AFLP技术及其在植物学应用中的研究进展.docx

1、AFLP技术及其在植物学应用中的研究进展年早春树木未萌动前,将扦插苗移栽到事先准备好的消毒苗 床上, 第三年春季定植 。4.5欧洲荚 的温室播种幼苗,当播种盘的幼苗长到 2对真 叶时,移栽到营养钵中,于 6上旬搬到室外半荫处,炼苗一 周, 带土坨移栽到露地苗床上, 第二年春季定植 。参考文献:1中国科学院植物研究所 . 中国高等植物图鉴 . 北 京 :科 学 出 版 社, 19852祝燕, 冯大千, 李阳, 郑路 . 欧洲荚 观赏性评价及其生理生态学指标的分析 . 干旱区研究, 2005(02 0163胡义军 . 欧洲荚的种子处理 . 林业实用技术, 2005(12 0124竺可桢,宛敏渭 .

2、 1963. 物候学 M . 北京:科学出版社 5王涛 . 植物扦插繁殖技术 . 北京:科学技术出版社, 1989作者简介:安启会, 工程师 。(2011-05-05收稿 袁海峰编辑 表 1扦插季节对生根率的影响扦插时间 生根日 /月 生根率 /%生根数 /条 根长 /cm2006.6.212006.7.62007.6.212007.7.68/717/78/717/778.693.879.294.57.9612.788.4512.8211.7210.5612.1511.22表 2不同部位插条生根情况扦插部位 生根数 /条 根长 /cm 生根率 /%上 (稍 中 下 (基 7.5613.457.

3、628.7612.849.5862.294.168.1表 3不同部位扦插方差分析表方差来源 平方和 自由度 方差 F 值 F 0.05F 0.01组间 误差 总变异308.7431.34340.08268154.375.2229.565.1410.92表 4不同生根促进剂对生根率的影响 促根剂 生根日 /月 生根数 /条 生根率 /%成苗率 /%IBA IAA GGR 对照15/717/713/719/714.7513.4818.968.8483.289.196.772.010010010095表 5扦插不同处理方差分析表方差来源 平方和 自由度 方差 F 值F 0.05F 0.01组间 误差

4、 总变异1638.6938.751677.4431215546.233.23169.163.495.95表 6温室播种繁殖情况 处理方法 播种粒数出苗率 %成苗率 %裸播505024222020遮荫网 505032343032覆土 505038363836!AFLP 技术及其在植物学应用中的研究进展刘 峰 (黑龙江省科学院自然与生态研究所, 黑龙江 哈尔滨 150040摘要:AFLP(扩增片段长度多态性 是一种基于 PCR 的高分辨 DNA 指纹分析方法, 是一种新的 DNA 分子标记技术 。 与其它标记 技术相比, 它具有相对便宜 、 简便 、 快速 、 可靠的优点 。 本文阐述了 AFLP

5、 的原理 、 技术关键, 及其 AFLP 目前在植物学方面的研究 进展 。 关键词:AFLP 技术; 植物学; 分子标记AFLP Technique and its Investigative Progress of Botanical ApplicationLIU Feng (Institute of Natural Resources and Ecology,HAS.,Harbin 150040,China Abstract:Amplified fragment length polymorphism (AFLPis polymerase chain reaction (PCR-based

6、 marker with high-resolution for the rapid screening of genetic diversity. It is a new DNA fingerprint technology. Compared with other markers, it has relatively inexpen -sive, simple, fast, and reliable advantages. This paper describes the principle, key technology, and its Investigative Progress o

7、f botanical aspects in AFLP 。Key words:AFLP; botany; molecular technology国 土 与 自 然 资 源 研 究88TERRITORY &NATURAL RESOURCES STUDY2011No.3文 章 编 号 :1003-7853(2011 03-0088-03中 图 分 类 号 :Q94文 献 标 识 码 : AAFLP (Amlpified Fragment Length Ploymorphsim 是 由 荷 兰 科学家 Zebeau 发现,并由 Vos 发展起来的一种检测 DNA 多 态性的一种方法 。 该技术于

8、1993获得欧洲专利局专利 (欧洲 专利号 EP 0534858A1 ,被 Keygene 公司以专利的形式将其 买 下 , 但 不 久 予 以 解 密 。 该 方 法 是 继 RFLP (Restricition Fragment Length Ploymorphsim 、 SSR (Simple Sequence Repeat 和 RAPD (Random Amplified Polymorphsim DNA 之后发展最快 的 DNA 指纹技术, 是 DNA 指纹技术的重大突破, 也是目前 国际上最新最适用的 DNA 指纹技术 。1AFLP 原理及优越性AFLP 是 通 过 限 制 性 内

9、 切 酶 片 段 的 不 同 长 度 检 测 DNA 多态性的一种 DNA 分子标记技术, 其基本原理:先利用限制 性内切酶水解基因组 DNA 产生不同大小的 DNA 片段, 再进 行选择性扩增 。 使用双链人工接头 (Articialadapter 与基因组 DNA 的酶切片段相连接作为扩增反应的模板 DNA ,用含有 选择性碱基的引物 (primer对模板 DNA 基因选择性扩增, 获 得 的 DNA 扩 增 片 段 通 过 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 分 离 检 测, 根据扩增片段长度的不同检出多态性 。近 年 来 分 子 标 记 技 术 取 得 了 很 大 进 展 ,

10、从 第 一 代 的 RFLP 产生到现在已经有十几种分子标技术相继问世,与其 他分子标记技术相比, AFLP 的优越性主要表现在: 1.1RFLP 相比, AFLP 是基于 PCR 的分子标记技术,它只需 要少量的模板 DNA 即可 。1.2ARPD 相 比 , AFLP 的 引 物 为 1620个 核 苷 酸 组 成 , 而 ARDP 只有 10个引物, 其可靠性和重复性更高 。1.3和 SSR 相比, AFLP 不需要预先 知 道 模 板 DNA 的 序 列 , 而 SSR 设计引物时需要构建 CDNA 文库,并进行大量的测 序, 成本昂贵 。1.4AFLP 是一种半随机扩增, AFLP

11、能产生更多的多态性, 比 RFLP 、 SSR 、 ARPD 多 10100倍 。1.5AFLP 易于标准化和自动化, 适合大批量样品分析 。 随 着 检 测 技 术 的 不 断 提 高 , 同 位 素 标 记 已 经 不 再 是 AFLP 的唯一检测方式, 银染技术 、 荧光标记 、 地高辛标记相 继出现, 大大降低了同位素的危害性, 同时荧光标记技术也 由单纯标记引物转变为标记 dNTP 。 Bachem 等于 1996年将 AFLP 技术应用于 mRNA 差异分析,发展成为一种 mRNA 指 纹图谱技术, 即 cDNA-AFLP 技术 。2AFLP 标记的关键技术AFLP 分析步骤多,流

12、程长,对操作人员的素质要求较 高 。 现将 AFLP 标记技术的主要技术关键总结如下 4个方 面 。2.1模板 DNA 的质量 。AFLP 中模板 DNA 用量少,但是对 DNA 的质量要求严 格 。 基因组 DNA 是否消化完全是 AFLP 分析成败的决定性 因素,因此分离到高质量的基因组 DNA 至关重要,基因组 DNA260/280的值应为 1.8左右 。 在制备 DNA 的过程中要特 别注意避免核酸酶及各种失活物质的污染 。2.2限制性内切酶的选择和组合限制性内切酶的选择对 AFLP 分 析 的 准 确 度 具 有 关 键 性作用, 其选择要根据分析对象的种类和所要达到的分辨度 决 定

13、 。 AFLP 分 析 可 以 采 用 的 酶 有 许 多 种 , 包 括 EcoRI 、 Hind 、 Apa 、 Taq 、 M sp 、 Hpa 、 M se 、 Pst 等 。一般采用两种不同限制性内切酶 (四碱基和六碱基 , 在 不同物种基因组的 AFLP 分析过程中,所选用的限制性内切 酶也不尽相同 。 EcoRI 可靠 、 高效而价廉,是六碱基内切酶的 首选酶类 。 四碱基内切在分析植物和微生物基因组时大多选 用 M seI 。 因为其基因组内富含 -AT 序列, 而 M seI 的识别序列 为 TTAA , 与其它四碱基内切酶相比, 在植物中我们通常选择 EcoR-M seI

14、组合,可以获得更多的便于 PCR 扩增和凝胶电泳 分离的小片段 DNA 。2.3引物和接头引物和接头合成是 AFLP 技术中重要的步骤, AFLP 技术 的独特之处就在于人工设计合成了限制性内切酶的通用接 头以及可与接头序列配对的专用引物, 为此在不需要事先知 道 DNA 序 列 信 息 的 前 提 下 , 就 可 对 酶 切 片 段 进 行 传 统 的 PCR 扩增 。接头是人工合成的一段短核苷酸双链,由一个通常长 1117碱基的中心序列和内切酶识别序列组成 。 除了与相应 的酶相匹配的粘性末端不同外,低频内切酶的接头与 EcoRI 接 头 (5-CTCGTA-GACTGCGTACC-3 相

15、 同 , TaqI 与 M sel 接 头 (5-GACGATGAGTCCTGAG-3 相同 。AFLP 的 PCR 引物由 3部分组成,与连接器序匹配的中 心序列, 相应的酶切位点和 3 端的选择碱基 。 引物的设计是 PCR 扩增的关键,而引物设计主要在选择碱基数目及组合 上 。 可采用同位素 (r33PATP,T4DNA连接酶进行末端标记, 也 可以采用生物素标记或荧光标记 。如 EcoRI 引物:5GACTGCGTACC AATTC NNN 3中心序列 EcoRI 切点 选择性碱基2.4反应条件在利用 AFLP 技术分析较为复杂的基因组时,酶切片段 要经过连续两次 PCR 扩增 。 第

16、一次 PCR 扩增反应 (预扩增 , 引物中只含一个或不含选择性核苷酸, 预扩增反应条件与常 规 PCR 反应条件也大致相同,然后利用具有 3个选择碱基 的引物进行扩增, 可以提高指纹图谱的清晰度, 也可以减少 扩增过程中的非特异谱带 。 因为预扩增反应对选择扩增反应 的模板起到了选择性纯化作用,也为以后的 AFLP 分析提供 了足够的模板 。DNA 选择性扩增的反应 条 件 与 普 通 PCR 有 所 不 同 , 它 是采用温度梯度 PCR 。 其 PCR 开始于高温复性 (一般采用 65 以期获得最佳选择性 。 以后复性温度逐步降低 0.7, 一 直降到复性效果最好的温度 (一般是 56

17、。 然后保持这个复 性温度, 完成其余的 PCR 循环周期 。3AFLP 技术在植物方面的应用在生物种群区分和鉴定方面, AFLP 技术 显 示 出 巨 大 优 势,其一次检测的位点数之多是其它分子标记所无法相比 的 。 随着应用的深入, AFLP 首先在植物育种遗传标记方面应 用最广泛, 在构建植物遗传图谱 、 遗传多态性研究 、 种质资源 鉴定 、 作物育种辅助选择等众多领域有着其它分子标记技术 不可比拟的优势 。刘 峰 AFLP 技术及其在植物学应用中的研究进展 893.1构建遗传图谱 (高密度 AFLP 技术由于重复性好,且在一次实验中观察到大量 的 DNA 多态性片段, AFLP 不

18、仅能缩小抗病基因与连锁标记 之间的距离, 而且在 RFLP 遗传图上, 可增加染色体末端标 记和填充 RFLP 空隙, 不干扰 RFLP 标记簇 (Becker等 1995 , 因而 AFLP 可以构建高密度的遗传图 。 对于构建遗传图谱, AFLP 被认为是迄今最有效的分子标记技术 。 近几年来, 利用 AFLP 技术已对桉树 、 杨树 、 松树 、 垂枝桦 、 桃树进行了遗传图 谱的构建并取得了巨大的进展 。3.2遗传多样性的研究AFLP 标记是进行种质亲缘关系分析和检测种质多样性 的有效工具, 可以确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系, 从而 确定亲本间遗传距离, 并进而划分杂交优势, 提高

19、杂种优势潜 力 。 可以用杂合度和多态位点比例来衡量群体内的遗传多样 性 。 利用 DNA 多样性还可以进行种间亲缘关系分析, 即计算 种群间的遗传距离 。 AFLP 现已广泛用于植物的遗传多样性的 研究, 特别是在作物遗传多样性的种系方面, 如用 AFLP 分析 水稻 、 大豆 、 大麦, 结果显示在种系间存在显著遗传差异, 从获 得的数据显示 AFLP 技术在鉴定低水平的遗传差异性和辨别 高度相关性的基因型方面, 具有足够高的灵敏度 。3.3品种 、 品系鉴定的研究AFLP 技术可在较短的时间内检测出大量的多态性标记, 因而很适合鉴定种系 DNA 指纹,这是 AFLP 最适的应用范 围,

20、也是 Zabeau 和 Vos 申请专利的关键 。 如 Tohme 等用 AFLP 分析了 114个菜豆的基因型,并将它们分为 4个基因库 。 最 近,由祝军等人将 AFLP 标记技术用来鉴定苹果品种,从 68对引物中筛选出了 4对多态性高 、 分辨能力强的引物 。 分析了 P32M 46引物绘制的我国 25个苹果重要品种的 AFLP 指纹图 谱的遗传多样性 。 罗志勇等首次用 AFLP 技术构 建 了 人 参 (Panax ginseng C A Meyer 和西洋参 (Panax quinquefolium L 。 的 DNA 指纹图谱, 具有丰富的多态性, 这对于鉴别人参品种 、 真 假

21、人参等提供非常有效的工具 。3.4辅助育种AFLP 技术有助于克服早期选择亲本基因组的盲目性 。 Vantoai 等利用 AFLP 研究了大豆轮回选择过程中 、 亲本基因 组 DNA 对于子代的贡献, 其结果发现, 经过两次轮回选择, 2个适应性亲本在后代的基因组中占 75%,而 4个外地品种只 占后代基因组成分的 25%。 此试验表明, 根据 AFLP 标记可以 进行轮回选择, 可以跟踪基因的转移情况, 如果 AFLP 标记与 要选择的基因紧密连锁,这样就可以在早期筛选植物分离群 体中分离出含目的基因的植株 。陈受宜等用 RFLP 、 SSR 和 AFLP 三种标记分析了大豆属 的 11个种

22、, 构建了大豆相关种的分子系统树并确立了半野生 种 G.gracilis 的分类地位, 对栽培大豆 G.max 的起源 、 进化和 育种具有重要意义 。4展望AFLP 标记无法比拟的优点, 和 cDNA-AFLP 的出现, 使 AFLP 技术得到了快速的推广和应用 。 通过阅读近年来的资 料, 统计分析发现, 用 AFLP 标记进行研究的文献比率呈逐年 上升趋势 。 随着 AFLP 操作步骤的简单化 、 规范化和自动化, AFLP 分析的效率会进一步提高,应用范围会不断扩大, AFLP 标记将成为遗传学和分子生物学工作者手中强有力的研究工 具 。参考文献:1Barbier,EB,Burgess

23、,J C,Folke,C.Paradise Lost.The Ecological Economics of Biodiversity M.London:Earthscan Publications Ltd,1994.Jia J, LiC, DengQ, WangB. Acta Botanic Sinica, 2003, 45(5:614620.2ZhejiangDa Xue Xue Bao Yi Xue Ban. Establishment of fingerprint database for drug-resistant strain of Acinetobacter baumannii

24、 by AFLP method. 2007Nov;36(6:53742.Chinese.3Pradhan A K, GuptaV, eta.l TheorApplGenet, 2003, 106:607614. 4Lu G Y, Yang G S, Fu T D. Plant breeding, 2004, 123:262265. 5NegiMS, DevicM, DelsenyM, LakshmikumaranM. TheorAppl Genet, 2002, 101:146152.6BeckerJ,Vos P,Kuiper M,et al.Combined mapping of AFLP

25、and RFLP markers in barleyJ.MolGen Genet,1995,249:6573.7DasmahapatraKK, Lacy RC, Amos W.Estimating levels of inbreeding using AFLP markers.Heredity. 2007Nov 7; 6488.8MIFTAHUDING J,SCOLES J,GUSTAFSON P.AFLP markers tightly linked to the aluminum-tolerance geneAlt3in rye (Secalece-realeL.J. Theor.Appl

26、.Genet.,2002,104:626631.9周志勇 , 周钢 , 周肆清 , 等 。 AFLP 法构建人参 、 西洋参基因组 DNA 指 纹图谱 J.药学学报 2000,35(8:626629.10李丽 , 郑晓鹰 . AFLP 分子标记应用于白菜品种鉴定 J.分子植物育 种 , 2006,4(5:685689.11唐静 , 蒲志刚 , 张敏 , 等 . 小麦锈菌 AFLP 分子标记技术体系的建立 J.中国农学通报 , 2005, 21(8:325329.12鹿金颖 , 毛永民 , 申莲英 , 等 . 用 AFLP 分子标记鉴定冬枣自然授粉 实生后代杂种的研究 J.园艺学报 ,2005,

27、32(4:680683.13VosP,Hogers R,Bleeker M,et al.A new concept for DNA J.Nucleic Acids Res,1995, 23:44074414.14段会军 , 马峙英 , 张彩英 , 等 . 西瓜品种间亲缘关系的 AFLP 分析 J.河北农业大学学报 ,2007,30(1:2730.15王斌 , 李传友 , 郑洪刚 . 水稻的 AFLP 研究初报 反应条件的优化及 对温敏不育等位突变系的分析 J.植物学报 ,1999,41(5:502507.16邸宏 , 陈伊里 , 金黎平 .RAPD 和 AFLP 标记分析中国马铃薯主要品 种的

28、遗传多样性 J.作物学报 ,2006,32(6:899904.17李锡香 , 朱德蔚 , 杜永臣 , 沈镝 , 孔秋生 , 宋江萍 . 园艺学报 ,2004, 31 (3:309314.18周李华 . 广东茶树种质资源遗传多样性 AFLP 分析 D.湖南农业大 学硕士学位论文 ,2006.19鲁凤娟 . 梨属植物 AFLP 反应体系的建立及其应河北农业大学硕 士学位论文 ,2004.20黄建安 . 茶树分子遗传图谱构建及多酚氧化酶基 SNP 研究 D.湖 南农业大学博士学位论文 ,2004.作者简介:刘峰, 男, 研究实习员 。(2011-03-24收稿 袁海峰编辑 ! 国土与自然资源研究 投稿地址:黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平路 103号, 国土与自然资源研究 编辑部收 。邮箱:guotuyanjiu; guotuyanjiu 。 以上两种方式均为有效投稿, 请作者写明详细的电话和地址等, 以便联系 。90刘 峰 AFLP 技术及其在植物学应用中的研究进展