抗病毒生防菌f01菌株发酵条件优化学士学位论文Word文件下载.docx

1、因此，链霉菌除产生抗生素抑杀“异己”外，其基因组富含编码调控、转录蛋白的基因也有利于其感应各种环境信号和生理信息并作出反应，行使各种复杂功能，从而在具有高度竞争的土壤环境得以良好的生存。放线菌产生的抗生素中有90是以链霉菌作为生产菌种生产的现已从链霉菌中得到土霉素、金霉素，氯霉素、红霉素等氨基糖苷类、大环内酯类，多烯类、聚醚类抗生素。由于抗生素的广泛及长期应用，细菌对抗生素的耐药性问题日益严重，因此迫切要进一步发现和开发新型、高效、低毒的抗耐药菌抗生素。随着抗生素数量的不断增加，从链霉菌中筛选到的新抗生素就变得越来越困难，筛选得到的化学物质重复率非常高。然而这并不意味着链霉菌中可发掘的资源没有

2、了，根据天然产物趋势推测，链霉菌中还存在大量未知的抗生素有待进一步挖掘。作为一种很有潜力的发掘新抗生素的途径，共培养诱导方法为现有微生物资源的开发与利用揭示了新思路。 链霉菌是存在于土壤当中的一类重要的微生物类群，其可以产生丰富的次生代谢产物，是重要的天然抗生素来源，一些链霉菌代谢产生的抗生素类的次生代谢产物可以有效抑制水稻纹枯病的发生。拮抗放线菌生物防治病害的途径主要有两种途径：一是寄生在植物组织体内，诱导植物自身产生抗病性或代谢出一些具有抑菌作用的活性物质（抗生素）影响病原菌的新陈代谢过程，从而达到防病治病的目的；二是在寄主体外利用。 链霉菌是具有复杂生活周期的革兰氏阳性放线菌，系统生物学

3、上归于链霉菌属，该属的许多成员都能产生对人类具有重要意义的天然代谢物，如目前临床上应用的抗生素约三分之二来源于链霉菌（该属产生的代谢物还包括抗肿瘤剂）免疫抑制剂，抗虫剂以及其他胞外水解酶!如淀粉酶，几丁质酶，纤维素酶，果胶酶，木聚糖酶和蛋白酶等。链霉菌对植物病害的生防作用机制包括拮抗作用、竞争作用和诱导植物抗性作用等方面，其生防效果往往不是单方面的，而是以上几种方式作用的综合结果，不同生防机制之间往往存在着协同作用。由于链霉菌防治植物病害时存在防治效果难以稳定、持久等缺点，寻找提高链霉菌防治植物病害效果的途径显得十分重要。提高链霉菌防治植物病害效果的途径有诱变育种、固定化技术和改良发酵工艺等，

4、其目标是为了提高目标产物的产量和纯度，减少副产物，改变生物合成途径，以获得高产的新产品。人们经常通过种内融合或者紫外诱变等方式提高链霉菌分泌抗生素的能力，以提高其抑菌能力。1.2病毒危害 病毒（virus）由一个核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质（Protein）构成或仅由蛋白质构成（如朊病毒）。病毒个体微小，结构简单。病毒没有细胞结构，由于没有实现新陈代谢所必需的基本系统，所以病毒自身不能复制。但是当它接触到宿主细胞时，便脱去蛋白质外套，它的核酸（基因）侵入宿主细胞内，借助后者的复制系统，按照病毒基因的指令复制新的病毒。约75的传染病是由病毒引起的，其中动物病毒是引起人类疾病的重要病原。病毒

5、的结构、酶和复制机制是抗病毒药物的作用靶点，所以抗病毒药物在攻击病毒的同时，往往对宿主产生毒性反应。病毒是一类形态最小，结构最简单的细胞内寄生微生物。病毒利用宿主细胞的酶系统进行代谢活动，其复制周期与宿主细胞的代谢密切相关。植物病毒是一类侵染被子植物、裸子植物和蕨类植物的重要病原微生物。植物病毒种类多、繁殖速率快、传播途径广，并且缺少有效的防治药剂和应对措施，植物病毒病一旦发生流行，就会造成严重的损失。植物病毒病的危害，已经远远超过真菌、细菌病害，而且近些年来由于全球一体化进程的发展，国际商品贸易日趋发达，农产品流通迅速，加快了植物病毒病在世界范围内的传播。植物病毒在全世界范围内引起农作物、果

6、树、花卉、牧草、药用植物的病害，造成产量和品质的下降，严重影响到人类的生产生活。烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是人类最早进行科学研究的一类植物病毒，但因为对其特性了解仍不够充分，只归类到属，没有科的分类。植物病毒病有“植物癌症”之称，是农业生产上重要病害之一。由于植物病毒属绝对内寄生生物，自身无能量代谢系统，对寄主植物细胞具有高度依赖性，因而植物病毒病的防治一直是植物病害防治中的一大难题。为控制植物病毒病造成的危害，人们对其防治进行了许多有益的尝试。烟草花叶病毒病是全世界烟草栽培地区普遍发生的一类病害，也是我国各烟区的重要病害。烟草花叶病流行年份田间发病率一般

7、在30-50，通常受TMV侵染的烟草植株体内代谢会受到严重影响，叶片不均匀地褪绿、枯黄，光合速率下降，这使得植株生长矮小，干物质积累减少，一般年份减产20-30，流行年份则毁种甚至绝收，不仅造成烟草的产量损失，而且使烟叶的质量严重下降，特别是中上等烟叶比例和内在质量下降使得烟草花叶病已成为烟叶优质生产栽培的重大障碍，造成极大的经济损失，挫伤了烟农的生产积极性。由于植物病毒对寄主细胞具有绝对寄生性，以及植物缺乏与动物类似的免疫代谢系统，使得植物一旦被感染就处于终身受害的状态，这给农业生产带来相当大的破坏。因此，控制烟草花叶病的危害已成为当前烟草生产中急需解决的问题。病毒感染是许多传染病和菲传染病

8、甚至癌症的病因，由于其特殊的生存方式，人类在对付病毒性疾病的过程中还没有找到有效的方法。天然产物是研究开发薪药的重要资源，自19831994年间约60被批准应用的抗癌和抗感染药物来源于天然产物“。蓝藻是地球上最早出现的光合自养生物，在长期的演化过程中形成了广泛的适应性。从蓝藻中分离具有不同生物活性的次级代谢产物，并以此为先导化合物进行新药物开发，已引起药学工作者极大的关注。TMV是烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的代表种。该属病毒为正义单链RNA（positiveSENSE single-strandedRNA，+ssRNA）病毒，病毒复制时正链基因组RNA首先复制出负链RNA（neg

9、mive senseRNA，RNA），再以负链RNA为模版产生正链基因组及亚基因组RNA。病毒粒子为刚直的长杆状，长300hm，直径18nm，螺旋对称结构，有2130个蛋白亚基以右手螺旋排列，螺距为23nm，负染色后在电镜下中央轴槽清晰可见。1.3抗病毒活性成分 植物病毒是危害农作物的一类重要病原，因其危害大、防治困难，俗有植物癌症之称。由于植物病毒对植物细胞的绝对寄生性，病毒复制所需要的物质、能量场所等完全由寄主提供，病毒能够胁迫寄主细胞的生化机理，使其与病毒本身的生化机理纠缠在一起难以识别，所以药物难以只对病毒进行选择性攻击而不伤害寄主细胞，导致研究高选择性的化学抗病毒制剂面临极大的困难，

10、至今仍未取得重大突破。对烟草花叶病（Tobacco Mosaic Virus，简称TMV）的防治，国内外已做了大量的研究，特剃是在植物抗病毒基因研究上取得了一系列进展，但是由于远缘杂交的不亲和性，使由抗性基因转移翡难度很大。其次，农业栽培措施壶于受耕作制度和社会经济发展的限制，在生产中有效的实施仍有一定难度，使用化学或生物制剂防治烟草花叶病不失为一种经济有效的措施。现有的药剂菌奇演、宁南霉素、病毒A、病毒必克有一定防效（防效大多在30,-60），但药剂防治效果还不理想。 植物病毒病是影响农业生产的重要因素之一，全世界每年因植物病毒病害所造成的产量损失大约占粮食总产量的10（Fraser，198

11、5）。有效地控制病毒的为害是农业生产上的当务之急。迄今为止，几乎没有能有效地从感染病毒的植物上除去病毒的化学药剂。有些化学药剂（如嘌呤、嘧啶类似物）能减缓病毒的增殖，但无根除之效，而且常常比病毒更易伤害作物。 近年来，植物源抗病毒制剂（生物源农药）由于其高效、低毒、无残留的特点和优势，在植物病毒病害防治过程中发挥出越来越重要的作用。自1925 年Duggur等从商陆（phytolacca）上发现第一个植物病毒抑制物以来14，陆续开发了很多抗病毒制剂，像病毒A、植病灵、金叶宝等。目前研究发现的抗病毒活性物质，既有生物小分子的次生代谢产物，也有大分子的多糖、核酸和蛋白质等。其中蛋白质类活性物质广泛

12、存在于自然界各种生物体内，包括植物、微生物、动物等，最受关注，同时也是研究较多的一类活性物质。 动物病毒广泛侵袭各类动物，对经济动物也不例外，在家禽家畜养殖中屡见不鲜。在如今的抗动物病毒活性成分化合物中，主要都是黄酮类相关的化合物。黄酮类化合物泛指具有15个碳原子（C6-C3一C6）的多元酚化合物，广泛存在于自然界中。按结构可分为黄酮和黄酮醇类、双黄酮类、二氢黄酮及二氢黄酮醇类、查耳酮类、异黄酮类以及其它黄酮类等。许多中草药的抗病毒活性成分都是黄酮类化合物，如从甘草中分离出的黄酮类成分甘草素与异甘草素有很强的抑制艾滋病病毒（HIV）能力，甘草香豆素属于异黄酮类的衍生物，甘草吡喃香豆素等多种甘草

13、黄酮类成分可抑制H1V诱导的巨细胞形成，且未见细胞毒性。自从1993年首次从短叶红豆杉的韧皮部分分离到一株产紫杉醇的内生真菌后，研究者就开始不断地从内生菌中分离出各种活性代谢产物，这其中就包括抗病毒活性代谢产物。 目前临床上常用的药物主要有如下几种：抗流感病毒及呼吸道病毒药物：抗疱疹病毒药物：抗巨细胞病毒药物；抗肝炎病毒药物：抗人类免疫缺陷病毒药物。抗病毒药物的治疗已有近30年的历史，由于病毒进入机体后，模仿宿主的生化机理在宿主细胞内进行复制和繁殖，因此，能抑制病毒繁殖的药物对宿主细胞或机体有不同程度的损害，使得抗病毒药的发展与抗生素相比较为缓慢。到目前为止，尚无令人完全满意的抗病毒药。1.4

14、目的意义在农药的投入上，生物农药的比重越来越小，工业化生产出的化学农药却逐年增加。但是化学农药的大量使用和长期延续，已给人类带来了不利的影响，它不仅严重破坏了人们赖以生存的自然环境，影响了正常的生态循环，还危及到人类的健康。如土壤的严重板结和酸化，既造成农药浪费，又破坏土壤结构，降低农作物产量和品质；还会污染水源，造成江河湖泊水华现象和海洋赤潮；而水的负营养化，对水生动植物的生存造成极大的威胁：地下水与地表水的污染，使农作物的品质下降，严重影响到人类的生存与健康。尽量减少化学农药的使用成为现代农业生产中人们所十分关心的问题。因此如何研究出高效，高质，高优的化学产品，减少化学药品的使用量，采用生

15、物农药，生物防治至关重要。从而在未来的抗病毒，抗真菌，细菌的舞台上，更多的需要依靠生物菌来防治病害，病毒等，这其中最主要的就是放线菌。放线菌在自然界的分布极为广泛, 存在于各种不同的自然生态环境里, 其种类繁多, 代谢功能各异, 是一类有着广泛实际用途的生物资源。放线菌所产生的抗生素能有效地防治人类和牲畜的多种传染性疾病。目前人们在生物体内发现的6 000 多种抗生素中, 约60%来自放线菌, 其中包括许多在医药上有重要作用的抗生素, 因而成为近代抗生素等制药工业的最重要的微生物资源之一。微生物发酵的生产水平最基本的是取决于生产菌种的性能, 但有了优良的菌种之后, 还需要有最佳的环境条件即发酵

16、工艺加以配合, 才能使其生产能力充分表现出来。因此必须研究生产菌种的最佳发酵工艺条件, 如营养要求、培养温度、pH条件、对氧的需求等, 据此设计出合理的发酵工艺, 使生产菌种处于最佳的产物合成条件, 进而取得优质高产的效果。本实验采用抗病毒生防菌F-01菌株，以高氏一号培养基为基础，作为菌株碳氮源及实验环境条件的筛选准则，采取单因素变化，采用梯度实验初步确定最优原料比例和条件。实验过程中，分别用各种单糖代替2%的淀粉选出较优碳源，同理用氮源代替0.1%硝酸钾选出较优碳源，然后用较优碳源和氮源进行正交实验，得到最优碳源，氮源。利用最优碳源，氮源对培养条件进行优化实验。最终得出最适合F-01生长的

17、发酵条件。第1章 材料和方法2.1 实验菌株F-02菌株；F-07菌株；F-12菌株；F-ZH菌株。（实验室保存菌株）2.2实验仪器及试剂 2.2.1实验仪器 精密电子天平，立式电热压力蒸汽灭菌器，数显酸度计，净化工作台，移液枪，锥形瓶，研钵，恒温培养箱，摇床，量筒，冰箱 2.2.2实验试剂淀粉，果糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖，玉米粉，小米粉，大米粉，黄豆粉，蛋白胨，大豆蛋白胨，酪蛋白胨，硝酸钾，硫酸铵，K2HPO4，MgSO4 7H2O；NaCl；FeSO4氯化钾，TMV病毒液。2.3培养基放线菌培养基（高氏1 号培养基）：淀粉（2g）KNO3（0.1g）K2HPO4 （0.05g）M

18、gSO4.7H2O （0.05g）NaCl （0.05g）FeSO4.7H2O （0.001g）水 100mL2.4 实验方法 2.4.1菌株培养方法：以高氏一号培养基为菌株提供生长环境，采用统一规格的锥形瓶（250mL），由于实验过程中才用碳源十种（淀粉，果糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖，玉米粉，小米粉，大米粉，黄豆粉），氮源五种（蛋白胨，大豆蛋白胨，酪蛋白胨，硝酸钾，硫酸铵），在做碳源筛选的时候，分别用所选碳源代替高氏一号中的碳源淀粉；同理，在做氮源的时候，用所选氮源代替高氏一号培养基中的氮源硝酸钾。用精准天平分别称取高氏一号培养基中所需试剂分量，称取完毕后，分别加入100ml的蒸馏水

19、，并将其密封，将培养基放入灭菌框中在立体式电热压力蒸汽灭菌器中灭菌30分钟（120），灭菌完成后，取出灭菌后的培养基，冷却至室温，在超净工作台里将菌株接种培养基中并密封，将接种的培养基放在摇床（28，180rpm）环境下培养7天，7天后取出培养基，在超净工作台中，用移液枪从培养基中取菌液于2ml离心管中，菌液培养完成。 2.4.2 TMV病毒液制作：取症状明显感染TMV病毒的烟草叶片，并称取其质量，将病毒叶放入研钵中，加入少量的石英砂和PBS（Phosphate Buffered Saline ）进行研磨，研磨大概30分钟，按照1g病毒叶配100mLpbs配置病毒液，完成后再加入适量的石英砂（

20、有利于在接种的时候损伤叶片，从而更好的使烟草叶片感染TMV），完成后将病毒液放入冰箱保存。PBS（Phosphate Buffered Saline ）PBS 1L配方pH7.4：磷酸二氢钾（KH2PO4）0.24g，磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g，氯化钠（NaCl）8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，加水至1000mL。 2.4.3 ELISA:酶联接免疫吸附剂测定（ Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay ）：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牽9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一

21、种固相载体聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。2.加样：加一定稀释的待检样

22、品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37孵育0.51小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，371030分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对

23、照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 2.4.4 半叶枯斑法：挑选健康且长势一致的心叶烟，将事先提取的TMV病毒液混匀，并取出适量病毒液，采用摩擦接种的方法，将TMV病毒液接种到心叶烟的叶片上，由于接种损伤叶片，因此接种后叶片会有短暂的萎焉现象，将其放置3-4小时，即待叶片基本恢复正常状态，用毛笔将菌液均匀的涂在接种TMV病毒叶片的左半部分，每种菌液设置重复2-3次，菌液涂抹完成，做好标签，涂上菌液后4-5天统计结果，分别统计叶片左右的病斑数，并算出抑制率，可得出菌液的效果，通过活性得较优碳源，氮源组分。 抑制率=（对照枯斑数一处理枯斑数）对照枯斑数100第

24、2章 培养基优化3.1 菌株优化 3.1.1 菌株培养基：以高氏一号培养基为基础，所选碳源麦芽糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖，果糖代替原培养基中的2%淀粉，制作培养基，通过高温灭菌，冷却至常温，并接种F-02菌株；F-ZH菌株四种菌株在摇床（28，180rpm）中培养七天。3.1.2 活性测定：取出各个培养基中的对应菌液，以半叶枯斑法，采用健康，长势基本一样的心叶烟做活性测定。3.1.3 结果及分析单糖重复2#菌株平均抑制率%重复1重复2左右抑制率%麦芽糖283724302022甘露糖122143152642半乳糖14315510256057葡萄糖2936191606果 糖85827567#菌株7135694734744635312#菌株3323624150401708ZH菌株183203通过五种不同的碳源培养基对4种菌株抗病毒活性测定的结果可以看出，F-02，F-07两种菌株的效果较好。3.2碳源优化3.2.1 菌株培养基：以高氏一号培养基为基础，所选碳源麦芽糖，甘露糖，果糖。葡萄糖，半乳糖，淀粉，黄豆粉，大米粉，小米粉，玉米粉。代替原培养基中的2%淀粉，制作培养基，通过高温灭菌，冷却至常温，并接种F-02菌株；F-07菌株2种菌株在摇床（28，180rpm）中培养七天。淀粉529.5玉米粉38.5小米粉11大米粉黄豆粉2311.5