分子生物学实验讲义Word文档格式.docx

1、106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、实验目的1掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。2了解制备原理及各种试剂的作用。三、实验材料和试剂材料：大肠杆菌E.col

2、i，含pBR322质粒。试剂：1. LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH调pH至7.3左右。如固体培养基则添加15g/L琼脂。2. 溶液（pH8.0G.E.T缓冲液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。灭菌后存放。3. 溶液（0.2mol/LNaOH（内含1SDS）：预先配制1SDS母液，临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH，4保存。4. 溶液（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。5. 酚/氯仿液（V/v1/1）：酚为重蒸酚，配制

3、时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl （pH7.6）抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01 mol/LTris-HCl（pH7.6），4保存。6. 无水乙醇7. 70乙醇8. pH8.0 TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20g/mL。仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管（1.5mL微量离心管）、加样器（20uLlmL）、吸头。四、操作步骤（一）培养细菌将带有质粒pBR322的大肠

4、杆菌接种在含50g/mL氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基中，37振荡培养过夜。注意：添加Amp时，须待LB培养基冷却到50左右方可加入。（二）从菌落中快速提取制备质粒DNA1取1.4mL菌液置于1.5mL Ep管中，7500rpm离心1min。实验原理：粗提细菌。2弃上清，加入150L GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。溶解沉淀的细菌（由于细菌外有多糖细胞壁，溶液中的葡萄糖使细菌更容易分散在溶液中）3加入200L新配制的0.2mol/L NaOH（内含1SDS），加盖，颠倒（不要振荡）23次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。含有的NaoH和SD

5、S去污剂，破坏细胞结构和讲解RNA的作用，质粒释放到溶液中，碱使染色体DNA双链解开，环状断裂成线状。PH恢复中性时无法成环，与蛋白质一起沉淀。质粒可以恢复。故在上清液中。时间过长质粒不可逆的变性。4加入150L冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。中和碱性，停止降解，使SDS与大分子DNA和蛋白质一起沉淀。颠倒时应柔和操作，防止DNA是线性，断裂会污染质粒。54，10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离心一次。分离在下层的DNA和蛋白质，取出在上层的质粒。6于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4，12000rp

6、m离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。除去其他分子量较小的杂蛋白和其他杂质。7向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置min。用离心机于10000rpm离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。除去水溶液中的酚和氯仿等 8用0.5mL 70乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥（将离心管倒置于一张纸巾上），备用。洗涤沉淀，去除盐类等溶于水的物质。9用25uL含无DNA酶的胰RNase（20 ugmL）的TE重新溶解DNA，置于4保存，供下午电泳使用。贮存于-20备

7、用，可长期保存。五、注意事项1收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。2在添加溶液与溶液后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。其中加入溶液后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液后，出现絮状沉淀。3苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。4苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl （pH7.6）进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是T

8、ris-HCl液隔绝空气层。5酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。6实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep管，全部弃用，不回收。7有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。六、思考题1裂解细菌时需注意的事项有哪些？答：根据要提取的质粒的大小、大肠杆菌菌株、和裂解后用于纯化质粒DNA的技术选择处理方法。本实验中：时间不能过长，摇晃混合要轻柔。2质粒的基本性质有哪些？游离于染色体外，可稳定遗传，一般比较小，双链闭环

9、的结构，可自主复制和转录。带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。改造后具有多克隆位点。可游离于细胞质也可整合到细菌染色体中，不能脱离宿主细胞而独立存在。3碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？溶液I是 含有葡萄糖的Tris缓冲液，目的是沉淀细菌。细菌外壁有多糖的细胞壁，溶液中的葡萄糖使细菌更容易分散在溶液中，减少抽提过程中的机械剪切的作用，防止破坏质粒DNA。EDTA络合掉Mg2+等金属离子，防止DNA酶对质粒的降解作用。Tris使溶菌液作用的最适ph范围。 溶液II是含有NaoH和去污剂的起到破坏细胞结构和降解RNA的作用。 溶液III是酸性的KAC缓冲液，中和碱性，停止降解，使SDS

10、与大分子DNA和蛋白质沉淀。4抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？有三个基本步骤：1.培养菌种和扩增质粒2.收获和裂解菌体3.纯化质粒DNA。5如何提高质粒DNA的产量？1.扩增时间和条件和合理设置，2.破坏细胞结构的时候时间不能过长3.乙醇除尽6为什么质粒DNA不能反复在4、-20、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？实验二 DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定一、 实验原理测定核酸通常采用两种方法：即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。1紫外分光光度法DNA或RNA定量时，应在260nm和280nm两个波长下读数。根据计算在260nm波长下，每1ug/mL DNA钠盐的A值为0.2

11、0，即在A260=1时，双链DNA含量为50ug/mL，单链DNA与RNA含量为40ug/mL，单链寡核苷酸的含量为33 ug/mL。双链DNA含量A26050稀释倍数（ug/mL）RNA含量A26040单链DNA含量A26033此外还可以根据260nm和280nm的读数间的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。2琼脂糖凝胶电泳法根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品表21作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要510ngDNA，就可以从照片上比较鉴

12、别。由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。表21 DNA/ Hind 中DNA片断片段碱基对数目/kb相对分子质量DNA含量/ %DNA含量/（ng/mg）123.13015.010647.7476.929.4196.1219.4194.136.5574.2613.5135.244.3712.84989.952.3221.514.847.962.0281.324.241.870.5640.371.111.680.1250.080.32.6二、实验目的 1从以上实验中提取到的质粒DNA，为了能作下一步的酶切，连接及转化实验，必须测定

13、DNA的纯度、含量以及分子量大小。2本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测DNA、含量与相对分子质量大小。自制的质粒DNA、DNA/ Hind 、。1标准DNAmarker（DNA/ Hind ）2限制性内切酶EcoR或Hind和10X缓冲液3酶反应中止液：0.2 5溴酚蓝（含40蔗糖），已配好。4溴化乙锭染液（EB）：使用前稀释1000倍，母液已配好。EB是一种诱变剂，配制和使用时应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。50.5TBE缓冲液：Tris 2.18g、硼酸1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸馏水定容至400mL。可配成5TBE母液，

14、使用时稀释10倍即可。60.7琼脂糖37水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管（1.5mL）、加样器（20uLlmL）、吸头。四、实验操作（一）质粒DNA的酶解1新提的质粒，在10uL的体系中用单一酶（如EcoR）进行处理，即：质粒DNA 5L10缓冲液 1LEcoR 0.5LddH2O 4L237，保温30min。3加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于冰箱中贮存备用。（二）琼脂糖凝胶板的制备1琼脂糖凝胶的制备称取1.0g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mL TBE缓冲液，瓶口倒扣一小烧杯，于电炉上加

15、热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1。2胶板的制备将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板（一般称之为梳子），将冷却至65左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1h左右，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。胶板内的样品小

16、槽3加样用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。（每块胶板需点一个Marker，这里即为DNA/ Hind ）4电泳加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约12cm处，停止电泳。5染色将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的D

17、NA带。染色20min后，用大量水冲洗。6观察在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。1基因工程是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的正确性，确认样品确实被加入反应体系。2酶应在20冰箱中保存，取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回20冰箱，不要将酶在冰浴中放置过久，或放在高于0以上的环境中，以防止酶失活。3酶切加样次序为水、缓冲液和DNA，然后混匀。酶永远是最后加入的，如将酶直接加入浓缩的缓冲液中会引起严重的失水。酶切反应体系的溶液加完后，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量

18、离心机甩一下，使溶液集中在管底，不要用振荡器。此步操作是整个实验成败的关键，注意防止错加、漏加。4为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。5溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，用后用水彻底冲洗干净。1简述EB显色的原理。2使用溴化乙锭时应注意什么？答:3说明不同电压对电泳结果的影响是什么4如何判断DNA的纯度？答;实验三 感受态细胞的制备及转化一、实验原理 感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。转化是将外源DNA分子引入受体细胞

19、，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化的基本原理是细胞处于0，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基钙磷酸混合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化子。1学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。2掌握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。三、实验材料和用具自制的质粒DNA、大肠杆菌（E.coli）菌种（DH5菌株）。LB琼脂平板 （无抗生素）、LB琼脂平板 （含50g/L氨苄青霉素）、LB液体培养基5mL（无抗生素）、

20、LB液体培养基100mL（无抗生素）、LB液体培养基5mL（含50g/L氨苄青霉素）、0.1mol/LCaCl2溶液（灭菌备用）。恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。（一）大肠杆菌感受态细胞的制备1从新活化的E.coliDH5菌平板上挑取一单菌落，接种于5mL液体培养基中，37振荡培养过夜，直至对数生长期。将该菌悬液以1：50接种于50mL LB液体培养基中，37快速振荡培养34h。2取5mL培养液放入离心管中，在冰上放置10min，于45000rpm离心10min。3可用加样器将残余液体尽量去净，用1mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻

21、轻悬浮细胞，冰上放置1530min。4于4，5000rpm离心10min。5弃上清，加入200L预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。6制好的感受态细胞可在冰上放置，24h内直接用于转化实验，也可加入占总体积95左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于Ep管中，-70条件下可保存半年至一年。（二）细胞转化取200L摇匀后的感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化如下（单位：L）：编号质粒感受态细胞无菌水0.1mol/LCaCl2样品100/对照1对照2样品组即为我们的转化组：100L感受态细胞2L质粒DNA对照1为受体菌对照组：100L感受态细胞2L

22、无菌水对照2为质粒DNA对照组：100L0.1mol/LCaCl22L质粒DNA将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却35min。上述各管中分别加入400L LB液体培养基，使总体积为500L，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37振荡培养30min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。（三）平板培养取各样品培养液100L分别接种于含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的LB平板培养基上（分别记为Amp和Amp），涂匀。37培养24h，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。（四）检出转化体不含抗生素培养基含抗生素培养基结果分析受体菌对照组有大量

23、菌落长出无菌落长出本实验未产生抗药性菌株质粒对照组质粒DNA不含杂菌转化实验组有菌落长出质粒进入受体菌中产生抗药性1这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，在超净工作台内进行。2细胞转化中，42水浴90s要准确操作。3制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。思考题1 感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？2思考转化后平板培养应有的结果、分析自己培养的情况。附录：1. pH8.0 G.E.T.缓冲液 （灭菌后使用） ：葡萄糖 0.991gEDTA-Na2 0.372gTris-HCl 0.303gH2O 100mL2. 5mol/L KAc：49.08g KAc溶于

24、100mL H2O。3. PH4.8乙酸钾溶液：取60mL 5mol/L KAc,11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O即可。4. 0.2mol/LTris-Cl：2.422g溶于100mL H2O。5. 0.2mol/LHCl：取1.724mL浓HCl稀释到100mL。6. pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入29.2mL 0.2mol/LHCl，补H2O至100mL即可。7pH8.0 10mmol/LEDTA-Na2：3.722g EDTA-Na2溶于一定量的 H2O中，用固体NaOH调节其pH值，最后定容至100mL。8pH8

25、.0TE：取10mL pH8.0 0.1mol/L Tris-HCl，10mL pH8.0 10mmol/L EDTA -Na2，最后定容至100mL，调节pH至8.0。含RNA酶（RNaseA）20ug/mL。9pH7.6 0.1mol/L Tris-HCl：取0.2mol/LTris-Cl 50mL加入38.5mL 0.2mol/L HCl，补H2O至100mL即可。用于饱和酚/仿混合物。10酚/仿溶液（按如下体积和顺序加入试剂）饱和酚：重蒸酚 12.5mL 三氯甲烷 12mL 异戊醇 0.5mL用pH7.6 0.1mol/L Tris-Cl平衡23次，在饱和酚/仿上，加入等体积的pH7.6 0.01mol/L Tris-Cl保护，棕色瓶保存，4存放。115TBE： 称取Tris-Cl 21.8g，硼酸11.0g和EDTA-Na2 1.4g用蒸馏水溶解，定容至400mL。临用时稀释为0 .5TBE。120.1 mol/LCaCl2：5.5g CaCl2溶于500mL H2O。灭菌后备用。13无菌水。