实验一糖和蛋白质的理化性质检验Word格式.docx

1、6.PH试纸（5-7）7.水浴锅实验试剂1. 卵清蛋白液：将鸡（鸭）蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，离心，上清液冷藏备用。2. 1%茚三酮溶液：1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。3. 浓硝酸：比重1.42。4. 10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100mL。四、实验方法A.黄色反应蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物（苯及苯丙氨酸较难硝化，需用浓硫酸促进之。反应如下：操作方法：于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸5滴，加热，冷却后再加10NaOH溶液20滴，观察颜色变化。B.茚三酮反

2、应蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色。取1mL蛋白质溶液置于试管中，加3-5滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。注意：此反应必须在pH57进行。C.双缩脲反应（参考实验）将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应（双缩脲反应可用以鉴定蛋白质是否完全水解，及用比色法作蛋自质之定量测定）。其反应式如下：1. 取少许结晶尿素放在

3、干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出之氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10NaOH溶液1mL摇匀，再加2滴1硫酸铜溶液，混匀，观察有无紫色出现。2. 另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10NaOH溶液10滴及硫酸铜溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu（OH）2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用，生成深蓝色的络离子Cu（NH3）42，妨碍此颜色反应的观察。第二节蛋白质的沉淀反应1. 熟悉蛋白质的沉淀反应。2. 进一步掌握蛋白质的有关性质。多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后

4、，即产生沉淀。蛋白质沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构改变很小或基本没有改变，仍然保持原来的生物活性，只要消除沉淀因素，沉淀会重新溶解而成原来的胶体溶液。不可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构发生了较大的改变，蛋白质已失去了原来的生物活性，即使沉淀因素消失后，沉淀也不会重新溶解。1. 试管1.5cm5）。2. 吸管5.0L（2），2.0L（3），1.0L（1）。3. 玻璃漏斗5cm1个。4. 滤纸9cm1张。1. 蛋白质试液：见蛋白质颜色反应实验中的卵清蛋白液。2. 硫酸铵晶体：如颗粒太大，最好研碎。3. 饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100L加硫酸铵至饱和

5、（硫酸的饱和度：707g/1000mL）。4. 95乙醇。5. 结晶氯化钠。6. 1%醋酸溶液：冰醋酸1L用蒸馏水稀释至100L。7. 5鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100L。A.蛋白质盐析作用向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。1. 取蛋白质溶液4mL，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50饱和），微微摇动试管，使溶液混和静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。分取一半混合液，加水观察沉淀是否溶解。2. 将混合液的另一半过滤，滤液中加硫酸铵粉末（约0.8g），至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。 （1）

6、 应先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液；（2） 固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。B.乙醇沉淀蛋白质乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。取蛋白质溶液1L，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95乙醇3mL混匀。观察有无沉淀析出。C.生物碱试剂沉淀蛋白质植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。取1支试管，加入2L蛋白质溶液及1醋酸溶液4-5滴，向一管中

7、加5鞣酸溶液58滴，观察结果。D.重金属盐沉淀蛋白质（参考实验）蛋白质与重金属离子（如Cu2,Ag，g2等）结合成不溶性盐类而沉淀。取试管2支各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加醋酸铅溶液，另一管内滴加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。第二部分糖的理化性质第一节糖的颜色反应A.莫氏试验掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与-萘酚生成紫红色缩合物。利用这一性质可以鉴定糖。1. 棉花或滤纸。2. 吸管1.0L（4）、2.0L（3. 试管1.5cm4）。4. 水浴锅1. 莫氏试剂：称取-萘酚5g，溶于95乙醇并

8、稀释至100L。此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。2. 1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100L。3. 1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100L。4. 1%淀粉溶液：将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。5. 浓硫酸于4支试管中，分别加入1mL1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1mL水中），然后各加莫氏试剂滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加人浓硫酸1.5mL（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。1.一些非

9、糖物质（如糠醛、糖醛酸等）亦呈阳性反应。此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。2.亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。3.莫氏试剂应直接滴入试液中，勿使试剂接触试管壁，否则试剂会与硫酸接触生成绿色而掩盖紫色环。B.杜氏试验掌握杜氏（Tollen）试验鉴定戊糖的原理和方法。戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：本试验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖特有反应。果糖、半乳糖和糖醛酸等都呈阳性反应。戊糖反应最快，通常在45s内即产生红色沉淀。1. 吸管1.0mL（2. 试管1

10、.5cm3）3. 水浴锅。1. 杜氏试剂：1%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100mL95乙醇中）3mL，缓缓加入浓盐酸15mL及蒸馏水9mL即得，临用时配制。2. 1%阿拉伯糖溶液：称取阿拉伯糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。见试验A。4. 1%半乳糖溶液：称取半乳糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。于3支试管中各加入杜氏试剂1mL，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。各试管同时放入沸水浴中，观察颜色变化并记录颜色变化时间。C.塞氏试验（参考实验）掌握塞氏（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5一羟甲基糠醛，

11、后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。以糖为例，其反应如下。1. 移液管0.5mL（3），5.0mL（3）。1. 塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100mL盐酸中（V（H2O）:V（HCl）2:1），临用时配制。2. 1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。4. 1%蔗糖溶液：于3支试管中分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%果糖溶液各0.5mL，各加塞氏试剂2.5mL，摇匀，同时置沸水浴内。比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。在此实验条件下，蔗糖有可能水解成果糖与葡萄糖，而呈阳性反应。葡萄糖与麦芽糖亦呈阳性反应，但呈色反应

12、的速度较酮糖缓慢。果糖的红色出现及沉淀的产生，应在加热后20-30s内，生成的沉淀能溶于乙醇并成红色溶液。第二节糖的还原作用掌握用糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。费林（Fehling）试剂和本尼迪特（Benedict）试剂均为含Cu2的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O（由于沉淀速度不同，形成的颗粒大小不同，颗粒大的为红色，小的为黄色。）此法常用作还原糖的定性或定量测定。其反应表示如下：目前临床上多用本尼迪特法，此法具有如下优点：试剂稳定，不需临用时配制；不因氯仿的存在而被干扰；肌酐或肌酸等物质所产生的干扰程度远较费林试剂小。1. 移液管1.0mL

13、（3）、2.0mL（）。4. 试管架。1. 本尼迪特试剂：称取85g柠檬酸钠（Na3C6H3O711H2O）及50g无水碳酸钠，溶解于400mL蒸馏水中。另溶解8.5g硫酸铜于50mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。2. 费林试剂（参考实验）试剂A：称取硫酸铜（CuSO45H2O）34.5g，溶于蒸馏水并稀释至500mL。试剂B：称取氢氧化钠125g，酒石酸钾钠137g，溶于蒸馏水并稀释至500mL。临用时将试剂A与试剂B等体积混合。3. 1淀粉溶液：4. 1蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。5. 1葡萄糖溶

14、液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL，然后每管加本尼迪特试剂2mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。另于3支试管中加人费林试剂A和B各mL，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化（此为参考实验，本实验不做）。五、实验报告1. 内容与要求：实验目的、实验原理、主要实验仪器设备与试剂、实验步骤、实验现象、结果分析与讨论。2. 思考题（1）双缩脲、茚三酮、黄色反应适用鉴别的对象是什么？（2）什么叫蛋白质的变性？盐、乙醇、重金属、生物碱沉淀蛋白质反应哪些是可逆反应，哪些是不可逆反应？（3）莫氏、塞氏、杜氏颜色反应适于鉴别哪类糖？（4）比较斐林和本尼迪特试剂法有何异同？