持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响.docx

1、持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响 作者：彭磊，胡蕴玉，徐华梓，王臻，孟国林，孙峥，潘俊，胡经纬【摘要】 目的探讨持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响，揭示持续压力致假体松动下沉进展及其术后活动影响的生物学机制。方法以新西兰兔的骨髓基质干细胞为实验材料，通过四唑盐（MTT）比色试验，观察压力对骨髓基质干细胞增殖的影响。结果骨髓基质干细胞在20、60、100 kPa持续性压力培养环境下MTT反应的OD值显著小于对照组，压力值越大, OD值越小。20、60、100 kPa 持续性压力可显著抑制骨髓基质干细胞细胞增殖,抑制作用随压力

2、值增大而增强。结论关节置换术后早期患者不宜过早下地，否则将产生持续性应力，可以引起骨髓腔内骨髓干细胞的抑制，不利于骨质愈合。且易产生假体下沉和松动。 【关键词】 骨髓基质干细胞； 持续性压力； 髋关节置换； 细胞增殖 Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of pressure on the proliferation of rabbit bone marrow stromal cells (MSCs) and explain the relationship of the hip prosthesis submerge and loos

3、ening with continuous pressure after revision of total hip replacement.MethodA unit of MSCs pressure model was set up to load different pressures on MSCs cultured in vitro.ResultMSCs showed more proliferation capacity under discontinuous pressure. MTT assay was used to determine the cell proliferati

4、on of primarily cultured MSCs under discontinuous pressure. The MSCs OD value of pressured groups was much smaller than the control group at different times. Various magnitudes and durations of the discontinuous pressure could significantly suppress MSCs proliferation with the magnitude-dependent.Co

5、nclusionAt the early period after revision of total hip replacement, patients should lie and exercise on the bed until 6 weeks. Otherwise, the weight-bearing pressure may restrain MSCs proliferation which is harmful to union and may cause prosthesis submerge and loose.Key words：bone marrow stromal c

6、ells; continuous pressure; revision of total hip replacement; cell proliferation骨髓基质干细胞来源的成骨细胞是骨髓腔内主要的受力细胞，在人工关节置换病例中，其生命活动状况与假体传导压力有密切关系，本文应用可控压力细胞加载装置和通过四唑盐（MTT）比色试验，观察压力对骨髓基质干细胞增殖的影响，以期为揭示持续压力致假体松动下沉进展及其术后活动影响的生物学机制奠定基础。1 材料和方法1.1 实验仪器超净工作台（中国四达净化技术研究所）CO2培养箱（NATURE）YMT-Z倒置显微镜（OLYMPUS）DG3022型酶联免疫

7、检测仪（国营华东电子管厂、第四军医大学联合研制）实验材料:无血清DMEM培养液,含10%FBS的DMEM（含1U/L青霉素及100 mg/L链霉素）25 ml,100 ml培养瓶，24孔,96孔培养板(Gibco),含2%FBS的DMEM（含1U/L青霉素及100 mg/L链霉素）胎牛血清（FCS，浙江金华），噻唑蓝（MTT）（Sigma） 胰蛋白酶（上海生化试剂厂），ABC试剂盒（武汉博士德公司）1.2 实验方法1.2.1 兔骨髓基质干细胞（MSCs）的培养 出生1月的新西兰兔1只，断头处死，无菌条件下取四肢长骨，纵行剖开，用DMEM培养液冲洗骨髓腔，轻轻吹打，静置1 min，使大块组织沉降

8、，取上清接种于10个25 ml培养瓶中培养。24 h后换液，去除未贴壁的血细胞，以后每3 d换液1次，细胞长满培养瓶底部后，用0.25胰酶常规传代，传代比例为1：3。倒置显微镜下观察细胞的生长情况。矿化结节染色： 取第3代细胞，胰酶消化，接种在25 ml培养瓶中，用矿化液(含20%胎牛血清、2 nmol/L -甘油磷酸钠、50 g/ml维生素、10 nmol/L 地塞米松)连续培养30 d,在倒置显微镜下进行观察矿化结节的形成情况。取30 d标本，95酒精固定后行Von-Kossa染色，观察矿化结节的形成情况。1.2.2 细胞加载装置 本实验所用的细胞加载装置是可控压力细胞加载装置（口腔医院修

9、复科提供）。该装置由高压储气室、控压加载室、气流量调控器、压力检测器、计时器所组成。高压储气室储备5%CO2，95%空气，气压大于1.0 MPa。控压加载室通过气流量调控器与高压储气室连接，并由压力检测器和气流量调控器控制加载室室内压力，室内压力与设定压力之误差小于。1.2.3 细胞加载方法 按实验方案设定调试控压加载室气压值。将细胞培养板放入加载室内，关闭室门。再开启气流量调控器向加载室充气加压并计时。到达预定加载时间后，通过排气阀排气减压并打开室门。接受加载后的细胞重新放入CO2培养箱培养或加入试剂染色以观察数量。1.2.4 分组 将生长良好的第3、4 代骨髓基质干细胞按1X104个/孔随

10、机接种于7块24孔培养板，14 h后细胞完全贴壁, 换新鲜含10%FCS的DMEM。按压力施加类型不同分为持续性和间歇性压力，每块培养板的细胞为大组，本实验随机将4块培养板分为4个大组即: 对照组、20 kPa持续组、60 kPa持续组、100 kPa持续组。每大组按观察期分为1、3、5、7 d 4个小组。每小组样本（细胞）为6孔。对照组不予加压，20 、 60、 100 kPa组分别在规定的时间内每天施以20、60、 100 kPa的持续3 h压力。1.2.5 骨髓基质干细胞的存活和增殖的检测方法 在规定的观察期，分别给相应的实验小组加入（MTT, 5 mg/ml）60 l，继续孵育4 h后

11、吸弃孔内液体备检。当各组观察期的反应均完成后，每孔加入二甲基亚砜（DMSO） 600 l，充分振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪（Bio-Rad, USA）测定各孔细胞490 nm波长的光吸收值（OD490 nm）。1.2.6 数据处理各组光吸收均值用spss配对t检验进行统计处理。2 实验结果2.1 细胞生长状况原代培养后，细胞在第57 d内可见细胞从组织块边缘游出，以组织块为中心成放射状向外排列（见图1）。细胞呈长梭形，伸展良好，胞体丰满，胞浆均匀，5代以前细胞生长旺盛，生长状态良好。矿化结节染色阳性(见图2)。2.2 不同观察期骨髓基质干细胞的OD值变化（表1）：自实验

12、第1 d起，各实验组骨髓基质干细胞的OD值逐渐升高。观察期越长，OD值越高。实验组OD值小于对照组OD值。2.3 持续压力对骨髓基质干细胞的OD值的影响（表1）表1 骨髓基质干细胞在不同压力持续作用下的OD值（略）*表示各压力组OD值均数显著低于对照组，P<0.01表示60 kPa组、100 kPa组OD值均数显著低于20 kPa组，P<0.05表示100 kPa组OD值均数显著低于60 kPa组，P<0.05不同持续压力条件下骨髓基质干细胞的OD值变化(表1) ：实验的第3 d，20 kPa组与60 kPa组OD值均数之间无显著差异，但均高于100 kPa组；实验的第5 d

13、，不同压力组OD值均数之间差异显著，压力越高，OD值越低；实验的第7 d，压力较大组的OD值均数低于压力较小组，P<0.05。图1 原代约7 d细胞即可长满，外观为梭形、三角形（100） （略）图2 原代培养4周左右可见白色结节形成（40）（略）3 讨论髋关节置换术后经常发生假体松动、下沉、移位甚至脱落，是关节翻修手术重要因素之一。假体安装或者设计不当都会使骨组织受到不良的应力作用，也可使骨质破坏。关节外科所开展的生物力学研究，多偏重于阐明不同假体设计对股骨及其支持组织的应力分布产生何种影响。由于骨组织生物结构的复杂性，假体接触应力将引起骨组织应力细胞的变化情况及其机理，仍然是个值得探索

14、的新领域。有实验报道，机械性应力应变是骨骼构建与重塑的基本动因1。适宜的应力环境可以促进骨代谢朝着最佳水平发展，反之则可导致不良后果。骨骼内的某些细胞能够感知生物物理性信号（如力学信号、电信号等），加工整合这些信号，并将之转化为相应的骨骼结构变化。细胞的这一功能被称为力学信号转导功能（mechanotransduction）1。这表明在骨骼的功能适应性机制中，力学现象与骨骼的构建、重塑是通过细胞的功能性变化而直接联系起来的。这些具有力学信号转导功能的细胞，由于它们对力学刺激敏感，故又称其为力学敏感性细胞。成骨细胞和破骨细胞分别是骨骼形成和吸收的效应性细胞。成骨细胞是骨骼中最重要的活性细胞，一般

15、认为该细胞是力学信号转导中对应力应变信号进行感知的感受性细胞，同时作为效应性细胞增强骨骼的形成。细胞加载装置是研究体外活细胞对应力效应的先决条件。1985年Benase使用细胞牵张加载装置（flexercell strain unit）, 通过弹性硅胶膜形变使所贴附的细胞受力，观察细胞在周期性牵拉作用下的变化。该系统对检测肌细胞、韧带细胞、骨细胞在张力作用下的反应发挥了重要作用，但其加载载荷的范围受弹性硅胶膜的性能和面积限制，且细胞受力的状况有可能受细胞对弹性硅胶膜粘附效果的影响。细胞液压加载装置3的问世为研究定量压力条件下的细胞力学反应提供了可能。骨髓基质干细胞转化来的成骨细胞是关节置换手术

16、后主要的应力细胞，同时具有合成胶原形成胶原纤维，分泌重要的活性物质以调控骨内组织的代谢等功能。骨髓基质干细胞生活在骨髓腔中, 该组织既是细胞物质交换的媒体又是传递和缓冲应力的介质。假体受力发生位移的同时，必然挤压骨内松质骨的组织液致使其组织液液压亦即骨髓基质干细胞的受力改变。因此，通过改变液压的方式实施对骨髓基质干细胞加载能比较好地模拟临床关节置换术后实际。本实验所用的可控压力细胞加载装置是在Yousefian 2装置基础制作的。该细胞力学模型的建立，为进一步探索和揭示关节置换假体下沉的细胞和分子生物学机理提供了条件。应力对成骨细胞增殖的效应虽有报导，但结论并不一致。Ozawa等则通过向压力培

17、养箱持续注入三种持续加压的混合空气, 作用于鼠成骨样细胞持续性压力，证实持续性压力对成骨细胞有抑制作用3。本研究用可控压力细胞加载装置和MTT法观察了体外环境下正压力对骨髓基质干细胞增殖的影响，在体外培养环境下观察压力对骨髓基质干细胞增殖的影响。取第34代原代培养的骨髓基质干细胞，应用可控压力细胞加载装置分别持续性施加20、60、100 kPa的压力, 分别在培养的第1、3、5、7 d用MTT法测定各组的OD值。表1证实骨髓基质干细胞在20、 60、100 kPa持续性压力培养环境下，MTT反应的OD值显著小于对照组，压力值越大, OD值越小。20、60、100 kPa 持续性压力可显著抑制骨

18、髓基质干细胞细胞增殖, 该抑制作用随压力值增大而增强。发现自实验第3 d起，持续性压力各实验组骨髓基质干细胞的OD值逐渐升高，观察期越长，OD值越高，其中对照组骨髓基质干细胞的OD值升高幅度显著大于加压组。由于MTT比色法是基于活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原为难溶性蓝紫色结晶物（Formanzan）沉积于细胞内，且该结晶被DMSO溶解并在酶联免疫检测仪显色，其OD值间接反应被检样本内的活细胞数的原理，因此，骨髓基质干细胞经 d 20 kPa以上持续性压力作用后，其增殖受到明显的抑制，并且该压力抑制作用具有时间效应。据Kletsas4,5报导，成骨细胞牵张力作用1-6 h后就可以出

19、现DNA合成活跃。而本文实验的第1 d，压力组骨髓基质干细胞的OD值与对照组之间并无显著差异。这表明若从细胞学水平观察压力对骨髓基质干细胞的效应，其效应出现在接受刺激的1 d之后。比较不同持续性压力条件下骨髓基质干细胞的OD值变化可见，实验的第 d 20 kPa组与60 kPa组OD值均数之间无显著差异；实验的第 d，不同压力组组间OD值均数的差异在统计学上不显著；而实验第 d，不同压力组OD值均数间差异显著，这提示压力对骨髓基质干细胞增殖的抑制效应并不完全是直线型的。本实验提示临床关节置换术后，早期下地产生的持续性应力，会明显引起骨髓腔内骨髓干细胞增殖的抑制，不利于骨的重建愈合，更易产生假体

20、下沉和松动。【参考文献】 1 Turner CH, Akhter MP.The mechanical of bone adaptation. In: Mechanical loading of bones and jointsM. Takahashi HE.(Ed). Springer Verlag, Tokyo,1999.2 Ishida M, Tomita S,Natatani T,et al. Acuta effects of direct cell implantation into the heart: a pressure volume study to analyze cardi

21、ac functionJ. J Heart Lung Transplant，2004,23(7):881-888.3 Athanassiou G,Deligianni D. Adhesion strength of individual human bone marrow cells to fibronectin. Integrin betal mediated adhesionJ.J Mater Sci Mater Med，2001,12(10-12):965 970.4 Kobayashi N, Yasu T, Ueba H,et al.Mechanical stress promotes the expression of smooth muscle like properties in marrow stromal cellsJ. Exp Hematol，2004,32(12):1238-1345.5 Koike M, Shimokawa H, Kanno Z, et al.Effects of mechanical strain on proliferation and differentiation of bone marrow stromal cells line ST2J. Bone Miner Metab,2005,23(3):219-225.