杆菌中赖氨酸所在的代谢途径如下： 天门冬氨酸 天冬氨酸激酶 天门冬氨酰磷酸 天门冬氨酸半醛 双氢吡啶二羧酸合成酶 高丝氨酸脱氢酶 双氢吡啶二羧酸脱氢酶 高丝氨酸 苏AA 甲硫AA 赖AA 异亮AA （2）在谷氨酸棒杆菌中该途径原有的调节机制为：该途径只有单一的天冬氨酸激酶，它受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用调节的。（3）实现赖氨酸生产的措施通过基因重组除去高丝氨酸脱氢酶可获得一甲硫氨酸和

27、苏氨酸营养缺陷型突变株。菌种保藏和种子培养培养基需提供充足的甲硫氨酸和苏氨酸以保证菌种生长。生产培养基只要保持低水平的甲硫氨酸和苏氨酸供给量以维持菌种生长，这样苏氨酸在细胞内的浓度受到限制，天门冬氨酸激酶可避开苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制作用的调节，代谢中间体便会流向赖AA支路上来。此外，要过量积累赖氨酸，赖氨酸产生菌还需具备以下特点；赖氨酸产生菌，不存在天冬氨酸激酶或天冬氨酸半醛脱氢酶受赖氨酸反馈调节的问题。赖氨酸分枝途径的第一和第二个酶（双氢吡啶二羧酸合成酶和双氢吡啶二羧酸还原酶）不受赖氨酸的反馈抑制或阻遏。赖氨酸产生菌中缺少L-赖氨酸脱羧酶。8、用结构类似物筛选耐反馈调节作用突变株的原理和方法？氨基酸A在正常情况下抑制或阻遏它自己的生物合成酶，其本身又是合成蛋白质所必须的。氨基酸A的结构类似物A、也有相同的抑制或阻遏作用，但不能用于蛋白质合成。诱变菌株在含有A、的培养基中培养，绝大多数细胞因不能合成A而死亡，只有那些对A、不敏感的突变株仍能合成A并长成菌落。分离耐反馈抑制或反馈阻遏作用突变株的最简便的方法是选择目的产物的结构类似物。把经诱变的细胞铺在含有这种抗代谢物的平板上，大多数细胞不能生长，从中挑选出耐抗代谢物的突变株。9、使细胞通透性改变的原因及其生化本质？细菌细胞膜通透性的增加是防止代谢产物在细