06细菌的遗传分析Word文件下载.docx

1、第三步是形成明显的细胞壁；第四步是细胞分裂，子细胞分离。球菌可沿一个平面或几个平面分裂，所以可以出现多种排列形态；杆菌一般沿横轴进行分裂。除无性繁殖外，已证明细菌存在着有性繁殖，不过频率很低。以大肠杆菌为例，大肠杆菌是一种革兰氏阴性短杆菌，以而分裂的方式繁殖，遗传物质为DNA，复制是半保留复制，遵循碱基互补配对的原则，其具体过程如下：DNA的复制在大肠杆菌已被证明是双向复制，是一个边解旋边复制的过程。遵循环状DNA分子双向复制的原则，首先在复制点形成一个复制“泡”，随之沿着环的两个方向进行复制，泡逐渐扩大，形成像希腊字母“”的形状，故环状DNA的双向复制模式称为模型，最后由一个DNA环复制为两

2、个子环。这样，复制结束后，新复制的DNA分子，通过细胞分裂分配到两个子细胞中去但是值得注意的细菌的所谓的染色体就只是中间的环状DNA，这个环状DNA中不含有组蛋白，不能形成染色体的形态，DNA复制后就直接平均分配到两个子细胞当中。细菌的核比较原始，无核膜、核仁，故称为核区或细菌染色体。研究发现核区实际上是一个巨大的环状双链DNA分子，例如E.coli的DNA双链长达1.11.4 mm，是菌体长度的1000倍，可以想象这样长的DNA链，在不到1m3的核区空间内，一定是以十分精巧的空间构建盘绕在细胞内。一般每个细菌胞内只有一个核区，当细胞快速生长时，由于DNA复制次数与细胞分裂次数不同步，一个胞内

3、可同时出现2个甚至4个核区。大肠杆菌染色体基因组是研究最清楚的基因组。估计大肠杆菌基因组含有3500个基因，已被定位的有900个左右。在这900个基因中，有260个基因已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中。在已知的基因中8的序列具有调控作用。大肠杆菌染色体基因组中已知的基因多是编码一些酶类的基因，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸和维生素合成代谢的一些酶类的基因，以及大多数碳、氮化合物分解代谢的酶类的基因。另外，核糖体大小亚基中50多种蛋白质的基因也已经鉴定了。除了有些具有相关功能的基因在一个操纵子内由一个启动子转录外，大多数基因的相对位置可以说是随机分布的。如控制小分子合成和分解代谢的基因，

4、大分子合成和组装的基因分布在大肠杆菌基因组的许多部位，而不是集中在一起。再如，有关糖酵解的酶类的基因分布在染色体基因组的各个部位。进一步发现，大肠杆菌和与其分类关系上相近的其他肠道菌如志贺氏杆菌属（Shigella）、沙门氏菌属（Salmonella）等具有相似的基因组结构。伤寒沙门氏杆菌（Salmonellatyphimurium）几乎与大肠杆菌的基因组结构相同，虽然有10的基因组序列和大肠杆菌相比发生颠倒，但是其基因的功能仍正常。这更进一步说明染色体上的基因似乎没有固定的格局，相对位置的改变不会影响其功能。在已知转录方向的50个操纵子中，27个操纵子按顺时针方向转录，23个操纵子按反时针方

5、向转录，即DNA两条链作为模板指导mRNA合成的机率差不多相等。在大肠杆菌染色体基因组中，差不多所有的基因都是单拷贝基因，因为多拷贝基因在同一条染色体上很不稳定，极易通过同源重组的方式丢失重复的基因序列。另外，由于大肠杆菌细胞分裂极快，可以在20分钟内完成一次分裂，因此，携带多拷贝基因的大肠杆菌并不比单拷贝基因的大肠杆菌更为有利；相反，由于多拷贝基因的存在，使E.coli的整个基因组增大，复制时间延长，因而更为不利，除非在某种环境下，需要有多拷贝基因用来编码大量的基因产物，例如，在有极少量乳糖或乳糖衍生物的培养基上，乳糖操纵子的多拷贝化可以使大肠杆菌充分利用的乳糖分子。但是，一旦这种选择压力消

6、失，如将大肠杆菌移到有丰富的乳糖培养基上，多拷贝的乳糖操纵子便没有存在的必要，相反，由于需要较长的复制时间，这种重复的多拷贝基因会重新丢失。大肠杆菌染色体基因组中，大多数rRNA基因集中于基因组的复制起点oriC的位置附近。这种位置有利于rRNA基因在早期复制后马上作为模板进行rRNA的合成以便进行核糖体组装和蛋白质的合成。从这一点上看，大肠杆菌基因组上的各个基因的位置与其功能的重要性可能有一定的联系。许多细菌胞质中还存在着一种小型环状DNA分子质粒，质粒能携带2200个基因，可进行自我复制。研究较多的有F因子（大肠杆菌性质粒）、R因子（抗药性质粒）、Col因子（大肠杆菌素质粒）。质粒DNA在

7、遗传工程中很重要，它可作为基因的载体，带着某一目的基因，进入受体细胞，使其产生新的遗传特性。Lederberg和Tatum（1946）用大肠杆菌K12的两个菌株A和B的杂交试验： 品系A基因型：met-bio-thr+leu+thi+品系B基因型：met+bio+thr-leu-thi-A、B混合培养在完全培养基上过夜，然后离心培养物，把沉淀细胞涂布在基本培养基外，发现长出了菌落，频率10-7（在果蝇中是办不到的）出现了基因重组，重组型菌落为met+bio+thr+leu+thi+。对上述试验结果原养型菌落可能产生于：亲本细菌A或B发生了回复突变？两品系细胞通过培养基交换养料互养作用？两品系间

8、发生了转化作用？发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体？为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：这些解释均不成立。为了证实该实验：Davis（1950年）设计了一个U形管试验。他将两个品系细菌分装在U形管两臂，底部中间用一滤片隔开，上面的微孔只允许DNA或其他营养物质通过，细菌本身并不能通过，通气使两边物质充分交流，结果，从两边的培养物中均不能获得重组细菌。这一试验彻底地排除了转化或营养物质互补的可能，充分证明细菌的直接接触是出现原养型重组子的必要条件。Lederberg和Tatum等人的实验清楚地表明细菌的接合是造成细菌基因重组的前提。但由于历史的局限，Lederberg和Ta

9、tum当时认为细菌接合是一个对等的、彼此交换遗传物质的过程，即细菌没有性别，是“同宗配合的”，这导致他在1951年绘制大肠杆菌连锁图时陷入困境。1952年，T. F. Anderson在电镜下获得了大肠杆菌细胞结合的图像，1952-1953年，英国微生物遗传学家W Hayes意外发现细菌杂交的过程是一个单向的转移遗传基因的过程，是“异宗配合”的，即细菌也分性别，雄性细菌是供体，雌性细菌是受体。1. 细菌“性别”的发现： W. Hayes 的实验Hayes实验1： 菌株A met-thr+leu+thi+ 菌株B met+thr-leu-thi- str处理A + 未处理B存活 有重组（与对照频

10、率一样） 基本培养基 str处理B + 未处理A无存活 Hayes 解释 ：（1） str处理后，不能繁殖，只有另一方繁殖。（2） 如果转移是双向的，两种杂交都全出现重组型，供体经链霉素处理后，不能分裂，但仍能转移基因，而受体未受处理，仍能分裂。所以接受转移过来的基因后，有可能在基本培养基上形成菌落。所以，大肠杆菌中遗传物质的交换不是交互的。事实上，菌株B作为遗传物质的受体，菌株A作为供体。2. F因子及其转移大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子（fertility factor）或性因子（sex factor）决定的F因子，具有这种因子的能育品系记为F+，相当于雄性。不含这种致育因

11、子F的品系记为F-，相当于雌性。F+细菌的表面有称作性伞毛（sex pili）的细长细毛，由此与F-细菌接合，一旦接触后，伞毛发生改变，成为两细胞间的原生质通道细胞质桥或称结合管（conjugation tube），F+细胞的F因子通过接合管向F-细胞转递：使F-变成F+，F因子还可改变细胞表面的构造，以防F+细胞间的接合。F质粒 ： F因子就是F质粒。质粒：是指染色体外的遗传物质。可以自主复制，并在细胞分裂时分配到子细胞中。 特性 ： （1） 自主复制；（2） 感染 感染性质粒。 F质粒是能独立增殖的环状DNA分子。 F质粒的结构：（1） 原点， 转移的起点 （2） 致育基因：形成性伞毛的基

12、因群 （3） DNA复制酶基因 （4） 插入序列（配对区域）（insertion sequence， IS） F质粒转移的过程：F+F-的过程图示：滚环式复制， 式。F-的特点：（1） F质粒转移的频率高，1/10，使F-F+。（2） 而染色体转移频率低，10-7。（3） F+F+不发生接合。因此，F+品系又称为低频重组品系（low frequency recombination）。3. 高频重组品系Hfr Cavalli（1951）和Hayes（1954年）先后从能育的A品系中分离出两个新的品系，它们和B（F-）杂交，出现重组频率很高。比AF+BF-高出1000倍。这种品系称为高频重组品系H

13、fr（high frequency recombination）。Hfr 的特点 ： （1）高频重组，染色体转移频率高，1000 ；（2） F质粒转移频率低 F+F+很少或没有。Hfr的形成及转移过程： 配对整合接合接合管复制转移起点。Hfr和F+的联系和区别 联系：（1）都是雄性菌，含有F质粒 （2）整合 游离 区别：（1）前者高频重组，后者低频重组； （2）前者F质粒转移频率低，后者F质粒转移频率高； （3）前者F质粒整合，后者F质粒游离 附加体的概念，频率高的原因：可见，不同的基因进入受体细胞时间是不同的。位于前端的基因，首先进入，可以想象，基因间的距离越长，转移的时间间隔越长，因此，可

14、以用基因转移的时间长短、顺序来表示基因在染色体上的图距即时间作图法。这要用中断杂交技术。Hfr细胞和F-细胞之间的接合管常会自发断裂，进入的Hfr染色体也随之断裂，一般说很少有整条Hfr染色体转入F- 细胞的，因此：1. F-细胞得到的只是F因子的一部分，F因子其余部分依赖于整条Hfr染色体的转移，这样Hfr F- 杂交中选出的大多数重组子仍为F-。2. F-受体细胞只接受部分的供体染色体，这样的细胞就称为部分二倍体（partial diploid）或称为半合子（merozygote）。供体与受体的重组是内基因子（F-染色体DNA）与外基因子（Hfr部分染色体DNA）的同源部分配对、交换，产生

15、重组子。其中单交换产生的是不平衡的部分二倍体线性染色体，而双交换产生的是有活性的环状重组子和片段。细菌重组的特点：（a）：接合后形成的部分二倍体，包括外基因子和内基因子；（b）：内基因子和外基因子之间单交换形成一个线性染色体；（c）：双交换形成一个完整的重组染色体和一个游离片段，这一片段随以后的分裂而丢失。可见：原核类中的交换并不像真核生物那样在两整套基因组间进行，而是在一完整的基因组（F-内基因子）与一不完整的基因组（Hfr外基因子）间进行，即在部分二倍体间进行。因此，在细菌的重组中有下列两个特点：1、只有偶数次交换才能产生平衡的重组子2、不出现相反的重组子，所以在选择培养基上只出现一种重组

16、子。基因从Hfr细胞按次序转入F-细胞，可根据基因进入F-细胞的时间和次序制作基因图谱。 Wollman和Jacob于1954年在大肠杆菌中曾进行了以下杂交实验：Hfr：thr+leu+azsTislac+gal+strs F-:thr-leu-azrTirlac-gal-strr把接合中的细菌在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以中断接合中的细菌，然后分析受体菌的基因型，这是在大肠杆菌等细菌中用来测定基因位置的一种方法。问题1：如何确定基因转移的顺序和时间？混合培养液进行通气培养，每隔一定时间取样，把菌液放入搅拌器内搅动以打断配对的接合管，使接合的细胞分开以中断杂交然后检查某一基因是否发生重组。

17、问题2：如何检出某一基因的重组子？把中断杂交的细菌放在完全培养基上培养，显然供体、受体菌都能生长。影响检别，我们只需要把发生重组的重组子检出。这就必须有一个可供选择用的供体标记基因。这样可以认出重组子，如在基本培养基中培养选择thr+leu+重组子。这时thr+leu+为标记基因，可排除受体菌株，但供体菌还能继续存在。为了不选择供体细胞本身，供体细菌也应该带有一个特殊的标记，能使自己不被选择。例如供体菌对链霉素敏感，这样当结合体在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。因此，把中断杂交的细菌稀释接种到含有链霉素的基本培养基上，如能形成菌落，它的基因型必定是thr+leu+strr。因为

18、只有这种重组子才能生长。并说明供体thr+和leu+已进入受体并发生重组。我们称在供体菌中被选择的基因thr+和leu+为选择标记，而始终不被选择的strs为反选择标记基因，而那些还没有进行选择检定的基因为非选择标记。问题3：在发生重组的菌落中，如何检别非选择标记基因。对每一时刻的重组thr+leu+strr的菌落影印培养接种到不同的培养基上（如乳糖lae+ 伊红红，gal+ 美兰红色）。记录重组子中每一非选择标记出现的时间、出现的频率和持续时间，得右图（Hfr的非选择标记基因进入F-所需的时间，以及根据非选择标记在各个时间出现的频率作图）。中断杂交实验结果：基因 转入时间（ min） 频率t

19、hr+ 8 100leu+ 8.5 100azs 9 90Tis 11 70lac+ 18 40gal+ 25 25从图中可以看到，从Hfr菌株的基因在F-细菌中出现的开始，随着时间的增加，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一频率为止。而且某一基因出现的时间愈早，它达到的频率愈高。不同基因在F-中出现的时间和达到的稳定转移频率不同，表明它们同转移起始点之间，以及它们之间的顺序和距离不同。解释 ：因为基因在染色体上，从染色体的一端开始，以线性方式按一定的时间顺序依次进入F-细胞，始端称为原点（origin）或0。显然，基因离开原点越远，进入F-细胞越迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程停止以前

20、，仍未转移，因而频率较低，达到的最高值也较小。根据以上实验，如果以转移的时间单位（每分钟）作为基因间的距离单位，就可以作出Hfr染色体上的基因分布图。如果杂交持续2小时，然后中断交配，就会发现一些细胞转变为Hfr。这说明致育因子是最后转移到受体，是染色体的最后单位。所以频率很低。0 5 10 15 20 25min O az Ti lac galE.coli中断杂交作图 基因距离以分钟为单位同一个Hfr菌株的转移的起始点在以及转移顺序在不同实验中都是相同的。但一个F+品系可产生许多Hfr品系，这是因为F因子在细菌染色体上有许多插入位点而且其插入取向不同而形成的。用这些不同Hfr菌株进行中断杂交

21、实验，则它们的转移起点、基因转移顺序以及转移方向都不相同。在中断杂交中，根据基因转移的先后次序，以时间为单位求出各基因间的距离，叫做时间作图法。如果基因间转移的时间在两分钟以内，用这种方法求得的基因间距离就不很精确可靠，它为重组作图提供某些基因之间连锁关系及其前后次序的依据。重组作图是根据基因间重组率进行定位的。接合重组作图的特点：（与减数分裂生物的区别）（1） 不用亲本类型 （i）无法区分，（ii）不重组将丢失。（2） 两对基因间的交换频率，必须在形成部分二倍体的条件下，计算重组率。（3） 部分二倍体如果不发生重组，无法鉴别。只有最后一个基因进入受体细胞，长并发生重组才能鉴别，即最后一个基因

22、发生重组的条件下，计算两基因的重组率。（4） 接合重组不产生相反的重组类型。例如根据中断杂交试验知lac和ade基因是紧密连锁的而且lac比ade先进入受体。试验 ：Hfr lac+ade+strs F-lae-ade-strr 混合60分，链霉素完全培养基但不加腺嘌呤。未杂交的被杀死。选出来的都是ade+strr。因为ade+是在lac+之后进入F-，所以，lac自然进入，形成了部分二倍体。在ade后部发生了交换，但另一交换位置需进一步鉴别。将重组子菌落影印培养在EMB（曙红+美蓝）培养基上，如果是紫红色，说明重组子含有lac+ade+，另一交换发生在lac前端，如果粉红色，说明交换发生在l

23、ac和ade之间，为lac-ade+重组子。lac+ade-不会产生。重组率=lac-ade+/（lac+ade+）+（lac-ade+）100%=22% 用时间单位法lac-ade的图距是一分钟，所以时间单位和重组值的关系大致是1分钟 = 20%的重组值 用重组率与中断杂交法测的基因距离大致符合的，根据接合的实验，用中断杂交法基因重组等方法已绘制出大肠杆菌K12环状遗传图。Hfr细菌中，F因子是整合到细菌染色体中的，但该过程是可逆的，当发生环出（looping out）时，F因子又重新离开染色体，恢复到游离态的质粒。通常插入和切离很难准确。F 因子（F质粒）：Hfr菌株在切除 F因子时发生错

24、误切除，不是以原来的位置切除，而是将供体菌（Hfr）主染色体上的个别基因切除，成为F因子的一部分，这种带有宿主染色体基因的附加体称为F 因子。F 菌株：含有F 因子的菌株。性导：F因子转导。指细菌的一部分附着在F因子上的染色体基因，通过F因子的转移而传给另一细菌并表现出相应性状的过程。即F-细菌通过获得F 因子而改变遗传性状的过程。F 因子的性质：F 因子可通过细菌的有性接合转移进入F-受体菌中，进入F-受体菌后，F 因子可能是游离的，也可能以结合态插入F-受体细菌的主染色体中，使受体细菌构成部分二倍体，实现了通过F 因子对遗传物质转移的意图。F 因子的特点： F 因子以极高的比率转移它携带的

25、基因；如同F+ 高效转移F因子一样。 F 因子有极高的自然整合率（整合成Hfr，频率高于F品系），而且整合在一定的基因座位上，因为它有与细菌同源的染色体区段，不同于F因子随机插入。 F 因子进入受体细胞以后，在整合以前，受体细胞就成为部分二倍体。F 因子所携带的基因就可以在受体细胞中表达。 F 因子携带染色体的节段大小：从一个标准基因到半个细菌染色体。例如：lac+ 乳糖发酵基因的转移。Jacob，E.和Adelberg，E.发现：某一Hfr菌株的F因子在环出时带走了lac+ 基因，当此F 转移到 F- lac-以后，受体菌成为 F+ lac+ 的比率很高。 lac基因位于原点远端，在Hfr

26、F- 中断杂交实验中只有1/1000重组率； 由F 携带lac+ 基因进入受体后可在lac位点上形成部分二倍体 Flac+ / lac-。lac+对lac-是显性，所以部分二倍体的表现型是lac+。 部分二倍体是不稳定的，F 因子可能丢失，使F lac+ / lac- 回复为lac- ，但F 也可以与染色体发生重组，形成稳定的lac+ 菌株。性导在大肠杆菌的遗传学研究中十分有用：第一，分离出大量F 因子，每个F 因子携带有不同大肠杆菌基因片段，利用不同的F的性导可以测定不同基因在一起转移的频率。利用不同基因在一起的并发性导的频率来作图是建立遗传图谱的重要途径。其次，观察由性导形成的杂合部分二倍

27、体中某一性状的表现，可以确定这一性状的等位基因的显隐关系。第三，性导形成的部分二倍体也可用作互补测验，确定两个突变型是同属于一个基因还是不同基因。1概念：转化：指外源DNA片段不经中间媒介体直接进入感受态细胞进行基因重组形成重组体的过程。感受态细胞：能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞。感受态因子：促进转化作用的酶或蛋白质分子。转化子：通过转化而形成的重组体。转化时供体DNA片段平均长度约为20000个核苷酸对，DNA片段进入受体后和受体染色体形成部分二倍体，因此有可能发生重组，从而使受体细胞发生稳定的遗传转化。2转化过程 具体过程包括几个连续的阶段：（1） 双链DNA分子和细胞表面受体部位

28、进行可逆性结合。结合发生在受体细胞特定部位（结合点）；对供体DNA片段有一定要求（20000个核苷酸对）；结合过程是一个可逆过程。（2） 供体DNA片断被吸入受体细胞，并要防止受体DNA酶的破坏。（3） 供体DNA进入受体后，立即从双链DNA转变成单链DNA，其中一条单链被降解。（4） 未被降解的一条单链DNA部分地或整个地插入受体细胞的DNA链中，形成杂合的DNA分子。杂合的DNA分子的形成是单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换，从而稳定地掺入到受体DNA中的过程。（5） 这种杂合DNA复制，分离以后，形成一个受体亲代类型的DNA和一个供体与受体DNA结合的杂种双链DNA。从而导致基因

29、重组，形成各种类型的转化子（transformant）。转化中单链外基因组片与双链内基因驵间整合过程。（6） 供体单链与受体DNA之间结合形成一段异源双链区。转化过程的最后结果取决于误配核苷酸对的修复校正。如切除供体单链，则无重组发生。如切除受体单链则产生重组体，如果无校正作用发生，则该细菌经DNA复制和细胞的分裂产生一个有受体基因型的细胞，一个具有重组体基因型的细胞。3转化条件从一个供体菌株分离出来的DNA与另一受体菌株活细胞接触，大约只有1%的受体细菌细胞可吸收外源DNA，并发生遗传性的转化。转化频率低的原因可能是：（1）只是在特定区域形成临时性通道受体部位。数目有限。（2）还必须有酶，或蛋白质分子以及能量等的协同作用。能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞称为感受态细胞；而促进转化作用的酶或蛋白质分子称为感受态因子。4转化作图 （1）连锁关系的确定 观察DNA浓度降低时的转化频率的改变。因为在较低的浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成正比关系。如果A和B是连锁的，那么当DNA浓度下降时，AB同时转化频率下降和A或B转化频率下降程度相同；如果A和B并不