药用植物的组织培养及其应用Word下载.docx

1、 药用植物组织培养，无性快速繁殖，植物细胞培养系统，细胞全能性Tissue culture of medicinal plants and its applicationAbstract Medicinal plant tissue culture techniques of modernbiotechnology in the field of Medicinal Plant Research and an important part of the application, refers to the control of the sterileand artificial nutriti

2、on and environmental conditions on themedicinal plant organs, tissues or cells Culture for the production ofpharmaceutical active ingredients or medicinal plants asexualpropagation techniques. It can be used for medicinal plant cell growth and differentiation, organ formation and regeneration; to st

3、udy the medicinal plant tissue culture and cell synthesis ofsecondary metabolites of medicinal value, the ability and biotransformation capacity, and their various effects Factors, in order to achieve industrial production by cultured cells of drugpurposes. With the use of resources of medicinal pla

4、nts growingdegree, the number of endangered medicinal plant resources. The face of limited reserves of medicinal plants, how to conducteffective development and utilization of our problems to be solved. This paper reviews the medicinal plant tissue culture, and its basic principle, method in medicin

5、al plant or medicinal active ingredients, the application and prospect production to preserve and reproduce those endangered medicinal materials resources provides a new way. Key words: Medicinal plant tissue culture, Asexual multiply rapidly, Plant cell culture system, Cell faye 目录绪论 11、药用植物组织培养技术及

6、其基本原理 11.1 药用植物组织培养技术 11.2 植物细胞的全能性 21.3植物细胞全能性的实现 22、药用植物组织培养方法 32.1培养基的组成和配制法 4 2.2 培养条件 4 2.3 材料和方法 53、药用植物组织培养的应用 53.1快速繁殖获得药用植株 63.2培育药用植物新种质 63.3 天然药物的工业化生产 63.4 用植物细胞培养系统进行生物转化 73.5 用植物细胞培养进行生物合成的研究 83.6 从细胞培养物中发现新物质 8结论 8参考文献 10致谢 11绪论中华大地，物华天宝，药用植物资源尤为丰富。据1983年开始的全国药用植物普查统计，我国药用植物11146种，居世界

7、首位。我国也是利用药用植物最早的国家之一。2000年前的汉武帝时期，药材生产已初具规模，在长安建立了引种园，张赛出使西域引种红花、安石榴、胡桃等有药用价值的植物到关内栽种，丰富了药用植物种类。明朝李时珍的本草纲目汇集了民间使用植物药的精华，成为药用植物资料的宝库。近代科技水平的不断提高，人类对药用植物的研究更向纵深发展，在医疗保健等方面用药需求量猛烈增加，药用植物的开发利用面临着新的课题。传统的中草药获取方法是以采集和消耗大量的野生植物资源为代价的，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，必然会导致物种濒危甚至灭绝。特别是一些生长缓慢和需要特殊生长条件的药用植物面临绝灭的危险。许多已被国家列为

8、珍稀濒危植物，如海南大枫子、海南粗枉、见血封喉等，还有许多重要的药用植物天然产生极少，已明显供不应求，如天麻、杜仲、贝毋。再有，生态环境的日益恶化，也进一步导致药用植物资源的匮乏。迄今，为解决供需矛盾多采用人工栽培的方法扩大药源。但在人工栽培的药用植物中，有不少名贵药材如人参、黄连等生产周期很长；贝母、番红花等，因繁殖系数小、耗种量大，导致发展速度很慢且生产成本增加；地黄、太子参等，则因病毒危害导致退化，严重影响了产量和品质。研究药用植物资源的再生技术，应用植物组织培养生产药用植物，具有不受地区、季节与气候限制，便于工厂化生产等优势，同时组织培养中的细胞生长速度要比植物正常生长速度快，接近于分

9、生组织的生长速度，因此利用组织培养手段快速繁殖药用植物种苗，或者利用组织培养或细胞悬浮培养手段直接生产药物便随之日益发展。1、药用植物组织培养技术及其基本原理1.1 药用植物组织培养技术药用植物细胞组织培养是在无菌及人为控制的营养（培养基）及环境条件下，对药用植物的器官、组织或细胞进行培养，用来生产药用活性成分或进行药用植物无性系快速繁殖的生物技术，如近年来已大量培养人参组织，并提取有效成分，随着大规模人工培养技术的成功，就有可能用组织培养法来代替全植物提取有效成分。其特点是：（1） 培养条件可以人为的控制和调节。 植物组织培养物完全在人工条件下生长，不受季节、黑夜的影响，不受恶劣气候及虫害的

10、危害，生长条件均一，便于稳定地进行全年培养生产。（2） 生长周期短、繁殖率高。 根据不同外植体提供不同的培养条件，以使其能按几何级数大量生产，一般的生长周期为1个月2个月。（3） 节省人力和物力。植物细胞组织培养是在人为提供的一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件严格控制下进行的科学培养生产，可以大大节省人力、物力及土地而且有利于自动化控制生产。1.2 植物细胞的全能性药用植物组织培养所依据的理论是细胞的全能性。该理论是Schleiden和Schwan分别在1838年和1839年的细胞理论中提出的，即离体细胞在生理上、发育上具有潜在的“全能性”。这一理论阐明了一个植物体内所有活的细胞，在一定

11、的离体条件下可以逐步失去原有的分化状态，转变为具有分化能力的胚胎细胞，再增殖而分化成完整植株的潜在能力。此理论经过一个世纪的发展，已逐步完善，并对其理论实质及实现途径有了更加清晰的认识，也得到了广泛的证实。现在所认为的细胞的全能性是指植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和发育成一个完整植株的潜在能力。一个已分化的细胞或组织若要表现其全能性，一般要经历两个过程，即脱分化和再分化。所谓脱分化是指植物离体的器官、组织、细胞在人工培养基上，经过多次细胞分裂而失去原来的分化状态，形成无结构的愈伤组织或细胞团，并使其回复到胚性细胞状态的过程。脱分化的难易与植物的种类、组织和细胞的状态有关。一般单子叶植

12、物和裸子植物比双子叶植物难；成年细胞和组织比幼年细胞和组织难；单倍体细胞比二倍体细胞难。所谓再分化是指离体培养的植物组织或细胞可以由脱分化状态再度分化成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至最终再生成完整的植株的过程。在植物组织培养过程中，切取的植物组织、器官和细胞，在人工培养条件下，可促进脱分化，产生愈伤组织，然后经过继代培养，通过人工控制又可产生分化。这种原已分化的细胞，经脱分化培养后再次进行分化的现象被称为再分化。在有些情况下，再分化也可不经过愈伤组织阶段，而直接进行器官分化形成完整植株。1.3植物细胞全能性的实现具有全能性的细胞大体上分为3类，即受精卵（合子），发育中的分生组织细胞，

13、雌、雄配子及单倍体细胞。全能性的实现有3个循环，其中A循环表示生命周期，它包括了孢子体和配子体的世代交替。木本植物经常用无性繁殖方法保持遗传的稳定性。通常幼年型树比成年型树更容易繁殖。B循环是表示细胞所决定的核质周期，由于核质的互作，DNA复制、转录并翻译形成蛋白质，使全能性得以形成和保持。C循环是组织培养周期，组织和细胞与供体失去联系，在无菌的条件下，靠人工的营养及激素条件进行代谢，使细胞处于异养状态。在这种情况下一个分生组织可通过如下3个途径实现细胞的全能性。（1） 分生组织直接分生芽而达到快速繁殖的目的 茎尖培养时先从茎尖长出小芽，再从芽的叶腋内由芽原基再长出小芽，腋芽不断形成又不断萌动

14、，形成丛生芽。以这种方式增殖的芽，极少发生体细胞无性系变异，遗传性状较稳定。（2） 由分生组织形成愈伤组织，通过愈伤组织再分化实现细胞的全能性 根、茎、叶和花器官等外植体不直接形成器官，而是已分化的处于静止状态的细胞经激素诱导后使之活力增强并开始分裂，细胞数目激增形成较匀质的薄壁细胞组成的结构松散的愈伤组织。不断更换新鲜培养基可维持愈伤组织的生长，并可通过继代培养大量扩增愈伤组织。一旦改变培养条件，在适合的激素浓度和配比及温光条件下，愈伤组织细胞发生生理代谢上的改变，促使细胞分裂部位和方向改变，首先出现分生细胞，经细胞分裂逐渐形成分生细胞团和分生组织，进一步分化形成维管结节直至芽和根等器官。（

15、3） 游离细胞或原生质体形成胚状体，通过胚状体再生植物 这一途径是在外植体产生了类似但不同于合子胚（由生殖细胞发育而来）的体细胞胚（somatic embryo），也叫做胚状体。它可来自成熟的植物根、茎、叶、花等的细胞，也可来自花药壁及未成熟的幼穗等。胚状体的形成可通过愈伤组织途径，也可不经过脱分化直接从子叶和下胚轴部位形成。胚状体的发育顺序与受精卵发育极为相似，经过原胚球形胚心型胚鱼雷胚子叶胚5个时期，最后发育成完整的小植株。2、药用植物组织培养方法目前药用植物组织培养的应用主要有2个方面:一是利用试管微繁生产大量种苗以满足药用植物人工栽培的需要;二是通过愈伤组织或悬浮细胞的大量培养，从细胞

16、或培养基直接提取药物，或通过生物转化、酶促反应生产药物。药用植物的有效成分一般都从植物体提得，其产量和质量难免要受到植物的遗传性、生长条件、收获时间及贮藏和运输等因素所影响，如果能采用类似培养微生物产生抗菌素的方法生产有效成分，就可克服这些缺点，这对生长条件要求严格、生长缓慢、产量低、价值贵重的植物药更有意义。这项工作自20世纪50年代后期至今已取得了很大的进展。 我国的科技工作者在药用植物组织培养方面已取得了巨大的成绩，组织培养技术水平也在不断进步:如培养方法已从固体、液体、悬浮培养，及深层大罐发酵发展到液体连续培养;培养材料也从利用药用植物的根、茎、叶、花、胚、果实、种子等组织或器官诱导出

17、的愈伤组织或冠瘿组织，一直发展到目前的细胞培养技术。2.1培养基的组成和配制法近年来用于药用植物组织培养的化学合成培养基大致由6种成分组成：糖类，多种无机盐类，微量元素，氨基酸、酰胺、嘌呤，维生素，生长素。此外，有些培养基还可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麦芽浸出液等，培养基中如加入0.51的琼脂即为静止培养的固体培养基，否则为悬浮培养的液体培养基。不同植物材料常需要改变配方，如维持生长和诱导细胞分裂和分化的培养基配方就不同，因此配方的种类很多，目前以Ms培养基配方为最常用的一种基本培养基，它利于一般植物组织和细胞的快速生长，它是快速繁殖与脱毒培养中应用最广泛的培养基。总之

18、，在进行组织培养研究时应根据研究目的和培养植物的种类来确定培养基的组成，除营养、诱导作用外还应当注意离子平衡和毒性问题，如水一般都采用重蒸馏水，无机盐类一般都需用化学纯的药品，pH值可用1N KoH（或NaOH）溶液和2N HCl调整。有时可以用普通药品代替，但须注意这些药品不仅应有营养价值，还须无毒。如果在工业上使用大缸深层培养细胞或组织生产有效成分和生物制品、应用培养基的量将要以吨位计量时，则采用什么代用品较为经济实用更应慎重考虑。2.2 培养条件 （1）温度 对大多数植物组织2028即可满足生长所需，其中2627最适合。 （2）光 组织培养通常在散射光线下进行。光的影响可导致不同的结果。

19、有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根。有些次生物质的形成，光是决定三因素。（3）渗透压 渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常12个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。（4）酸碱度 一般植物组织生长的最适宜pH为565。在培养过程中pH可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。（5）通气 悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌

20、作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。2.3 材料和方法 药用植物快速繁殖的基本方法是将植物的根、茎、叶、叶柄、花、腋芽、顶芽等为外植体放在人工合成的培养基上进行无菌培养，通过丛生芽、微型扦插、原球茎、球茎芽、块茎发生、鳞茎发生和胚状体等形式再生形成完整植株。其过程分为无菌培养物的建立、芽的增殖、诱导生根等3个阶段。一种植物能否通过组织培养进行大量快速繁殖，关键在于设计和选用合适的培养基，使每个分生组织细胞或脱分化的体细胞能够持续。快速繁殖要选择种质优良、植株健壮、时期合适、大小适宜的外植体性状优良的种质，有利于提高成功的机率，增加其实用价值。从低等的藻类到苔藓、蕨类、种子植物等高等植物

21、的各类、各部分都可采用作为组织培养的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韧皮部细胞，被子植物采用胚、胚乳、子叶、幼苗、茎尖、根、茎、叶、花药、花粉、子房和胚珠等各个部分。由于植物在自然条件下，表面常被霉菌和细菌污染，故材料必须进行灭菌处理。一般用漂白粉溶液（110）、次氯酸钠溶液（0.510）、升汞溶液（0.01）、乙醇（70）或过氧化氢（310）等处理后，再用无菌水反复冲洗至净，然后在无菌室内，将所取的组织迅速培养在固体培养基上。在适宜的条件下，受伤组织切口表面不久即能长出一种脱分化的组织堆块，称为愈伤组织。 在适宜的培养条件下，还可使愈伤组织长期传代生存下去，这种培养称为继代培养。但在继代培

22、养中，不少植物培养的组织或细胞随着再培养代数的增加，分化能力就逐渐降低甚至丧失，其原因可能是由于在培养过程中原有母体中存在的、与器官形成有关的特殊物质被逐渐消耗所致，因此可以用激素或改善营养条件使之恢复，也有认为是组织和细胞在长期培养中遗传往的改变，这种改变恢复的可能住较小。不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度，结构也可松可紧，利用这些特性可使之分散成为单细胞或很小的细胞团。要形成单细胞培养宜在较高盐分、高生长素及高水解酪蛋白的培养基中进行，然后移入液体并经搅拌而分散成单细胞。芽的增殖主要受培养条件的影响，如培养基的营养成分、植物激素、培养温度和光照等，需要根据不同植物进行调节，筛选出

23、最适宜的培养条件。其中植物生长调节物质对愈伤组织诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用，是培养基中不可缺少的关键物质。不同的植物生长调节物质及其浓度对植物组织培养有不同的影响。3、药用植物组织培养的应用3.1快速繁殖获得药用植株 我国经离体培养获得试管植株的药用植物有金线莲、白岌、番红花、铁皮石解、绞股蓝、苦丁茶、南洋金花、海巴戟等100余种，其中大多数为珍贵的药用植物。培养的药用植物从常见的到珍稀濒危植物、民族植物，如云南黑节草、延龄草、高山红景天，藏药川西璋芽菜、获术、水母雪莲、星花乡线菊、溪黄草、玉叶金花、辽东葱木等。从生产常用药的植物到具有抗癌、抗病毒等有效成分的植物，如红豆杉、艾黄杨

24、、狼毒、大戟属、长春花、米仔兰、狗牙花和香框等。利用组织培养法每年可繁殖出几万至数百万倍的小幼苗，如苦丁茶每株试管苗每次继代培养繁殖5倍，按平均每40d切割继代1次汁算，每年可继代9次，每株苗理论上可繁殖出将近200万株苗。因此，组织培养对于因病毒病害严重影响产量和质量的药用植物、靠有性繁殖提供种子，而种子发育不完善或种子成本高的药用植物，靠无性繁殖提供种子。无性繁殖系数低且种子需求量大的药用植物、濒危或濒危药用植物的引种驯化与保护植物资源等具有重要的科研和生产意义。3.2培育药用植物新种质 应用离体器官培养、单倍体培养和原生质体融合技术，可以得到无性繁殖种苗、体细胞杂种植物、单倍体植株和无病

25、毒植株，对保存优良种质，培育新品种和进行珍贵、稀有药用植物的快速繁殖有重要意义。许多植物在自然生长环境往往患有病毒，且代代相传，严重影响中药材的产量和质量。可选用健康无病毒的植物组织进行培养，可培养出无病毒的药用植物品种。目前利用单倍体和多倍体培养育种技术培育得到新品种的药用植物有党参、黄蔑、丹参、构祀、薄荷等，其中部分品种已产生了可观的经济效益。原生质体培养在药用植物上的应用相对滞后。从目前的研究进展来看，构祀、峨参、决明、防风、人参、龙胆、绞股蓝、川芍、前胡等已实现了以原生质体培养获得愈伤组织或再生植株。黄花烟草叶片愈伤组织和宁夏构祀下胚轴愈伤组织培养分离获得原生质体并进行融合，实现了远缘

26、遗传物质交流，获得杂种小苗。3.3 天然药物的工业化生产 利用植物组织或细胞的大量培养直接生产药物的研究也取得了很大进展。目前从各种培养物中产生的药用成分已有200余种。其中药用成分含量超过或等于原植物的有30余种，包括人参皂昔、三七皂昔、甘草甜昔、甜叶菊贰、柴胡皂昔、薯茨皂昔、川芍嗦、地高辛、a一甲基地高辛、熊果昔、蓑若碱、东蓑若碱、烟碱、小巢碱、萝芙木总碱、总异黄酮化合物、哈尔明、葱醒、柴草宁、迷迭香酸、胰岛素、辅酶Q-10、L一谷氨酞胺、L一色氨酸、蛋白酶抑制剂等。日本进行了人参培养细胞工业化生产，其提取物与人参提取物几乎相同。油麻藤悬浮培养生产的L-多巴，产率较高，较化学合成的光学纯度

27、高，也不受微生物法只能将结构相近的前体转变为L-多巴的局限性。目前的研究着重在以下几方面：培养技术的改进，如从实验室培养过渡到大量培养或连续培养，不断提高细胞的生长速率以适应工业生产的需要；次生代谢调节的研究，如改变培养条件，用生物化学或遗传学的手段筛选和保持高产细胞株系，调节次生代谢物生物合成的类型和速率，提高生产效率；降低生产成本的研究，应用细胞工程、发酵工程等生物技术进行综合研究以降低生产费用，提高经济效益。3.4 用植物细胞培养系统进行生物转化药用植物组织培养不仅可以作为生产有用次生代谢产物的资源，而且还具有转化培养液中外源性底物的能力。依靠植物将特殊物质转化为更有效的生理活性物质，比

28、用微生物和化学合成更容易实现某些化合物化学结构的特殊修饰。如南洋金花悬浮培养物对酚有糖基化作用，使酚类药物的有效性显著增强。毛曼陀罗的培养细胞能快速将氢醒转化为熊果昔，使后者在作为利尿剂和泌尿器消毒剂时所用剂量减少，疗效提高。因此，可以利用植物细胞培养系统作为生物反应器，把廉价、活性较低的次生代谢物转化为稀有、具有较高药用价值的物质加以利用。培养的植物细胞能够进行如下反应：环氧化、氧化、酯化、糖基化、异构化、甲基化、羟基化、脱甲基、双键还原、引入羰基和醛基。 植物细胞进行生物转化的利用有两个方面： 使用培养植物中不存在的物质作底物，以得到具有新的结构和生物学特性的化合物。将某一植物原有的、含量

29、高但药用价值不大的化合物转变为药用价值高的化合物，如烟草的培养物能将蒂巴因脱甲基而形成吗啡。用植物细胞进行生物转化，尤其适用于微生物法和化学方法难于转化的化合物。生物反应器是组织培养走向产业化、商业化的基础,利用生物反应器大量培养植物细胞，生产植物次生代谢产物在技术上是可行的，但目前在商业上获得成功的只有紫草宁和人参皂昔。近年来，气升式生物反应器的发明与应用，使药用植物细胞的大规模培养生产药用成分成为可能。如从喜树茎段愈伤组织培养生产喜树碱；从苦瓜的细胞培养生产类胰岛素；从紫草细胞培养生产紫草素;从日本黄连细胞培养生产小聚碱；从毛花洋地黄细胞培养生产洋地黄贰丙和地高辛，从红豆杉细胞培养生产紫杉

30、醇；从长春花的细胞培养中生产长春碱和长春新碱;从人参属的人参、西洋参、三七中提取人参皂贰和人参多糖；从雷公藤的细胞培养生产治疗类风湿关节炎的雷公藤甲素等等。3.5 用植物细胞培养进行生物合成的研究 培养的植物细胞在代谢速率和发育阶段上都比较均一，且不受气候、土壤的限制，是进行生物合成研究的适宜系统。植物细胞培养还给无细胞系统和酶学研究提供良好条件。如从长春花吲哚生物碱生物合成的研究，基本弄清了生物合成的主要步骤。3.6 从细胞培养物中发现新物质组织培养物能合成和积累某些原植物中没有发现的物质，可望成为获得新的生物活性物质的一个来源。如芸香组织培养物中的芸香素（rutacultin）和穿心莲组织培养产生的内酯A、B、C都是原植物中不含的化合物;酸藤果属植物的培养物具有抗微生物作用，细胞中生成的棓酸乙酯是其有效成分;长春花愈伤组织不仅能治愈鸡的球虫病，而且是耐各种合成药的艾美虫属致病原虫的强力预防剂。结论药用植物组织培养的工业化已进人试验阶段，并逐步生产出适用于植物工业化生产的玻璃或不锈钢生物反应器。在合成药物成功率低的情况下，从组织培养中筛选药物，开辟了新途径。我国和其他国家已将人参的组织培养过渡到工业化生产。目前我国学者已建立了三七、人参、西洋参、紫草、长春花、丹参、红豆杉等10余种药用植物的液体培养系统，经过