生物分子学 第8章 杂交与芯片技术Word格式文档下载.docx

1、核酸分子杂交技术基本过程主要包括核酸分子探针的选择、探针的制备与标记、核酸分子杂交、杂交结果分析四个过程。制备标记合适的探针是核酸分子杂交技术成功的关键。二、探针的类型探针指的是一段带有检测标记的与目的DNA或目的RNA特异互补的已知核苷酸序列。根据探针的制备方法及核酸性质的不同，探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针四大类。1寡核苷酸探针由公司设计合成，长度一般为1830bp。 优点是：制备方便，可根据需要自行设计，避免了天然核酸探针存在的高度重复序列；由于大多数寡核苷酸探针长度只有1530bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度。因此它特别适用于基因

2、点突变杂交分析；比活度高，适用于大多数杂交，如DNA序列测定、Southern杂交、Northern杂交、原位杂交等。缺点是探针短，探针特异性差，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大，背景噪音也大。 2基因组DNA探针利用机械剪切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而从文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因片段，经适当的标记后，即可作为探针使用。也可采用PCR方法扩增基因组DNA片段，制备基因组DNA探针

3、。选择此类探针时要特别注意真核基因组中存在的高度重复序列，尽可能使用基因的编码序列（外显子）作为探针，避免使用内含子及其它非编码顺序，否则探针中可能因高度重复序列的存在引起非特异性杂交而出现假阳性。优点：制备方法简单，不易降解，标记方法成熟。3cDNA探针由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段即可，见图8-2所示。也可采用PCR方法扩增。该方法的优点是双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高

4、，杂交信号强。缺点是由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象。图8-2 cDNA探针的制备4RNA探针分离的RNA或者利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶以双链DNA为模板在体外转录而成。RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。单链，不存在变性和自我复性。RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。缺点：RNA容易降解，标记方法也相对复杂。三、探针的标记为确定探针是否与相应核酸分子杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。理想的探针标记物应具备以下特性：高度的灵敏性；不影响碱基配对的特异

5、性；不影响探针分子的主要理化性质；对酶促反应活性无影响；检测方法具有高度灵敏性和高度特异性。核酸探针常用的标记物主要有两大类。一类是放射性标记物，如放射性同位素3H、32P、35S、125I等。以32P应用最普遍。 优点：灵敏度高，可检测到10-18g的物质；有很高的特异性，假阳性结果较少。易造成放射性污染；存在同位素的半衰期限制。第二类是非放射性同位素标记物，如地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。优点是无环境污染、可较长时间贮存，缺点是灵敏度不高。探针标记可以全程标记，亦可对探针的3端或5端进行标记。探针的体外标记法分为化学法和酶法：化学法是利用标记物分子上的活性基因与探针分子上的基因（如

6、磷酸基因）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。不同标记物有各自不同的标记方法，最常用的是125I标记和光敏生物素（photobiotin）标记。酶法也叫酶促标记法，预先将放射性同位素或非放射性标记物连接于NTP或dNTP上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。下面介绍几种常用的探针标记方法。1缺口平移法 缺口平移法（nick translation，NT）是目前实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的多种酶促活性将标记的dNTPs掺入新合成DNA链中使探针被标记。带缺口的线状、超螺旋及环状双链

7、DNA均可作为切口平移法的模板。首先利用DNase I在DNA双链上造成单链切口；然后利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，最后在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以dNTP为底物，按照碱基互补的原则，在切口的3末端-OH上合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中，见图8-3。该方法的优点是能够较好的控制探针的长度，且探针放射活性强。图8-3 缺口平移法示意图2随机引物标记法 随机引物标记法（random priming，RP）的原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DN

8、A链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性同位素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中，见图8-4。随机引物法所具有的优点有：能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记；操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题；标记活性高；可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记。缺点是探针产量比缺口平移法低。图8-4 随机引物标记法示意图3末端标记法 末端标记法是将核酸片段的5末端和3末端进行部分标记，故分为3末端标记和5末端标记。 3末端标记：在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的-32PdNTP。 3末端标记

9、法包括限制酶切和聚合酶合成两个过程，3标记有两种方式：大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段末端标记法和T4 DNA聚合酶标记法，见图8-5。 5末端标记 ：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷酸，在T4多核苷酸激酶的催化下，使 ATP分子上的-磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5OH基团上。因此采用-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5端标记。但核酸样品5端必需是去磷酸的，见图8-6。图8-5 3末端标记法图8-6 5末端标记法4PCR标记法 在PCR反应体系中利用标记的核苷酸作为反应底物，以待标记的DNA片段为模板，PCR扩增结束后标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中，制

10、备成特异的探针分子，使用前必须进行探针变性处理。该方法获得的探针分子产量高。四、杂交信号的检测杂交后信号的检测方法选择取决于探针标记物的性质。常用核酸探针标记物和检测方法见表8-1。表8-1常用核酸探针的标记和检测标记物性质标记分子标记方法检测方法放射性物质标记32P dNTPNT、PCR、RP放射自显影32P dNTP末端标记法35SNT非放射性物质标记生物素 Bio-11-dUTP酶标亲和素或酶标光敏生物素600W可见光照抗生物素抗体显色生物素化补骨脂素365紫外线照酶 过氧化物酶化学合成法或直接法直接底物显色或用酶碱性磷酸酶荧光素罗丹明和FITC合成法荧光显微镜观察或酶半抗原地高辛RP、

11、NT酶标抗体+底物显色1放射性核素标记探针检测 放射性核素标记的探针杂交后常用放射自显影进行检测，该方法基于放射性核素释放的能量将照片纸感化的原理。32P标记杂交最常用的检测方法是放射自显影。该方法的基本原理是同位素在不断衰变过程中释放出-粒子，粒子撞击X光片感光层，形成潜在影像，经过显影即可成像。2非放射性核素标记探针检测 非放射性核素标记的探针杂交后可选用比色或化学发光法检测。基本原理通过偶联反应和显色反应两步来实现。首先，可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标记探针杂交信号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体和碱性磷酸酶的复合物结合，然后再进行酶促显

12、色反应。有三类显色反应可用于结果的观察。 酶促显色法。最常用的酶是碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP），如图8-7所示； 荧光法。荧光素标记的探针杂交后可通过荧光显微镜观察或者免疫组织化学法检测，主要用于原位杂交检测，最常用的为FITC； 化学发光法。在化学反应中释放的能量以光的形式发射出来，某些底物在被碱性磷酸酶水解时会发光从而形成检测信号。发射光线的强度反映了酶的活性，从而体现了杂交分析的量。尼龙膜和硝酸纤维素薄膜均可用化学发光检测。图8-7 酶促显色法原理第二节 常见的核酸分子杂交技术核酸分

13、子杂交反应可以在溶液内进行（液相杂交），亦可在固相支持物，如硝酸纤维素、尼龙膜上进行（固相杂交），固相杂交根据诊断目的或杂交方式不同又可分为Southern杂交（Southern blot）、Northern杂交（Northern blot）、斑点杂交（dot blot）、原位杂交（in situ hybridization，ISH）、等位基因特异性寡核苷酸杂交（allele specific oligonucleotide，ASO）、菌落杂交、反向点杂交等。所谓印迹杂交是指将凝胶中分离的生物大分子转移或者直接放在固定化介质上，然后与液相中核酸分子探针进行杂交，并加以监测分析的过程。不同的核酸

14、分子杂交技术的用途不同，见表8-2。表8-2 核酸分子的类型及用途杂交类型检测目的与范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子菌落杂交检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放的DNA分子斑点杂交检测固定在膜上的DNA或RNA分子原位杂交检测细胞涂片或组织切片中的DNA或RNA分子一、原位杂交原位杂交是用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸按照碱基互补配对原则进行特异性杂交，然后应用组织化学或免疫组织化学法在显微镜下进行细胞内定位、定性和定量分析的方法。该技术的基本原理是根据被检测靶DNA的序列设计其

15、互补的探针，经过变性后的单链靶DNA可以与已标记的探针分子在低温下复性，形成靶DNA与探针的杂交体，如图8-8所示。该技术可以在反应过程中保持细胞形态，甚至是单个染色体的形态完整，因此通常被用于正常或异常染色体的基因定位、组织或细胞内基因表达位点的确定、转录水平的分析以及病毒或病原体感染的检测等。该技术在遗传学、病理学、基因诊断学等领域得到了广泛的应用。图8-8 原位杂交示意图目前应用最多的原位杂交是荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH），其探针应用荧光素直接或间接标记。荧光素（如异硫氰酸荧光素）直接标记的探针杂交后可使用荧光扫描共聚

16、焦显微镜直接观察，该方法操作简单，但是灵敏度差；用生物素或地高辛间接标记的探针杂交后的结果检则，具有直观、快速、高灵敏度的特点，被广泛应用。FISH技术还被广泛应用于比较基因组杂交、基因图谱的绘制、生殖医学和病原微生物的检测等。知识拓展：原位杂交技术的发明1969年，Pardue和John等两个研究小组发明了原位杂交技术（ISH），采用放射性标记DNA或28S-rRNA； 1988年，Giovannoni等首次将ISH引入细菌学研究，使用放射性标记rRNA寡核苷酸探针检测微生物； 1989年，Delong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细胞。于是，利用同位素标记核酸探针，可以确定基因

17、在细胞和组织的定位，从而创造了原位杂交技术。随着分子生物学的发展，在经典的原位杂交技术上，又出现了更多简洁、快速的新技术。二、斑点杂交斑点杂交是将变性后的DNA或RNA待测样品直接点样于硝酸纤维素薄膜或其他固相载体上，然后加入过量的标记核酸探针进行杂交。该技术优点是在同一张膜上可以同时进行多个样品的检测，样品用量少，方法简便、快速、灵敏，缺点是不能鉴定靶核酸分子的大小、特异性低。斑点杂交技术可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性和定量分析。三、Southern杂交Southern杂交是将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上，通过与标记的探针进行杂交，对目的DNA进行检测分析的过程。S

18、outhern杂交的基本操作过程如下： 分离提取DNA样品，并经限制性内切酶酶切；将酶切后的样品DNA进行琼脂糖凝胶电泳分离，将电泳分离后的DNA样品凝胶放入变性液中，使DNA变性；取出含变性DNA的凝胶，将硝酸纤维素薄膜或其他固相支持物放在其上，通过电转移、毛细管虹吸作用或利用真空抽滤作用等方法等使凝胶内的DNA转移到支持物上，再高温烘烤使DNA牢固的吸附在固相支持物上。在转移过程中，要保持各DNA条带之间的位置不变； 加入核酸探针，让其与固相支持物上的DNA片段杂交； 冲洗固相支持物，以除去未杂交的探针； 检测杂交信号。如图8-9所示。图8-9 Southren 杂交Southern杂交技

19、术主要用于检测基因组DNA，如基因组DNA中特定基因的定性定量分析、外源基因的转入、内源基因的突变等。四、Northern杂交Northern杂交是一种将RNA分子从电泳凝胶中转移到一定的固相支持物上，通过与标记的探针进行杂交，然后对RNA加以检测分析的方法。Northern杂交的基本过程与Southern杂交相似，只是转移的核酸分子是RNA。因为RNA分子较小，转移前无需限制性内切酶消化，且电泳分离之前需要甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，有利于与硝酸纤维素薄膜结合。Northern杂交与Southern杂交比较如图8-10所示。图8-10 Southern杂交和Northern杂交比

20、较Northern杂交目前主要应用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可以比较不同组织细胞中同一基因的表达情况。Northern杂交检测mRNA的表达水平灵敏度较PCR差，但其特异性高，假阳性率低，仍不失一种可靠的检测mRNA表达水平的方法。Southern杂交与Northern杂交名称的由来Southern杂交是由英国牛津大学著名生物化学家埃德温迈勒萨瑟恩（Edwin Mellor Southern）于1975年在爱丁堡大学任职时发明的。该技术是E.M.Southern首创的， 因此将此项技术命名为Southern印迹杂交。该技术是对基因组DNA特定序列进行定位的方法。No

21、rthern杂交由斯坦福大学的George Stark教授于1975年发明， 因为其杂交原理与Edwin Mellor Southern教授发明的Southern杂交原理相似，实验过程也相似，所以取了一个类似的名字叫Northern杂交。 其原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳， 继而按照同Southern 杂交相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。五、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一种是相应于突变基因序列设计的寡核苷酸探针（M），一种是相应于正常基因碱基序列设计的寡核苷酸探针（N）。用两种探针分别与受检者DNA样

22、品进行分子杂交。可能会出现以下4种情况： 受检者DNA能与M杂交，而不能与N杂交，说明受检者是这种基因突变的纯合子；受检者DNA既能与M杂交，又能与N杂交，说明受检者是这种基因突变的杂合子；受检者DNA不能与M杂交，但能与N杂交，说明受检者无该种基因突变；受检者DNA与M、N均不杂交，提示患者缺陷基因可能是一种新型的基因突变。第三节 DNA芯片技术DNA芯片技术是在20世纪末发展起来的一项大规模、高通量的应用核酸杂交技术的新的核酸分析技术，目前已被应用于基因表达分析、基因突变检测、基因诊断、功能基因组的比较研究、基因组作图、新基因的发现等诸多研究领域。一、DNA芯片技术概述基因芯片（gene

23、chip）又称DNA芯片、DNA阵列，DNA芯片技术的基本原理是核酸分子杂交。它是指将许多特定的DNA探针有规律的紧密排列固定于单位面积的固相支持物上，形成高密度的DNA微阵列，然后与待测的荧光标记样品进行特异性地杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较分析，从而迅速得出对目的基因的定性和定量分析结果。基因芯片的分类依据不同，分成不同的种类。根据其片基不同分为无机片基芯片（如半导体硅片和玻璃片）和有机合成物片基芯片（如硝酸纤维素薄膜和尼龙膜）；根据其应用不同又分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片等；根据其结构不同分为寡核苷酸芯片、cDNA芯

24、片和基因组芯片等。二、DNA芯片的设计与制备DNA芯片的设计原则是保证DNA探针的特异性和准确性，设计内容主要包括DNA探针的特异性设计与芯片DNA的点阵定位。DNA探针的特异性可通过基因文库或DNA的测序结果获得。双链DNA芯片的DNA探针常用PCR扩增产物，所以首先必须保证获得产物序列的准确性。PCR扩增产物序列的准确性可通过设计特异引物、保证引物Tm值一致、扩增片段大小的一致性等实现。芯片DNA的点阵定位往往设计双重或三重重复点阵，另外在其他区域还需增加阴性和阳性对照用于校正。重复点阵可保证结果地可靠性；阴性对照为不含DNA的空点，作为芯片的背景控制；阳性对照为定量加入的相应标记DNA，

25、获取的信号用作外标准，用于衡量或校正同一芯片上各不同区域的杂交差异。DNA芯片主要用于基因表达、转录水平及靶DNA片段中是否存在多态性或点突变的检测。根据芯片的应用目的不同，探针序列设计需要具有针对性。对于表达型芯片探针的设计，需设计出针对基因中的特定区域的多套寡核苷酸探针或cDNA探针，序列主要来源于已知基因的cDNA序列；对于单核苷酸多态性检测芯片的探针设计，一般采用长移位设计法，按靶序列从头到尾取1625bp的与靶序列完全互补的寡核苷酸形成探针组合，再设计一组相对应的与靶序列不完全互补的寡核苷酸探针，分别与样品和对照进行杂交，比较杂交信号；对于特定突变位点探针的设计，测定的变化点应该出现

26、在设计探针的中心，以便得到突变位置及发生变化的检测。芯片探针载体的选择也是影响芯片技术的关键。常用的固相载体材料主要有玻片、硅片、硝酸纤维素薄膜、尼龙膜、聚丙烯膜等。材料在使用前必须进行活化，以增加载体与探针的结合能力。活化的主要方式是在载体表面涂布多聚赖氨酸或包被氨基硅烷耦联试剂。常用DNA芯片制备方法主要有直接点样法和原位合成法。 直接点样法：是指将预先合成好的寡核苷酸、cDNA或基因组DNA通过高速点样机直接点在芯片上，理化方法使之固定。 原位合成法：指利用4种核苷酸直接在芯片载体上合成所需要的DNA探针，适用于制备寡核苷酸芯片和制备大规模DNA探针芯片。原位合成的方法主要包括：光导原位

27、合成法、原位喷印合成法和分子印章合成法。光导原位合成法是将半导体工业的光蚀刻技术和DNA合成技术结合起来，利用光保护基团修饰芯片片基表面碱基单体的活性羟基，通过设计特定的光刻掩膜和不断地更换曝光区域，使基片上受光保护的羟基脱保护二活化，加入核苷酸底物后，直接在片基上合成寡核苷酸探针。原位喷印合成法是利用微喷头把DNA合成试剂按一定顺序依次逐层地喷印在基片表面的不同位置上。分子印章合成法是指利用分子印章（硅橡胶模板），根据预先设计的探针矩阵依次准确压印在同一片基上，从而得到高密度的基因芯片。如图8-11所示。在进行芯片制备时，需根据芯片的设计和芯片的用途选择不同的制备方法，以便提高检测结果地准确

28、性。图8-11 原位合成芯片示意图三、DNA芯片应用的基本操作DNA芯片应用的基本操作主要包括：样品制备、杂交反应、杂交信号检测及结果分析。如图8-12所示。图 8-12 DNA芯片的操作流程（一）样品制备DNA芯片检测样品的制备包括核酸的纯化、扩增与标记。核酸样品为复杂的生物大分子，其提取物常常含有杂质，需要进行纯化。以纯化后的DNA样品作为PCR扩增的模板进行PCR扩增，然后对PCR扩增得到的大量产物进行标记。如果初始样品为总RNA或mRNA时，首先进行RNA的纯化、然后进行RT-PCR扩增，将扩增产物再进行标记。常用的标记方法为荧光标记法，一般使用荧光标记的引物或荧光标记的dNTP，在PCR扩增时将荧光加入到探针中。标记后的样品需要进行再次纯化才能使用，否则会造成荧光背景偏高，影响结果分析。使用的荧光标记物主要有：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocynate，FITC）、罗丹明（lissamine rhodamine B200，RB200）、六氯-6-甲基荧光素（6-hexachlorofluo