食品生物技术导论复习提纲.doc

1、第二、四、八章一、名词解释1、食品生物技术：食品生物技术指生物技术在食品工业中的应用，其以基因工程技术为核心手段，包括细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等技术，贯穿于食品制造的全过程（上游过程和下游过程）。或者，利用生物体及其细胞、亚细胞和分子组成部分，结合工程学、信息学等手段研究及加工处理或制造食品产品的新技术。2、基因工程：指用酶学方法将异源基因与载体DNA进行体外重组，将形成的重组DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需的生物品种和产物，也称分子克隆或重组DNA技术。3、目的基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或

2、DNA片段，能编码某一产物或某一性状，又称特异基因或靶基因。4、基因重组：指将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重组子。5、感受态：指宿主细胞能吸收外源DNA分子而有效作为转化受体的某些生理状态。6、限制性内切酶：指一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。7、酶的固定化：是指将酶与不溶性载体结合，使游离酶、细胞或细胞器等的催化活动完全或基本上限制在一定空间内的过程。8、酶分子修饰：通过改变酶分子的结构，使酶的某些特性和功能发生改变的技术。

3、9、转基因食品：是指用转基因生物制造、生产的食品、食品原料及食品添加物等。10、受体（宿主）细胞：指在转化、转导和杂交中接受外源基因DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。二、思考题1、碱性SDS法提取质粒的原理。在pH12.012.5范围内使染色体中双螺旋开链DNA选择性变性，而闭环双链DNA不变性。经乙酸钠中和后，SDS引起蛋白质-SDS复合物和相对分子质量高的DNA沉淀，再经高速离心将质粒DNA留于上清液中而分离。2、限制性内切酶的作用机制。限制性内切酶以环状或线性的双链DNA为底物，在一定条件下，识别一定的核苷酸序列，在两条链的特定的磷酸二酯键上催化切开，产生具有3-OH和5-P基团的D

4、NA片段。3、酶分子修饰的主要方法有哪些？（1）化学修饰：利用化学手段将某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子的某些部分删除或置换，改变酶的理化性质，最终达到改变酶催化性质的目的。大分子结合修饰； 肽链有限水解修饰；侧链基团修饰；分子内或分子间交联：使用双功能试剂交联，更稳定；氨基酸置换修饰：改变活力中心的氨基酸；金属离子置换修饰：如将酰基化氨基酸水解酶的活力中心的Zn2+置换为Co2+。（2）物理修饰：通过物理方法，不改变酶的组成单位及基团，只使酶分子的空间构象发生改变（副键变化或重排），而改变酶的某些特性和功能。高压处理：酶活提高；最适条件改变；适当变性改变空间构象：稳定性适当提高4

5、、提高微生物产酶的措施主要有哪些？（1）选育优良细胞（基因重组技术）（2）强化生产过程： 控制合理发酵条件：pH、温度、基质浓度等；添加诱导物：如乳糖诱导-半乳糖苷酶；控制阻遏物浓度：产物积累一定浓度，合成受阻；添加表面活性剂：主要是非离子型表面活性剂；添加产酶促进剂： 植酸钙镁、聚乙烯等5、固定化处理后酶的性质会发生哪些改变？（1）固定化酶的活力：与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。（2）固定化酶的稳定性：大多数酶在固定化后都不同程度地提高了稳定性，延长了有效寿命。热稳定性：大多数酶固定化后与溶液酶相比，有较高的热稳定性，反应的温度一般较溶液酶的高pH一酶活力关系：反应的最适pH和酶活力

6、-pH曲线的变动依据酶蛋白和载体的电荷而定。 带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。对蛋白酶的抵抗力提高：溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。对变性剂、抑制剂的抵抗能力提高：酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力。操作稳定性：固定化酶在操作中可以长期使用。贮藏稳定性：大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性。6、基因工程的主要内容包含哪些内容？（1）从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。（2）将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。（3）将重组DNA分子转移到适当

7、的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。（4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。（5）将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。7、基因工程的载体应具体哪些条件？（1）本身是一个复制子，能自我复制 （2）相对分子质量较小，限制性内切酶切点少，宜于接受目的基因（3）能给宿主细胞（受体）提供可选择标记，有可供辨认的表形特征，便于筛选（4）只有单一限制性内切酶切点，即经某限制性内切酶切割后，即可把质粒DNA闭环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。8、制备食品酶制剂时，所用

8、菌种应具备哪些条件？（1）安全可靠，非致病菌；（2）稳定性好不易感染噬菌体；（3）酶产量高，有较好的开发应用价值；（4）容易培养和管理，产酶细胞易生长繁殖；（5）能利用廉价的原料，发酵周期短。9、试述聚合酶链式反应（PCR ）的技术原理和主要过程。（1）原理：PCR技术的实质为体内DNA复制的体外模拟。即使双链DNA热变性而分开成为单链DNA，退火后在低温下，两个与模板互补的引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用Taq DNA聚合酶的聚合活性和热稳定性进行聚合（延伸）反应。每经过一次变性、退火和延伸为一个循环，所扩增的特定DNA序列数量按几何指数增长。（2）主要过程： 模板DNA的变性：模板

9、DNA加热至9495一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环“变性-退火-延伸”过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍

10、。10、以大肠杆菌质粒DNA的提取和重组为例阐述基因工程的基本步骤。答：从细胞中分离出DNA 限制酶截取DNA片断 分离大肠杆菌中的质粒 DNA重组 用重组质粒转化大肠杆菌 培养大肠杆菌克隆大量基因11、转基因食品的危害主要有哪些？（1）直接危害：转基因寄宿、受体或带菌微生物感染人类、动物及植物；转基因生物、组分或代谢物产生毒性或引起过敏反应；因意外释放转基因生物而对环境的影响。（2）间接危害：转基因生物产生具有传染性或抗药性的微生物（新的病原细菌和病毒）；将有害的基因（如致癌物质）传给人类；有关基因物质转移到相关生物中，使之抵抗力增加，如抗除草剂转基因作物释放大田后，可能会出现抗除草剂特征的

11、“超级杂草”。12、转基因食品安全性评价的主要内容有哪些方面？如何理解实质性等同原则？（1）主要内容：过敏性 毒性反应 水平基因转移与生物技术改良的有关食品变化产生的任何非预期影响（2）分析比较基因修饰食品的表型性状、分子特征、关键营养成分及抗营养因子、有毒物质及过敏源等特性，评价它与非转基因食品的同类食品比较的相对安全性，是否与传统食品具有“实质性等同”。13、通过对食品生物技术课程的学习，谈谈你对生物技术食品的理解。第三章1.什么是蛋白质工程、理性分子设计和非理性分子设计？（1）蛋白质工程：是指以蛋白质的结构及其功能关系为基础，通过基因修饰、蛋白质修饰等分子设计，对现存蛋白质加以改造，从而

12、组建新型蛋白质，或全新设计新的蛋白质的现代生物技术。（2）理性分子设计：在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建新的蛋白质分子。（3）非理性分子设计：不清楚蛋白质三维结构信息和作用机制的情况下，在实验室模拟蛋白质自然进化的过程，在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需要的特性突变物，在较短时间内完成漫长自然进化过程，得到具有特性预期的新蛋白质的一种技术。2.什么是定位突变，常用的定位突变方法及其原理。（1）定位突变：定位突变是在已知蛋白质结构与功能的基础上

13、，在已知DNA序列中取代、插入或删除选定的核苷酸，从而产生具有新性状的突变蛋白质分子的一种蛋白质工程技术。（2）寡核苷酸引物介导的定位突变：用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。包括： Kunkel突变法 、基于抗生素的“抗性恢复”突变法、 基于去除特定限制酶切点的突变法PCR介导的定位突变法：利用PCR将插入和缺失的突变碱基均设计在引物中，先用两对引物分别对核酸进行PCR扩增，通过重叠延伸产生带有部分重叠序列的两种PCR产物，这些产物经过混合、变性、复性和链延伸后，再用一对与两个待接片段外侧互补的引物进行第二次扩增，从而产生全长的异源杂合双链DNA。盒式

14、突变：又称片段取代法，利用目标基因序列中适当限制酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定DNA片段。 包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。3.蛋白质的定向进化、DNA改组、融合蛋白技术的概念（1）定向进化：蛋白质的体外定向进化又称为分子进化，就是在实验室条件下模拟自然进化机制，对编码蛋白质的基因进行诱变、重组，再通过高通量筛选方法选择出性能更加优良的蛋白质。（2）DNA改组：将一群密切相关的DNA序列，在DNaseI作用下，随机酶切成许多片段，这些小片段之间有部分重叠碱基序列，可通过自身引导PCR重新组装成全长基因，从而建立分子多样性文库，对突变文库进行筛选，选择

15、改良的突变体组成下一轮DNA改组模板，重复多次重排与筛选，直至获得性状较为满意的突变体。（3）融合蛋白质技术：有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因编码区首尾连接在一起，由同一调控序列控制所构成的基因表达产物，进而表达所需的蛋白。4.蛋白质改性的方法。（1）化学改性：主要是针对蛋白质的一些氨基、羟基、巯基以及羧基进行化学修饰，改变蛋白质的结构、静电荷、疏水基团，而起到改变基功能性质的目的。（2）酶法水解改性：利用蛋白酶降解食物蛋白，使其溶解性、分散性、乳化性等蛋白性能得到改善。（3）酶法聚合改性：利用转谷酰胺酶对蛋白进行聚合改性以提高食物蛋白的功能性质。（4）物理改性：利用各种物理场效应改变蛋

16、白质的功能特性。如组织化挤压改性、高压静电改性、高热高压改性、超声改性、高频电场改性和微波改性等。5.了解蛋白质工程在食品中的应用情况。蛋白质工程在食品工业内应用主要集中在食品工业专用酶制剂的改造。蛋白质工程改造酶制剂的方面：（1）提高酶的稳定性：有些氨基酸的突变可在蛋白质结构的刚性部分引进新的分子内作用力，降低了酶折叠的熵，从而大大提高酶的热稳定性。（2）提高酶活力：通过一些活性中心附近特定氨基酸残基的突变，可以大大提高突变体酶的活力。如对大肠杆菌碱性酯酶的活力为点旁边的D101进行定位诱变，突变体酶的活力增加了15倍。（3）改变酶的选择性：通过定位突变可以改变“口袋”的电荷分布，亲、疏水性

17、及立体结构，从而改变酶对底物的选择性；通过蛋白质工程改变酶表面电荷状况来影响酶的表面特性，也可达到改变酶对底物的选择性。第五章1、什么叫发酵工程。发酵工程：利用微生物的生长繁殖和代谢活动，并通过现代化工技术，大量生产有用物质的一种生物技术体系，又称微生物工程。2、什么是种子扩大培养、其目的是什么。种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。目的：接种量的需要；菌种的驯化；缩短发酵时间、保证生产水平3、描述培养基设计和优化的一般步骤。 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，

18、初步确定可能的培养基成分； 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分； 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。4、解释对数残存定律。 微生物的热死灭动力学对数残留定律：对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡（微生物体内蛋白质变性）的速率与残存的微生物数量成正比。N：培养基中任一时刻的活微生物浓度（个/L）t：灭菌时间minK：比热死亡速率常数min-15、培养基为什么采用高温短时灭菌方式。（1）活化能大的反应中，反应速度随温度变化也大，活化能小的反应速度随温度变化小。细菌孢子热死灭反应的E很高，而大部分

19、营养物质热破坏反应的E很低，因而提高灭菌温度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短灭菌时间；（2）由于营养成分热破坏的E很低，温度提高只能稍微增大其热破坏反应速率，但由于灭菌时间的显著缩短，结果是营养成分被破坏量大大减少；（3）高温短时灭菌方法是灭菌动力学得出的重要结论，它既能快速灭菌，又能有效地保存培养基中的营养成分。6、比较培养基灭菌的二种操作方式的优缺点。（1）培养菌的分批灭菌：升温、保温和降温三个过程都是在发酵罐中进行，灭菌主要是在保温过程中实现的。优点：A设备要求低，不需另外设置加热、冷却装置；B操作要求低，适于手动操作；C适合于小批量生产规模；D适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌缺点

20、：A培养基的营养物质损失较多，培养基的质量下降；B能耗较高；C不适合于大规模生产过程的灭菌；D发酵罐的利用率较低（2）培养基的连续灭菌：将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行灭菌。分加热、保温和冷却三个步聚。优点：A灭菌温度高，可减少培养基中营养物质的损失；B操作条件恒定，灭菌质量稳定；C易于实现管道化和自控操作；D避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率；E发酵设备利用率高缺点：A对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置；B操作较麻烦；C染菌的机会较多；D不适合于含大量固体物料的灭菌；E对蒸汽的要求高7、机械搅拌发酵罐的结构、主要部件的名称和作用。发酵罐主要包括罐体、轴和叶轮、挡

21、板、夹套或蛇形管、空气分布装置、轴封和传动装置等，并在罐体上设有传感器、通风和蒸汽、排气、取样、接种、消泡剂或材料管道接口等，以及人孔或手孔、视镜和灯孔等。（1）罐体：由圆柱体及椭圆形或碟形封头焊接而成，材料为碳钢或不锈钢。为了满足工业要求，罐体须耐受一 定的温度130和压力0.25MP（2）搅拌器：作用是打碎气泡，加速和提高溶氧；加速养分和热量传递。（3）挡板：防止液面中央形成旋涡，增强其湍流和溶氧传质。（4）消泡装置: 发酵液中因含蛋白质等发泡物质，发酵过程中易产生泡沫，发泡严重时会使发酵液随排气而外溢，且增加染菌机会。采用消泡装置消泡（5）轴封：使罐顶或罐底与轴之间的缝隙加以密封，防止泄

22、露和污染杂菌（6）联轴器：用联轴器使上下搅拌轴成牢固的刚性联接（7）空气分布装置：作用是吹入无菌空气，并使空气均匀分布。（8）换热装置：冷却蒸汽灭菌后的培养基和发酵过程中所产热量8、酒精罐和啤酒罐冷却装置区别。酒精罐：对中小型酒精罐，采用罐顶喷淋于罐外壁进行膜状冷却；而对于大型酒精发酵罐，则采用罐顶喷淋与罐内冷却蛇管相结合。为避免发酵车间的潮湿和积水，要求在罐体底部沿罐体四周装有集水槽。采用管外列管式喷淋冷却的方法，具有冷却发酵液均匀，冷却效率高等优点。啤酒罐：外面设有冷却管，冷媒可以是乙二醇、酒精、冰与盐水的混合物第六章（一）名词解释1、细胞融合：是指在外力的作用下，两个以上的异源（种、属）

23、细胞或原生质体互相接触，不经过有性过程而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成一个杂合细胞的现象。2、细胞重组：将细胞核质分离技术与细胞融合技术结合，在融合介质作用下，使胞质体与完整细胞合并，使胞质体与完整细胞，或胞质体与核质体，或微细胞与完整细胞重新组成细胞的过程。3、核移植：就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。4、微细胞：核内染色体不完整的细胞5、原代培养：将动物组织消化后的初次培养6、传代培养：用胰蛋白酶将出现接触抑制的贴壁细胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细胞悬液，分装到多个培养瓶中继续

24、培养，这个过程叫传代培养。7、细胞系：初次培养的细胞经第一次传代成功后，即称之为细胞系。8、细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株9、粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。10、接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止的现象。11、有限细胞系：在体外的生存期有限即不能长期传代的细胞系。12、无限细胞系：大多数细胞系在有限的代数内增殖，当超过有限世代后，细胞获持久性增殖能力，发育成无限细胞系或称连续细胞系。13、愈伤组织：是指外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散的排列的薄壁细胞，是分化的

25、，而且还未形成组织的结构。14、外植体：是指植物组织培养中用来进行离体培养的植物材料。15、悬浮培养：是指细胞在反应器中自由悬浮生长。16、植板率：是在平板上形成细胞团的百分率，即每100个铺在平板上的细胞有几个能长出细胞团。17、细胞工程：利用细胞生物学和分子生物学技术，应用工程学的方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，从而获得特定的细胞、细胞产品或新生物品种的一门综合性科学技术。（二）问答题1、动物细胞培养形态类型和生长特点。上皮细胞型：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。彼此紧密相连成铺石状薄层；生长时呈膜状移动；很少脱离细胞群而单个活动成纤维细胞型：胞体梭

26、形或不规则三角形；胞质向外伸出23个长短不等的细胞突起；中有卵圆形核。排列成放射状，漩涡状，不连成片。游走细胞型：外形不规则且不断变化，细胞内容易出现暗的吞噬性颗粒。生长位置不固定，分散，呈活跃的的游走和变形运动。多形性细胞型：外形不规则，细胞由略呈多角形的胞体和细长的、类似伪足的胞突两部分组成，胞内容易出现暗的吞噬性颗粒2、动物细胞固定化培养方式有哪些。 微载体培养技术大载体培养技术多孔载体培养微囊化培养技术中空纤维细胞培养技术3、植物细胞和动物细胞培养需哪些特殊的成分。（1）植物细胞培养：通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素、有机添加剂等。碳源和能源：培养中的细胞对蔗糖和葡萄糖都能利用

27、，果糖的利用效果较差。维生素：培养中的植物细胞都需要硫胺素，加入烟酸、泛酸、生物素和叶酸，效果更好。氨基酸：虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好处的。此外，还使用蛋白酶解产物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有机添加剂还有如乳蛋白水解物，酵母提取物等植物生长激素：激素分为两类，生长素和分裂素。生长素促进细胞生长，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-苄氨基嘌呤和玉米素，对芽的诱导具有重要作用。（2）动物细胞培养：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、激素以及动物或人血清等。4、

28、单细胞分离方法和培养方法分别有哪些（1）单细胞分离方法：机械法：将叶肉组织研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。酶法：利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植物体，使细胞分离。化学法：利用利用化学药剂使细胞分离的方法。（2）单细胞培养方法：看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。平板培养：将悬浮单细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。微室培养：在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法5、大规模培养植物细胞的特点和主要的生物反应器类型。特点：植物细胞对剪切力敏感。 植物细胞培养通常形成细胞团。

29、植物细胞生长速度慢，操作周期长 多泡沫。 植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。 植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。大多数植物细胞培养需要光照。生物反应器类型：（1）悬浮培养生物反应器：机械搅拌反应器非机械搅拌反应器：通常为气体搅拌反应器，是一种利用通入的空气作通气和搅拌的生物反应器。A鼓泡式反应器B气升式反应器（a外循环式b内循环式）C转鼓式生物反应器光照搅拌式光生物反应器（2）固定化细胞生物反应器：填充床反应器 流化床反应器 膜反应器6、细胞融合和细胞拆合的方法有哪些细胞融合：病毒诱导细胞融合：常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。两个原生质

30、体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透 、细胞核互相融合，进入正常的细胞分裂途径，形成杂种细胞。化学融合剂法：利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。A、聚乙二醇（PEG）诱导融合：PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合.。B、NaNO3处理诱发融合：一般认为是Na+造成了膜电位的改变。C、高pH高浓度钙离子处理：物理诱导细胞融合：A电诱导细胞融合法： B 激光诱导细胞融合 C离子束诱导细胞融合细胞

31、拆合：物理拆合法：是用机械的方法或短波光将细胞核去掉化学拆合法：使用细胞松弛素7、简述原生质体制备的步聚取材与消毒肥皂水70%酒精3%次氯酸钠无菌水原生质体的分离 机械分离；酶解原生质体的纯化 可采用不连续梯度法、沉降法和漂浮法洗涤用原生质体培养液洗涤。鉴定用低渗溶液确认是否已获得原生质体活力测定 即形态识别，酚藏花红染色法或伊凡蓝染色法、FAD法8、原生质体纯化的方法有哪些（1）漂浮法：采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。（2）沉降法（过滤离心法）：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。（3）不连续梯度法：又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于