农药生物测定一至三章Word下载.docx

1、适用于大麦白粉病筛选的芽鞘表皮法等。三、生物测定的内容可以概括为活性筛选的常规测定、田间药效试验、残留分析。也可以归纳为：1.比较农药对昆虫、病菌或植物的药效或药害；2.比较农药不同方法、加工质量、物理性状对供试生物的药效；3.测定两种或两种以上农药混用的效力大小；4.新研制化合物或农药对供试生物的药效、药害的筛选和评价；5.研究供试生物内在因素和环境因素对药剂效力的关系；6.鉴定生物体对农药的抗药性；7.测定农药在生物体内外、土壤或环境中的残留量。生物测定的发展趋势植物细胞培养与生物测定相结合 从靶标的角度制定生物测定方法 生物测定向自动化、微型化方向发展 四、农药生物测定的作用和地位生物测

2、定是开发新农药的重要手段一个新化合物从实验室合成到正式投入生产必须经过室内毒力测定、温室毒力测定和田间小区药效试验。因此生物测定是研制新农药、开展毒理学研究等方面的重要的先决条件。生物测定还是农药使用的重要先决条件对表现活性高的化合物，除进行大田药效试验外还要做残留、对高等动物的毒性以及对有益生物和农业生态系统影响的生物测定研究，同时生产部门要对其剂型和加工技术进行研究。可见生物测定也是合理科学使用农药、提高防效等方面的先决条件。另外发现新的试验方法等于发现新农药，新农药发现存在于生物测定过程的每个异常现象之中。基于以上所述，有人曾把生物测定与化学合成比喻为前进中的两个车轮，两者互相制约、互相

3、促进。五、生物测定的设计基本原则1相对控制的实验条件外界环境条件的变化，如温度、湿度、光照等对杀虫剂的理化性状和昆虫的生理状态都有直接或间接的影响。而杀虫剂理化性能的变化，能影响其对昆虫的毒效。昆虫的生理状态，如发育阶段、龄期、性别等的不同对杀虫剂有不同的耐药力。因此在毒力测定中应用标准目标昆虫和相对控制环境条件，尽可能将条件差异、人为因素及各种环境因素影响造成误差消除或减少，提高试验的精确度。2必须设对照在试验期间往往有自然死亡情况，因此药剂处理组的死亡虫数也包括自然死亡数，显然这不完全是药剂的作用效果，故应设立对照加以校正，以消除自然因素所造成的死亡对药剂效果的干扰。对照有三种：一种是不作

4、任何处理的空白对照；二是标准药剂作对照，标准药剂是选择同类化合物防治某种病虫害最有效的药剂；三是与药剂处理所用的溶剂或乳化剂等助剂完全一样，只是不含药剂的对照。3各种处理必须设重复在生物种群与个体之间对药剂的耐药力不同，反应有显著的差异，取样代表很重要，如果取样少了，既有可能由于取样不够全面或不是随机取样而造成结果的片面性。因此每个处理要求一定的数量，重复次数越多，试验结果就越可靠。增加重复是减少误差的一种方法，但也不能或没必要太多，应根据试验目的与要求以及不同的生物材料而定。重复次数一般为35次。从生物统计理论上讲，增加重复次数减少每个重复的生物个体是减少试验误差的一种方法。4运用生物统计分

5、析试验结果生物统计是生物测定的基本条件，是判断和评价试验结果的重要工具。是在生物学指导下用概率论为基础，描述偶然现象隐藏着必然规律的科学分析方法，它可以从错综复杂的实验数据中揭露农药与生物之间的内在联系。各种处理之间的差异的显著程度，是不能凭主观去认定，必须通过客观评定，用数理方法，精密而合理地计算出来。六、试验结果的统计与分析一、毒力表示方法1、试虫“死亡”的标准试虫经处理一定时间后，其反应有三种情况：存活：处理试虫和对照试虫同样正常，中毒：和对照组试虫相比，处理试虫明显失常，如大量失水，不能正常爬行，翻倒，但对外界刺激仍有反应；死亡：试虫完全停止活动，对外界刺激没有任何反应。2、校正死亡率

6、一般认为，如果对照组的死亡率小于5，则死亡率和校正死亡率相差不大，可以不予校正；如果对照组死亡率大于5，则应校正，如果对照组死亡率20以上，则在找出原因后，要重新进行毒力测定。有些要求严格的毒力测定，甚至在对照组死亡率达10以上时就应重做。校正死亡率的计算多采用阿勃氏（Abbott，1925年）提出的公式：校正死亡率（）=（XY）/ X100X对照组生存率；Y处理组生存率；XY=真正由于药剂处理的死亡率。3.致死中量与致死中浓度用来杀死群体中50%的个体所需要的剂量，用LD50表示，若用浓度表示就叫致死中浓度用LC50表示。4.有效中量与有效中浓度指抑制50%病菌孢子萌发或菌丝生长所需要的剂量

7、,用ED50来表示，若用浓度表示就叫有效中浓度,用EC50来表示。5.相对毒力指数指几种农药在不同时间、条件下分批进行试验、每次都用一标准药剂来做对比，以该比值进行毒力比较，这个比值就称相对毒力指数，用TI表示。二、药效的表示单位杀虫剂=处理区防治后存活的个体数量 =处理区防治前存活的个体数量 =对照区防治后存活的个体数量 =对照区防治前存活的个体数量杀菌剂发病率=病苗（株、叶、杆）数 /检查总苗数（株、叶、杆）数100 病情指数=（病级叶数该病级）/检查总叶数最高级值100 病级值的划分标准，可根据病害种类及症状、危害特点而灵活决定相对防治效果=对照区病情指数（%）-处理区病情指数（%）/对

8、照区病情指数（%） 100% 除草剂三、结统计结果进行分析1、剂量死亡率之间的关系 2、LD50与回归式y=a+bx的求法A、作图法 以剂量对数值为横坐标（lgC），校正死亡率机率值（P）为纵坐标，在坐标中相应的位置上标出各点，用目测法作一条平分各点的直线（应使线两例各点的垂直距离相加后相等）。此线即为毒力直线。从机率值5处引出一条平行于横轴的直线，在与毒力直线的交点处，引出一条平行于纵轴的直线，与横轴的相交处为LD50的对数值（图1-1），再查反对数即可得LD50。用该直线可求出毒力回归式y = a+bx，取线上任意两点的座标（A:yl，xl，B：y2，x2），求b和a，将a和b代入y =

9、a+bx,得回归方程。B、机率值分析法 该法必需将剂量转换成对数（x lgC ，为自变量）；死亡率经校正得校正死亡率，转换为机率值（P = Y ，为依变量），经过统计分析进行计算。（1）利用以下公式求出毒力回归线：y = a+bxn为供试总虫数，r为实际观察的死亡虫数，p为理论死亡率。按照y = a+bx，代入各x值求得各理论机率值y，由理论机率值y查机率表得理论死亡率。（2）进行卡方检验：以上所得到的y = a+bx是否符合实际，须经卡方（2）进行适合性测定。只有2达显著或极显著差异时，说明y=a+bx符合实际，用它来求LD50值是可行的。（3）求LD50值求出回归方程并经卡方检测验后，即可

10、将机率值5代入回归方程式，得LD50的对数值，再查反对数即可得LD50。（4）致死中量的标准差 由于试验设备，供试材料操作技术和环境条件的影响，有效中量必定有它的偏差，可用标准差（Sm）来表示。由机率值y查权重系数w表得出相应的权重系数。致死中量实际应为LD50Sm。标准差的计算公式为：（5）致死中量的置信限 致死中量（有效中量）的置信限是表明致死中量可靠范围的限度，在统计上要求，100次测验中如果有95次能成功，就认为达到最低可靠标准。也就是95%的可靠性，当然也可以要求99的可靠性。计算公式为：式中CL置信限，m致死中量，t机率值查t分布表 ，Sm致死中量的标准差。第一章 杀菌剂生物测定技

11、术狭义的杀菌剂是指对真菌、细菌、病毒等病原菌有杀死或抑制作用的药剂。广义的杀菌剂还包括对病原菌具有抑制作用的生防菌以及能诱导植物抗病性的化合物。杀菌剂的作用方式抑菌、杀菌、改变致病过程、提高抗病性杀菌剂的使用方式化学保护、化学治疗、化学免疫一、杀菌剂生物测定技术概念 杀菌剂生物测定技术：是指将杀菌物质作用于病原菌或感病植物体，根据生物活性大小或植物病害发展情况来判断药剂效果的实验方法。 杀菌剂对植物的药害和对非靶标生物的毒性实验也属于生物测定技术的范围。二、杀菌剂生物测定技术方法目前杀菌剂应用最普遍的是离体（ In vitro） 和活体（ In vivo） 两大生物测定技术。（一）、离体测定法

12、利用药剂和病原菌直接接触，来测定药剂杀菌毒力的方法。即病原菌脱离寄主（感病植物等） 在人工培养基或无培养基的条件下，直接和药剂接触，观察药剂生物活性大小和类型。离体条件下反映的仅是供试药剂和病原菌的关系。所以观察的指标（菌丝生长速率、抑菌圈大小和孢子萌发率等） 是供试药剂对病原菌直接毒力的表现。 杀菌剂的离体生物测定主要实验方法孢子萌发法；生长速率法；抑制菌圈法（又称为水平扩散法） ；抑制菌丝产生孢子囊及释放游动孢子试验 ；杀菌剂的对峙培养法 ；生物杀菌剂的拮抗作用测定；杀菌剂混用后的联合毒力测定 孢子萌发法 孢子萌发法是杀菌剂毒力测定中历史最悠久、应用最广泛的方法。早在1807年就开始应用。

13、孢子萌发法是：将不同药剂或相同药剂的不同浓度通过一定方法附着在玻片或其它平面上，当药液水分挥发后形成一层药膜，在药膜上滴加供试菌种的孢子悬浮液，或将药剂与孢子悬浮液混合后，滴于载玻片上，保温保湿培养一定时间后，使用显微镜检查孢子的萌发情况。玻片琼脂表面萌发法 （洋菜薄层法） 悬滴法 生长速率法将不同浓度的药剂与融化的培养基混合，制成带毒的培养基平面，在平面上接种病原菌，通过菌落的生长速度来比较药剂对供试病菌毒力的大小。抑制菌圈法抑制菌圈法最先用于研究抗菌素对细菌的作用，对研究杀细菌剂具有特殊的意义。目前也用于其它杀菌剂的研究。在已接种的培养基上，施加少量的抗菌性物质，使其接触培养基和病原菌，经

14、过一定时间的培养后，接触部分的周围由于抗菌物质的扩散而产生抑菌圈（或抑菌带），其大小与药剂浓度在一定范围内呈一定函数关系。以此来比较杀菌剂毒力大小或进行生物测定。抑制菌圈法主要实验方法 管碟法 滤纸片法 孔碟法 滴下法 洋菜柱法 抑制菌丝产生孢子囊及释放游动孢子试验 本试验方法仅限于测定能产生孢子囊和孢子囊能释放游动孢子的真菌，如疫霉菌，其原理是在一定药剂浓度的培养液中培养病菌，一定时间后检查产生孢子囊和释放游动孢子情况，来比较毒力大小。杀菌剂的对峙培养法在天然物农药研究过程中，常规的筛选方法难以对微量的分离物进行抗菌活性跟踪。为了建立简便、快速的筛选方法，提出了查寻天然物抗菌活性物质的“对峙

15、培养法”。活体生物杀菌剂的拮抗作用测定 作用机理包括有：拮抗作用、竞争作用、重寄生、诱导植物系统抗性等。两种杀菌剂混用后对生物的联合作用有三种： 相加作用，即农药混用后对有害生物的毒力等于混用农药各单剂单独使用时毒力之和； 增效作用，即农药混用时对有害生物的毒力大于各单剂单用时毒力的总和； 拮抗作用，即农药混用时对有害生物的毒力低于各单剂单用时毒力的总和。1、交叉滤纸条法（平滑相接，表示相加作用；相接处凹出，表示增效作用；相接处凸入，表示拮抗作用）2、共毒系数法（二）、杀菌剂活体生物测定在室内控制条件下，杀菌剂、病原菌和活体寄主共存体系中观察药剂生物活性大小和类型的方法。它反映的是特定环境下病

16、原菌、寄主和药剂三者关系，病原菌活性受药剂和寄主生物双重影响，所观察的指标（病斑大小、发病率等） 是病原菌、寄主和药剂的综合表现。活体测定法按测试材料主要有离体组织、器官接种试验、种子杀菌剂药效试验、果实防腐剂生物测定等；按作用方式又可分为先接种后药剂处理的治疗作用测定和先药剂处理后接种的保护作用测定。温室的盆栽测定、大田的药效测定以及室内的一些方法都是该类测定方法。活体生物测定优点：该法的测定结果与实际应用较为接近。活体生物测定缺点：活体生物测定相对耗力、耗物、周期长，程序复杂。 杀菌剂的活体生物测定主要实验方法：抗病毒剂的测定方法；蚕豆叶片法筛选水稻纹枯病杀菌剂 ；子叶筛选法（黄瓜子叶法）

17、；萝卜块根筛选法（滤纸片接种法）；防治香蕉炭疽病菌的组织筛选法 抗病毒剂的测定方法测定方法：浸渍法 常用的接种方法：摩擦接种 病毒的定量培育 评判标准：病斑增值面积或病毒的增值率三、杀菌剂生物测定方法发展趋势 1离体试验向细胞水平发展 从宏观或微观的角度观察药剂对整个作用对象形态的影响。2活体试验向植株组织水平发展 从生理学的角度选用特异的分离的器官或细胞等观察药剂的作用。3离体与活体试验相结合向分子水平发展 从生物化学的角度建立测定药剂效力的方法。常用的洗涤剂1、铬酸洗涤液：是强氧化剂，去污能力很强。2、酸和碱：器皿上粘有焦油、树脂等物质，用洗液不易去掉，可以用浓的硫酸或氢氧化钠溶液（40）

18、使它们溶解后洗去。3、肥皂和其它洗涤剂 ：肥皂水加热后去污能力更强。10%的磷酸钠溶液去油脂的能力很强，比用肥皂水洗涤更加干净。常用的培养基 培养基的种类很多，到1930年为止已经报道了将近2500种，以后不断增加，很难统计现有培养基的数目。这里只列举一些实验室中常用的培养基。1、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：主要用于真菌的分离和培养 2、肉汁胨培养基：主要用于细菌的分离和培养 3、植物组织和煎汁 ：适用于菌种的保存。4、玉米粉琼胶培养基 ：有些真菌能在这种培养基上产生孢子和子实体，有些卵菌能在上面产生有性世代。5、麦芽膏琼胶培养基：适宜于酵母菌和高等担子菌的生长 6.燕麦片琼胶培养基 :促使某些真

19、菌形成孢子和子实体，也适用于保存腐霉属（Pythium）和疫霉属（Phytophthora）真菌的菌种 7、查彼（Czapek）培养液:组合培养基中常用 8、土壤浸渍液琼胶培养基:培养许多土壤微生物 灭菌方法包括物理灭菌、化学灭菌、过滤灭菌1、干热灭菌 ：干热灭菌主要是利用于热空气灭菌，常用的是将器皿放到烘箱内加热的方法 2、湿热灭菌 ：应用最广泛的是高压蒸气灭菌。3、紫外线灭菌：可利用紫外灯来灭菌。紫外线杀菌最有效的波长为20002800，尤其以25002600 最常用。4、化学灭菌 ：一般限于对一些加热易损坏或发生变化的物品，如植物的枝、叶、茎、瓜果等多用化学灭菌。5、过滤灭菌 是用细菌不

20、能通过的滤器，将溶液过滤得到无菌的滤液。农药田间药效试验田间药效试验设计原则重复原则 （减少误差的方法，一般4-5次）局部控制原则 （力求诸如环境、日常管理、虫口密度等条件一致。）随机排列原则（抽签或摸纸团法尽量不掺入人的主观因素进行处理的排列）以上每一种原则都必须设对照区与保护行田间实验设计方法：1、配对法设计：一种新药与一种标准药剂或空白对照做比较，设计简单操作方便，但是会浪费对照用地。2、随机区组设计（应用最多的一种）对照加入处理一起进行重复、随机排列 重复次数12/（7-1）+13、拉丁方设计 每种药剂或处理包括对照在内，在每一横行及直行必须出现一次。 横行数=直行数=处理组田间调查取

21、样的方法大五点法 Z字法棋 盘式法 对角线法 分行法田间取样大小水稻、谷子、小麦密植作物：每点调查一米双行作物上的虫数棉花、玉米宽行作物：每点调查20-40株，检查全株或植株的一部分果树：以株为单位，按果树不同部位调查杂草：以单位面积为取样点，一般0.5-1平方米第二章 杀虫剂生物测定一、杀虫剂生物测定的内容： 1、新药的杀虫活性筛选 2、化合物构效关系3、杀虫剂剂型及加工质量与药效关系 4、杀虫剂混用及增效剂应用5、害虫抗药性研究 6、农药残留检测 7、对植物的药害试验 安全性指数K=药剂防治病虫害所需最低浓度/植物对药剂能忍受的最高浓度8、对高等动物的毒性试验二、杀虫剂生物测定的影响因素外

22、界因素： 环境因素：温度、湿度、光照等对杀虫剂的理化性状和昆虫的生理状态都有影响。 药剂等因素：溶剂、药剂含量、药剂处理部位等 。药剂等因素溶剂：不同溶剂对昆虫表皮的穿透率不同，单位时间内药量也不同，在体内的代谢速率也不同，最后到达靶标部位的药量也不同，结果就有明显的差别。药剂含量：杀虫剂的药剂含量直接影响测量结果，所以一般要求纯度95%以上，或者原药。药剂处理部位：药剂处理部位不同实验结果也不同。如点滴法常因点滴部位不同，得到的毒力不同，点滴部位远则毒力低，以点滴于足或腹部末端毒力最低。一般以点滴胸背面或腹背部为宜。供试体自身因素 杀虫剂理化性能的变化，能影响对昆虫的毒效。昆虫的生理状态，如

23、发育阶段、性别、营养、世代等的不同对杀虫剂有不同的耐药力。三、目标昆虫 标准目标昆虫： 是指被普遍采用的、具有一定代表性和经济意义，以及抗药力稳定均匀的农药杀虫毒力和毒效指示试虫群体。1、完全饲养 就是昆虫的整个生活史都是在人为控制条件下完成的。例如斜纹夜蛾（完全变态的昆虫），从卵幼虫蛹成虫。2、不完全饲养 就是在人工饲养条件下完成部分生活史例如蝗虫（渐变态昆虫），从若虫成虫。饲养可以在室外，也可以在室内进行。（一）、饲养标准目标昆虫的先决条件A:目标昆虫应容易饲养，繁殖力强，不互相残杀，不受季节的限制，能保证周年充分供应。B:供试目标昆虫要求有一定代表性和经济意义。C:目标昆虫群体的生活力和

24、抗药力要稳定和均匀一致 。D:选用合适的虫期、龄期、年龄的试虫群体或混合群体作测试对象。试虫选用原则试虫群体间的虫期比例、虫龄、年龄及虫体大小接近一致，虫龄不宜过大或过小，新羽化的或年龄过大的试虫群体均不宜采用。鳞翅目幼虫作触杀试验时应用3-4 龄，胃毒试验4-5 龄，家蝇用3-7d 龄成虫，蚜虫以无翅成蚜，棉红蜘蛛以活动型成虫（体色为橘红或鲜红）为宜，不应选用暗（褐）红色的老熟成虫。（二）、饲养标准目标昆虫的注意事项 1、种虫 选生活史、繁殖力和抗病力较强的优良种虫。 2、营养条件 一般的营养条件是要求有适量的碳水化合物、蛋白质和氨基酸、脂肪和脂肪酸和辅助营养要素 基本维生素、昆虫的特殊维生

25、素和矿物质等。3、环境条件： 温度、湿度 、光照 四、目标昆虫的移取方法：1、一般移取法 2、趋光法 3、麻醉法：二氧化碳法、挥发蒸气法 、冷冻法、乙醚低温麻醉法 4、吸虫法 5、自行迁移法杀虫剂的生物测定技术1、喷粉及喷雾法 优点：简单，测定结果接近于田间实际情况；缺点：不能避免药剂从口中进入，每头试虫接触的药剂量不能精确计算。 注意事项：药液稍干或虫体粘粉较稳定后才可以移出目标昆虫。要防止试虫逃跑。2、点滴法（局部施药法）每头虫体点滴量一定，可以准确地计算出每头试虫或每克虫体重的用药量；方法比较精确，试验误差小；可以避免胃毒作用的干扰。 缺点：处理目标昆虫的数量不能太多，准确性在很大程度上

26、决定于昆虫本身的生理状态。点滴部位、点滴大小以及目标昆虫处理前的麻醉方式等都有影响，操作技术难掌握，尤其点滴蚜虫时，点滴操作技术要熟练，否则对结果准确性影响较大3、浸渍法 浸渍法是一种测定杀虫药剂触杀毒力的室内测试技术。因方法简单快速，不需要特殊仪器设备，常用于有效化合物的筛选试验，被联合国粮农组织（FAO）推荐为蚜虫抗药性的标准测定方法。快速、简便，可以同时对大批试虫做不同浓度的处理，适用于多种昆虫。不能精确求得每个昆虫或每克虫体重所获药量，浸渍时不能避免少量药液进入试虫消化道和气管，所以测得结果不是单纯的触杀毒力。4、药膜法药膜法比较接近实际防治情况、方法简单、操作方便、应用范围广，几乎一

27、切爬行的昆虫都适用，结果比较准确。是目前常用的一种方法。药膜法还存在一定局限性，如昆虫的足部表皮是杀虫药剂穿透的主要部位时，采用药膜法测得的毒效就偏高，如家蝇，药膜法的毒效高于点滴法。对于某些目标昆虫，足部表皮不是杀虫剂穿透的主要部位或不能穿透的，采用此法测得的结果就偏低。药膜法测得的结果不能表示准确的剂量，即不能表示每克昆虫体重接受的药量，只能用单位面积的药量来表示。而单位面积的药量并不等于药剂进入虫体的剂量。药膜法主要有以下几种方法：1、滤纸药膜法 2、培养皿药膜法 3、玻璃容器药膜法 4、蜡纸药膜法二、 杀虫剂胃毒作用毒力测定昆虫在取食正常食物的同时将药剂摄入消化道，经肠壁细胞吸收进入血液，随血液循环到达作用部位而使昆虫中毒。它利用昆虫的贪食性，因此要尽量避免药剂与昆虫体壁接触而产生其它毒杀作用。测定方法有 1、无限取食法：饲料混药喂虫法；培养基混药法 ；土壤混药法2、定量取食法 ：液滴饲喂法； 口腔注射法； 叶片夹毒法