海南大学生物科技文献方法学及论文写作课程论文Word文档下载推荐.docx

1、电话电子邮箱传真国别或地区个人通讯地址工作单位主要研究领域食品生物化学依托单位名称联系人杨教授 XXXXXX网站地址合作研究单位名称项目基本项目名称甘薯sporamin胰蛋白酶抑制剂活性影响机制及其抗肿瘤作用的研究英文名称Study on the influence mechanism of sweet potato Sporamin trypsin inhibitor activity and its anti tumor effect资助类别面上项目亚类说明自由申请项目附注说明申请代码B0608:生物化工与食品化工基地类别农产品加工部门研究期限2016年1月2017年12月研究方向应用基础

2、研究申请经费30.0000万元中文关键词甘薯；Sporamin；胰蛋白酶抑制剂；分子结构；肿瘤英文关键词Sweet potato; Sporamin; trypsin inhibitor; molecular structure; tumor 纸质文件与电子版版本号必须保持一致中文摘要（限400字）：甘薯Sporamin占甘薯可溶性蛋白的80%，属Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（KTI），并具有较强的胰蛋白酶抑制剂活性。目前已有研究表明，KTI有抑制肿瘤细胞浸润转移的作用，因此Sporamin很有可能成为一种植物来源的抗肿瘤药物。然而，国内外对Sporamin胰蛋白酶抑制剂活性调控机制及其抗肿瘤

3、作用的研究还处于空白阶段。本研究拟首先从甘薯淀粉加工废液中提取和纯化Sporamin，然后通过研究不同温度、压力和pH等外部因素变化对其分子结构及活性的影响，阐明Sporamin分子结构对胰蛋白酶抑制剂活性的影响及其相互关系，探索调节Sporamin活性强弱的物理或化学方法。最后以人卵巢癌细胞HRA体外侵袭的方法进行生理学试验，检测不同活性强度的Sporamin对肿瘤侵袭转移的抑制作用的效果。本研究不仅符合科学发展的趋势，还具有广阔的应用前景。英（限3000 characters）:Sweet potato sweet potato soluble protein Sporamin accou

4、nted for 80%, belong to Kunitz type trypsin inhibitor （KTI）, and has a strong activity of trypsin inhibitor. At present, studies have shown that, KTI can inhibit the invasion and metastasis of the tumor cells function, so Sporamin may become a kind of antitumor drugs of plant origin. However, the do

5、mestic and international study on Sporamin trypsin inhibitor activity regulation mechanism and its anti tumor effect is still in the blank stage.This study first from the waste liquid of sweet potato starch processing in the extraction and purification of Sporamin, and then through the changes of th

6、e external factors of different temperature, pressure and pH effect on the molecular structure and activity of Sporamin, clarify the effect of the molecular structure on the trypsin inhibitor activity and its relationship to explore the regulation of Sporamin activity, the strength of the physical o

7、r chemical methods. Method and finally to human ovarian cancer cell HRA in vitro invasion of physiology experiment, detection of different active strength of Sporamin invasion and metastasis of tumor effect. This study is not only in line with the scientific development trend, but also has broad app

8、lication prospects.项目组主要成员 （注：项目组成员不包括项目申请者，杰青、优青项目不填写此栏。）编号姓 名 电子邮件项目分工1刘来1964.12.17研究员博士0898XXXXXXeric66蛋白结构分析 5 2杨玉1957.01.30副研究员硕士蛋白分离提取纯化实验 3魏莲1976.05.02女讲师学士外部因素影响实验 8 4吴问1976.06.06抗肿瘤细胞实验 5黄皇1974.05.226张萍1973.01.217毛冒1984.02.128云仙1983.07.21巯基及二硫键含量测定 9总人数高级中级初级博士后博士生硕士生说明：高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生

9、人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。经费申请表 （金额单位：万元）科目备注（计算依据与说明）一、研究经费24.00001. 科研业务费15.0000（1） 测试/计算/分析费10.0000甘薯sporamin的提取、纯化、胰蛋白酶抑制剂活性及结构测定、细胞试验等费用（2） 能源/动力费1.5000（3） 会议费/差旅费2.0000参加国内学术会议1年12次（4） 出版物/文献/信息传播费发表论文、专著、申请专利、检索和复印等（5） 其它2. 实验材料费8.5000（1） 原材料/试剂/药品购置费购买细胞和试剂盒、甘薯原材料、蛋白标样、活性测定所用生物试剂、血清、耗材等。（2） 其它3. 仪

10、器设备费0.0000（1） 购置（2） 试制4. 实验室改装费0.5000必要设施的适应性改装5. 协作费二、国际合作与交流费3.00001. 项目组成员出国合作交流2. 境外专家来华合作交流1人次三、劳务费四、管理费1.0000项目依托单位组织和支持项目研究的费用合 计30.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计签字和盖章页 申请者： 依托单位：项目名称：资助类别：面上项目 亚类说明：自由申请项目 附注说明：申请者承诺： 我保证申请书内容的真实性。如果获得基金资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实

11、保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。 签字：项目组主要成员承诺：我保证申报内容的真实性。如果获得基金资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担全部责任。工作单位名称签 字依托单位及合作单位承诺：已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守国家自然科学基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组成员以

12、及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规定及时报送有关材料。依托单位公章 合作单位公章1 合作单位公章2 日期： 日期： 日期：报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）（基础研究需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；应用研究需结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。我国是甘薯生产大国，产量仅次于主要农作物水稻、小麦和玉米，占世界总产量约80%左右。我国甘薯加工主要是生产淀粉、粉丝等初级产品。甘薯淀粉和粉丝加工过程中产生大量的废液1，废液中甘薯可溶性蛋白Sporam

13、in具有较强的胰蛋白酶抑制剂（TI）的活性，TI在人体内的很多生理系统中起关键性的调控作用，是维持体内环境稳定的重要因素。随着我国人民生活水平的提高，饮食结构的改变，肿瘤的发病率逐年上升。2000年全国死于肿瘤的居民达到140余万,占慢性病死亡者总死亡人数的19.3%。目前，我国每年用于癌症患者的医疗费用近千亿元。疾病不仅给患者个人、家庭及社会造成了沉重的经济负担。如任其继续发展和蔓延，将会直接威胁到社会的和谐与稳定2，3。而由于已有研究证实与Sporamin具有同源性Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制剂，具有抗肿瘤的功效4，5，6，7，所以，甘薯Sporamin胰蛋白酶抑制剂极有可能也具有抗肿瘤

14、功效。因此，开展对甘薯蛋白Sporamin提取、纯化，以及胰蛋白酶抑制剂活性影响机制及抗肿瘤效果的研究，开发新型抗癌药品或保健产品，不仅为解决甘薯淀粉加工所造成的环境污染开辟一条新途径；还缓解了癌症给医药卫生系统和个人所带来的沉重经济负担，对建设我国社会主义和谐社会具有十分积极的意义。1.1 甘薯Sporamin的结构及其胰蛋白酶抑制剂活性 甘薯Sporamin的结构1931年Jones和Gersdoff首先从甘薯块根中分离出一种盐溶蛋白，并将其命名为Ipomoein8。1985年Maeshima等发现一种主要存在于甘薯块根中的蛋白，其占块根可溶性蛋白质的60%-80%，而其它器官中则几乎没有

15、，并将其命名为Sporamin9。在1989年，Debora和Wanda研究表明，以上两种蛋白实际上是一种25kDa蛋白质10。Sporamin是一个球形蛋白，其一级结构由约229个氨基酸残基构成，其中分子内第45和第94半胱氨酸（Cys45-Cys94）、第153和160半胱氨酸（Cys45-Cys94）之间存在着两组S-S键联结，在非还原条件下，甘薯可溶性蛋白存在着由S-S键联结的三种不同分子量的分子异构体11。Maeshima等还发现水溶性甘薯蛋白在非还原的条件下能被分为sporamin A（22KDa）和sporamin B（31KDa）两种不同的蛋白，Sporamin A的含量是Sp

16、oramin B的两倍。Sporamin A中赖氨酸氨基酸评分为77，Sporamin B中蛋氨酸氨基酸评分为55。因此，对比于Sporamin B，SporaminA是氨基酸更加平衡的一种蛋白质。 甘薯Sporamin的胰蛋白酶抑制剂活性胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor ，TI）泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的一类物质，可以分为两大类：其中一类为Browan-Birk型抑制剂（BBTI），另一类为Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（KTI），这两类抑制剂均属典型丝氨酸蛋白酶抑制剂12。TI普遍存在于动物、植物及微生物体内，另外还有很多人工合成的，如甲磺酸胍己苯脂（Gabesate

17、mesyl）等。Yeh等人对比用胰蛋白酶抑制剂亲和层析从甘薯块根中得到的胰蛋白酶抑制物和通过大肠杆菌表达的Sporamin，证明从块根纯化出的胰蛋白酶特异的抑制物就是Sporamin 4，13。 还有研究表明，编码Sporamin蛋白质的基因与KTI型大豆胰蛋白酶抑制剂和杨树中受伤反应基因具有很高的同源性20，并且具有胰蛋白酶抑制剂的活性和受伤诱导表达的能力15。转入Sporamin基因的烟草、芸薹植物，不仅能够提高自身的胰蛋白酶抑制剂的活性，还能提高植株的抗病性和抗虫性16，17，18。1.2 甘薯胰蛋白酶抑制剂研究现状及存在的问题 目前多数已开发的TI来源于人和动物，如从牛肺或牛胰中提取的

18、抑肽酶（Aprotinin）、从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂（Urinary trypsin inhibitor，UTI）等，但它们一般分子量较大，结构复杂，对其提取分离、研究合成、及进一步开发都存在着很多困难。而且它们在发挥治疗作用的同时也存在诸多的不足之处，如易受到病原微生物（如病毒等）的污染，分子量较大，易引起过敏反应等。而植物TI的分子量一般较小，在自然界中的来源非常丰富，活性位点和作用机制类似，对胰蛋白酶、纤溶酶、血浆激肽释放酶、凝血酶、凝血因子Xa、凝血因子XIIa等都具有较强的抑制作用19。可以克服上述不足，因此，人们将目光转向了品种繁多的植物。并已从多种植物组织中发现并提取出

19、了TI，如大豆胰蛋白酶抑制剂（Soybean trypsin inhibitor，SBTI）、南瓜胰蛋白酶抑制剂（Cucurbita maxima trypsin inhibitor，CMTI）等20-24。而关于从甘薯中提取的Sporamin，这种胰蛋白酶抑制剂，也有一些报道。外部因素对甘薯胰蛋白酶抑制剂活性影响 处理温度对甘薯TI活性的影响处理温度的变化对甘薯TI活性的影响较大。烤甘薯和煮熟的甘薯TI活性会完全丧失 25。甘薯TI在70条件下还具有热稳定性，而130条件下保持30min能完全破坏鲜薯中TI的活性26 2 生长条件甘薯TI活性的影响甘薯生长的季节、累积降水量、地理位置、施肥与

20、否的不同，会导致甘薯TI活性的不同27，28,29。3 粗蛋白含量与TI含量有关TI含量与甘薯中可溶性蛋白之间有低的正相关性30。结构变化对TI活性的影响目前有Sporamin结构对TI活性影响的研究，研究发现，I型Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂（KSTT）与BowmanBirk大豆胰蛋白酶抑制剂的TI活性差别与其二级结构差异有关。它们对胰蛋白酶的抑制作用是一种非竞争性抑制作用。当用65%振幅的超声波场处理20min后，其转角和无规卷曲的含量分别下降至10.8%和54%,而折叠的含量则增加至35.2%,同时有约71.5%的二硫化键转变成巯基,这些结构的变化导致胰蛋白酶的抑制活性降低了55%31

21、，32。存在的问题尽管我们已知一些外部因素的变化能导致Sporamin结构的变化，并最终能影响胰蛋白酶抑制剂活性强弱。但对外部因素如不同加热温度对Sporamin结构及其胰蛋白酶抑制剂活性的影响的研究仍缺乏系统性，而压力的变化的研究则仍属于空白。特别是巯基与二硫键的互换反应对Sporamin胰蛋白酶抑制剂活性影响规律还不明晰，是否可以通过化学修饰如添加一些化学试剂来促进或阻碍巯基与二硫键的互换反应，从而达到增强或减弱对Sporamin胰蛋白酶抑制剂活性的目的也仍然是一个谜。1.3 胰蛋白酶抑制剂在抗肿瘤方面的研究现状及存在的问题 胰蛋白酶抑制剂可抑制肿瘤细胞的浸润转移肿瘤细胞的浸润转移是肿瘤的

22、恶性特征之一，是大多数实体瘤患者死亡的主要原因。其中，肿瘤细胞分泌蛋白酶对细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的溶解是肿瘤浸润转移过程中的关键步骤。纤溶酶（Plasmin）在这个过程中起重要作用，它是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白水解酶，当被纤溶酶原激活因子（Plasminogen activator，PA）特异性地激活后,就转化为有活性的纤溶酶33。但是，肿瘤细胞不仅分泌蛋白酶，还分泌抗蛋白酶（Anti-proteases）来防止对ECM的过度水解及细胞间连接的脱落。例如，PA的特异性抑制剂PAI-1就能使培养液中PA的净含量和明胶裂解活性下降，从而抑制细胞外的蛋白水解过

23、程34，35。在细胞培养体系中，PA的活性还受许多生长因子和细胞因子的调控36。比如，如果培养液中存在转化生长因子1（TGF-1），则即使其中的PAI-1水平很高，也能使PA的净含量和细胞膜上的明胶裂解活性升高，引起某些局部位点（如细胞-细胞或者细胞-细胞外基质接触处）出现很强的蛋白水解活动。这提示我们，肿瘤的侵袭最终依赖于对细胞外蛋白水解活动的调控37，而促蛋白水解系统和抗蛋白水解系统之间的平衡是控制肿瘤细胞浸润和转移过程中的关键38。因此，能够抑制PA系统信号传导的物质将有可能成为一种抗癌药物，胰蛋白酶抑制剂（TI）就是其中一种。研究证明,尿胰蛋白酶抑制剂对乳腺癌细胞降解细胞外基质和小鼠L

24、ewis 肺癌的转移有明显地抑制作用39。牛肺胰蛋白酶抑制剂对B16 黑色素瘤实验性肺转移和小鼠Lewis 肺癌转移具有很强的抑制作用，与化疗药物配合使用抑制效果更佳40，大豆胰蛋白酶抑制剂被发现具有抑制乳腺癌增生和转移的作用。因此，甘薯蛋白Sporamin很可能与其它KTI一样，具有抑制肿瘤浸润转移的作用。 甘薯Sporamin虽已证实是一种植物胰蛋白酶抑制剂，同时编码Sporamin蛋白质的基因与KTI型大豆胰蛋白酶抑制剂具有同源性。但是其是否也和大豆胰蛋白酶抑制剂一样具有抑制肿瘤浸润转移的作用还有待于实验证明。而且胰蛋白酶抑制剂活性强弱对肿瘤浸润迁移的抑制效果及其机理的研究还需要进一步研

25、究和探索。1.4 本项目的研究目的（1）通过研究外界因素变化对Sporamin分子结构及其胰蛋白抑制剂活性的影响，从分子水平上揭示外界因素对胰蛋白抑制剂活性的影响规律，以及Sporamin分子结构变化与胰蛋白抑制剂活性相互关系。（2）通过巯基与二硫键的互换反应对Sporamin胰蛋白酶抑制剂活性影响规律的研究，找出调节Sporamin胰蛋白酶抑制剂活性的物理或化学方法。（3）研究具有TI活性的Sporamin对抑制肿瘤浸润转移的作用，揭示不同TI活性Sporamin对肿瘤浸润转移的抑制效果。1.5 本项目研究的科学意义基础研究意义 本项目不仅弥补了有关甘薯Sporamin研究的部分空白，还涉及

26、生物化学、细胞学和医学等研究领域，在分子水平上，研究了甘薯Sporamin分子结构与胰蛋白酶抑制剂活性强弱间的关系及其对肿瘤细胞浸润转移的抑制作用。属于一项多学科交叉领域的研究，对推进科学研究的发展，促进各学科之间的融合渗透有着积极作用。符合科学发展的趋势，具有深远的意义。应用研究意义 本项目中甘薯Sporamin是从甘薯淀粉加工厂的废液中提取得到的，这不仅能缓解甘薯淀粉加工产生的废液对环境的污染，还有助于开发新型抗癌药品或保健产品，缓解癌症对医药卫生系统和个人所带来沉重的经济负担。因此，本项目成功地实施将为促进国民经济的发展作出贡献。此外，废液对环境的污染和新型抗癌药品开发，都是当前镇整个社会发展中迫切需要解决的关键科技问题，具有广泛的应用前景。参考文献1） 王国扣.薯类淀粉产的废水特性及处理方法.淀粉与淀粉糖，（4）：40-44.2） 全国政协教科文卫体委员会，中国癌症基金会，癌症的科学与实践，3） 中华人民共和国卫生部疾病预防控制局,中国疾病预防控制中心,中国慢性病报告,2006,05, 4） Yeh K W, Chen J C, Lin M L. Functional activity of sporam