谷胱甘肽响应的可激活磁共振成像纳米探针的制备研究 学位论文.docx

1、谷胱甘肽响应的可激活磁共振成像纳米探针的制备研究 学位论文本科生毕业论文谷胱甘肽响应的可激活磁共振成像 纳米探针的制备研究 姓 名： 杨 娜 学 号： 1110371042 学 院： 医学影像学院 专 业： 生物医学工程 年 级： 2011级 指导教师： 李菁菁 职 称： 助理研究员 2015年6月 徐州徐州医学院生物医学工程专业本科毕业设计任务书学院 医学影像学院 专业年级 2011级生物医学工程 学生姓名 杨娜 任务下达日期： 年 月 日毕业设计日期： 年 月 日至 年 月 日毕业设计题目：谷胱甘肽响应的可激活磁共振成像纳米探针的制备研究毕业设计主要内容和要求：1完成四氧化三铁纳米粒子（F

2、e3O4）、氧化钆（PEG-Gd2O3）及胱胺的制备，并对其性能进行表征，研究其特性。2. 谷胱甘肽响应的可激活磁共振成像纳米探针的组装，即在偶联剂存在下，将Fe3O4与PEG-Gd2O3通过胱胺结合形成Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针，并通过控制单一变量的方法对纳米探针中的Fe3O4和PEG-Gd2O3浓度进行优化，确定最佳信噪比的用量。3. 通过纳米探针对786-0肾癌细胞的生长抑制作用评估其生物相容性。院长签字： 指导教师签字：徐州医学院生物医学工程专业本科毕业论文指导教师评阅书指导教师评语（基础理论及基本技能的掌握；独立解决实际问题的能力；研究内容的理论依据和技术方法；取得的主要成

3、果及创新点；工作态度及工作量；总体评价及建议成绩；存在问题；是否同意答辩等）：成 绩： 指导教师签字： 年 月 日徐州医学院生物医学工程专业本科毕业论文评阅教师评阅书评阅教师评语（选题的意义；基础理论及基本技能的掌握；综合运用所学知识解决实际问题的能力；工作量的大小；取得的主要成果及创新点；写作的规范程度；总体评价及建议成绩；存在问题；是否同意答辩等）：成 绩： 评阅教师签字： 年 月 日徐州医学院生物医学工程专业本科毕业论文答辩及综合成绩答 辩 情 况提 出 问 题回 答 问 题正 确基本正确有一般性错误有原则性错误没有回答答辩委员会评语及建议成绩：答辩委员会主任签字： 年 月 日学院领导小

4、组综合评定成绩：学院领导小组负责人： 年 月 日摘 要目前，恶性肿瘤是威胁人类健康的常见病、多发病。MRI在神经系统、肌肉骨骼、心血管和肿瘤等疾病的诊断中具有独特的优势，然而如何设计制备新型可激活磁共振成像（MRI）分子探针用于肿瘤成像仍然研究较少，这对于提高肿瘤诊断的特异性具有十分重要的意义。研究表明，肿瘤组织较正常组织中谷胱甘肽（GSH）高表达。因此，本文设计了谷胱甘肽响应可用于肿瘤细胞的特异性成像的可激活磁共振分子成像探针。讨论了将阳性对比剂(PEG-Gd2O3)及阴性对比剂（SPIO: Superparamagnetic Iron Oxide）通过胱胺相连接制备成GSH响应的可激活磁共

5、振对比剂（Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针）的制备方法及其优化。当没有谷胱甘肽存在时，SPIO产生的强磁场对PEG-Gd2O3的MR信号有淬灭作用，MR T1信号变弱，当有谷胱甘肽存在时，纳米探针的双硫键被打开，MR T1信号变强。与目前临床最常使用的Gd-DTPA相比，纳米对比剂具有弛豫率高、敏感性强、特异性高等优点。本文也通过MTT测试证明Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针具有良好的生物相容性。将不同浓度Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针与肾癌细胞786-0作用，当Gd3+浓度低于0.2mM时，细胞形态良好未发生明显改变；MTT测试表明，当Gd3+浓度低于0.1mM时，细胞的存活率

6、均在90%以上，当Gd3+浓度高于0.15mM时，细胞存活率明显降低。关键词：谷胱甘肽； 可激活磁共振成像； 纳米对比剂； 磁共振成像分子探针ABSTRACTCurrently, cancer is a common and multiple disease which is a threat to human health. Magnetic resonance imaging (MRI) has unique advantages in diagnosis of diseases such as the nervous system, musculoskeletal, cardiovasc

7、ular and tumor. However, the researches on how to design activatable MRI molecular probe which can be used for the specific tumor imaging is still scarce. The development of this kind of probes would improve the sensitivity of MRI for its role in the field of diagnosis of tumor obviously.Studies hav

8、e shown that glutathione(GSH)s content in tumor tissue is significantly higher compared with normal tissue. Therefore, in this thesis, GSH-response activatable MRI molecular probe was desgined for the specific MRI of tumor cells. The preparation and optimization of activated MRI probe (Fe3O4-SS-Gd2O

9、3 nanoprobe), which was formed by the combination of PEG-Gd2O3 and Fe3O4 with cysteamine as linker were discussed. In the absentance of GSH, the magnetic field generated by SPIO perturbs the relaxation process of PEG-Gd2O3. This phenomenon induces the quenching of T1 signal. But in the presence of G

10、SH, the disulfide bond of nanocomposite is opened, MR singal of T1 becomes brighter. Compared with Gd-DTPA, which is commonly used in clinical diagnosis, the nanoparticle-based MRI contrast agents not only have higher relaxationrate, but also have higher sensitivity and specific.Furthermore, with th

11、e MTT test, Fe3O4-SS-Gd2O3 nanoprobes displayed good biocompatibility. Renal carcinoma 786-0 cell were incubated with different concentrations of Fe3O4-SS-Gd2O3 nanoprobes. When the concentration of Gd3+ was below 0.2 mM, cell morphology were good. The results of MTT showed that when the concentrati

12、on of Gd3+ was lower than 0.1 mM, cell viabilities were more than 90%, and when the concentration of Gd3+ was higher than 0.15mM, cell viabilities were decreased.Key words: Glutathione; Activatable MRI; nanoparticle-based contrast agent; MRI molecular probe目 录1 绪论 11.1研究背景 11.2课题的提出 41.3论文结构和各章节安排 4

13、2 材料合成 52.1四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子合成 52.1.1引言 52.1.2实验试剂及器材 52.1.3实验步骤 62.1.4透射电子显微镜（TEM：Transmission electron microscope）扫描 62.1.5 ICP-MS制样 72.1.6 MR扫描 72.1.7傅里叶变换红外光谱分析 82.2 PEG-Gd2O3合成 92.2.1引言 92.2.2实验试剂及器材 92.2.3透析袋前处理 102.2.4实验步骤 102.2.5 MR扫描 112.2.6傅里叶变换红外光谱分析 122.3 胱胺合成 132.3.1引言 132.3.2实验试剂及器材 132

14、.3.3实验步骤 142.4讨论 143 可激活MRI纳米探针Fe3O4-SS-Gd2O3的制备 153.1 Fe3O4-SS-Gd2O3的傅里叶变换红外光谱分析 153.2不同浓度四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子对MRI信号的影响 153.3不同浓度氧化钆（PEG-Gd2O3）对MRI信号的影响 163.4谷胱甘肽（GSH）对T1弛豫率的影响 173.5不同浓度谷胱甘肽（GSH）的MRI信号响应 183.6 讨论 194 可激活MRI纳米探针Fe3O4-SS-Gd2O3的MTT测试 204.1 实验试剂及器材 204.2 NIH 3T3小鼠成纤维细胞培养 214.2.1 NIH 3T3小鼠成

15、纤维细胞复苏 214.2.2 NIH 3T3小鼠成纤维细胞传代 224.2.3 NIH 3T3小鼠成纤维细胞计数 224.2.4 NIH 3T3小鼠成纤维细胞冻存 224.3 786-0肾癌细胞培养 224.3.1 786-0肾癌细胞复苏 234.3.2 786-0肾癌细胞传代 234.3.3 786-0肾癌细胞计数 234.3.4 786-0肾癌细胞冻存 244.4 NIH 3T3小鼠成纤维细胞、786-0肾癌细胞种板 244.5 MTT测试 254.5.1 786-0肾癌细胞形态表征 264.5.2 786-0肾癌细胞存活率测定 264.6 讨论 275 总结与展望 285.1总结 285

16、.2展望 28参考文献 30翻译 33英文原文 33中文译文 40致 谢 45 1 绪论1.1研究背景近年来，肿瘤的发生越来越多，且发病年龄越来越年轻化。然而，肿瘤很难在早期得到及时诊断和治疗，因此，恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的常见病，多发病，早期特异性诊断可提高患者生存率，改善生活质量1。由于传统影像诊断方法主要针对实质性肿瘤，此时患者已经处于临床中晚期，故治疗效果差，预后较差。所以，恶性肿瘤仍然是威胁人类健康与寿命的一大关键因素。因此，在临床上找到一种有效的肿瘤检查方式与诊断方法并进行良恶性判定具有十分重要的意义。既往有大量的研究专注于寻找特异性的肿瘤血清标志物，应用于肿瘤的早期诊断2

17、。研究发现，肿瘤组织中谷胱甘肽（GSH）含量明显高于肿瘤旁组织，在人乳腺癌细胞MCF-7中，谷胱甘肽的浓度为（6.29士0.67）nmol/106。吴琛珩等对人消化道肿瘤组织的检测结果也揭示，肿瘤组织内还原性谷胱甘肽和辅酶（GSH、NADPH）的含量显著高于相应的癌旁组织，提示肿瘤细胞中确有GSH的高表达3。随着分子生物学和医学影像学的飞速发展，近年来产生了一门新兴的交叉学科-分子影像学。分子影像学是指运用影像学的手段，在组织、细胞和亚细胞水平显示活体状态下某些特定分子的变化，对生物学行为进行定性和定量的研究，为疾病过程在体监测、基因治疗、在体示踪、药物在体疗效评测和功能分子在体活动规律研究提

18、供新技术。分子影像学在疾病早期诊断、提供疾病发展重要信息和评价治疗效果方面具有诱人的潜能，具有无创、实时、在体、特异、精细显像等优点4-6。所以，分子影像技术可望为疾病的研究和临床“早早期”诊断、治疗提供基因分子水平信息，而在分子影像学成像技术中，靶向性和高亲和性分子探针的制备起着关键作用7-8。磁共振成像是利用生物体不同组织在磁共振过程中产生的具有不同特征的电磁波信号成像技术，是上世纪80年代以来医学影像学发展的最新成就之9-10。磁共振成像技术也因为其无创伤性、无辐射损伤、非侵入性、并具有多序列、多参数（不同组织与磁共振有关的特征参数如质子密度、纵向弛豫时间、横向弛豫时间、弥散系数等都可以

19、作为成像参数）、任意平面成像、较高的密度分辨率等优点11广泛的应用于临床，已经成为临床诊断中最常用的影像检查手段之一12。但是随着医学技术的飞速的发展和人们生活水平的日益提高，常规的磁共振检查已经不能满足临床诊断的要求，人们对磁共振成像的特异性、精确性、敏感性提出了更高的要求。为了实现对微小病变及隐匿病变的早发现、早诊断、早治疗，学者纷纷投入到提高疾病诊断准确性的成像方法的研究。虽然单一的磁共振成像设备已经对脂肪、软组织等低密度组织具有的成像效果，但它仍然不可以实现对全身任意组织的扫描成像并提供有诊断价值的图像。通过磁共振和其他成像设备的结合（例如磁共振和PET的结合形成PETMRI）13-1

20、4，多通道探测器可视化的开发，不仅可以从解剖水平观察病变，而且可以从分子代谢水平研究病变组织的代谢情况从而定性诊断疾病。但是这样的组合仍然存在许多固有的问题，如因多个成像器件空间分辨率及时间分辨率的图像定位导致生物样品的差异所造成的困难15。另一解决方案为：磁共振对比剂。磁共振对比剂的应用更是极大地拓展了磁共振成像技术的临床适用范围。磁共振造影剂是能够缩短组织在外磁场作用下的共振时间、增大对比信号的差异、提高成像对比度和清晰度的一类诊断试剂16。磁共振对比增强的基本原理是通过改变内、外界弛豫效应和磁化率效应间接地改变组织的信号强度，从而达到提高不同组织间信号差异的目的。磁共振对比剂的应用，可以

21、增强正常组织与病变组织之间的信号对比，使微小病变更加突出，使得微小病变与隐匿病变的早发现、早诊断成为可能。它能有效改变生物体内组织中局部的水质子弛豫速率，缩短水分子中质子的弛豫时间，准确地检测出正常组织与患病部位之间的差异，从而最终显示生物体内各器官或组织的功能状态。磁共振对比剂要应用于人体，除了要满足药物的基本要求，具有生物适应性、水溶性好和良好的稳定性外，还应具有以下特性：（1）靶向性：即对比剂进入人体后能选择性聚集，在靶组织富集并停留一段时间，使靶区域被观测核的弛豫速率比其他正常组织部位有更大的增强，以达到增加正常组织与病变组织的对比度。（2）细胞毒性小：对比剂中游离的稀土金属离子和配体

22、毒性较强，而其配合物毒性较低。稀土金属离子的置换效应是毒副作用的主要影响因素，所以MRI对比剂在体内的有效期中应为稳定配合物。（3）高的弛豫率：对比剂对水质子的弛豫能力影响其在体内磁共振成像的效果。弛豫能力越强，活体成像效果就越好。（4）在体内有适当的存留时间：既为成像提供必要的时间，又易于从体内排出，不会在体内积累。按增强类型不同，磁共振对比剂可以分为阳性对比剂和阴性对比剂。阳性对比剂一般是指可以增强信号强度的顺磁性物质，例如轧剂、氧化锰等。阳性对比剂以缩短T1弛豫时间为主（在T1加权成像中增加信号的强度），表现在图像上增强区显示信号增强。在T1加权像中，由公式I=KN(H)(1-e-TR/

23、T1)可知，如果组织器官的T1短，则MR信号强度强，图像变亮；如果组织器官T1长，则MR信号强度弱，图像变暗。目前应用最广泛的磁共振阳性对比剂即Gd-DTPA，中文名为二乙三胺五醋酸钆或钆喷酸葡甲胺盐，商品名为马根维显（Magnevist）17-18。Gd-DTPA是一种顺磁性物质，它的增强原理为：Gd3+具有7个不成对电子，其不成对电子与质子一样为偶极子，具有磁距。电子质量很轻，但其磁距约为质子的657倍。在无顺磁性物质的情况下，组织的T1弛豫是由质子之间的偶极子-偶极子相互作用，形成局部磁场波动所引起的。在有不成对电子的顺磁性物质存在时，由于电子的磁化率约为质子的657倍，从而产生局部巨大

24、磁场波动。此时，大部分电子的运动频率与Larmor频率相近，而使邻近质子的T1弛豫时间缩短，即形成所谓质子偶极子-电子偶极子之间的偶极子-偶极子相互作用，引起所谓质子磁豫增强，其结果造成T1弛豫时间缩短。在Gd-DTPA浓度较低时，由于机体组织的T1弛豫时间较长，故对比剂对机体组织的T1弛豫时间影响较大。然而，随着Gd-DTPA浓度增加，T2缩短效应渐趋明显。Gd-DTPA通过改变周围氢核的磁性起作用，具有亲水性、相对分子质量小的特点，注入血管后迅速向周围组织间隙分布，由肾脏排泄，对各系统的病变都有诊断与鉴别诊断的价值。虽然Gd-DTPA被广泛的应用于临床19-22，但存在很多的缺陷。为了降低

25、Gd3+本身的毒性，人们采取制备钆离子螯合物的方式来提高对比剂的生物相容性。但螯合物的形成会降低对比剂的对比度，因为与水合钆离子的8-9个位点来说，钆离子螯合物中可与水质子交换的配位点的数目只有1-2个。另一方面，绝大多数的钆对比剂的血液循环时间较短，对组织和细胞缺少选择性，难于表面功能化也限制了其进一步应用。同时，钆离子螯合物中的Gd3+一旦去螯合或者与人体中存在的其他离子，如Zn2+等，交换螯合后被释放有可能会带来潜在的毒性。而且有报道指出钆基对比剂会对生物体肾小管造成直接损害，引起肾细胞纤维化23。且绝大多数钆类小分子对比剂都是离子型造影剂，体内渗透压较高，在体内存留时间较短，易经肾脏代

26、谢后迅速排出，不具有组织或器官的选择性，常常迅速渗透到细胞外液间隙而产生背景影像强化。因此，如何开发具有靶向性、高弛豫效率、使用安全的对比剂是MRI研究的重点和主要发展方向之一。随着科学技术的进步，关于纳米粒子的研究越来越成为众多学者关注的焦点，许多纳米材料的磁共振阳性对比剂应运而生24，例如：PEG-Gd2O3、BSA- Gd2O325-26等。由于纳米粒子的特性，更易于进行表面功能化与功能组装，提高其靶向性。使对比剂不仅具可以辅助诊断，而且可以具有治疗作用。阴性对比剂通常是超顺磁性的纳米粒子（例如氧化铁）及高浓度的顺磁性物质。阴性对比剂以缩短T2弛豫时间为主（在T2加权成像中降低信号强度）

27、，呈暗或黑色低信号。在T2加权像中，由公式I=KN(H)e-TE/T2可知，如果组织器官T2长，则MR信号强度强，图像变亮；如果组织器官T2短，则MR信号强度弱，图像变暗。超顺磁性氧化铁（SPIO：Superparamagnetic Iron Oxide）是近年来迅速发展的一种纳米材料27，由于其特殊的化学结构，在较弱的外磁场中就可产生巨大的磁性，而外磁场撤销后无剩磁。它的作用原理为：SPIO颗粒直径40400m，表面用葡聚糖包裹。由于血液中直径在305000nm的颗粒主要经网状内皮系统清除，因而静脉注射后该类对比剂进入肝脏及脾脏的网状内皮细胞(RES：Reticuloendothelial

28、system)，产生短T2效应，在肝脏枯否细胞可摄取对比剂颗粒。由于正常肝脏存在枯否细胞，而肿瘤内一般无或少含无枯否细胞，因此对比剂能增加肿瘤与肝实质间的对比，从而提高肝脏肿瘤的检出率，对鉴别肿瘤是否肝细胞来源也有较大价值。目前有多种网状内皮细胞性MR对比剂已经商品化，如AMI-25和Feridex（菲立磁）28等。SPIO纳米粒子由不同的外层材料包裹三氧化二铁或四氧化三铁形成，其颗粒小，穿透力强，弛豫率为同条件下钆离子的7-10倍，在很低浓度条件下即可在MRI形成对比29。更重要的是，SPIO纳米粒子通过表面化学修饰可以进一步结合特殊的抗体、氨基酸、蛋白或酶而具有吸收特异性30。但是，SPI

29、O纳米粒子被细胞吸收后聚集于溶酶体中，在溶酶体低的pH环境里，被分解成为铁粒子，可用于合成血红蛋白，因而在体内具有低的毒性31。1.2课题的提出综上所述，单一模态的磁共振对比剂，虽然在常见疾病的诊断上已经发挥出巨大的作用，但是对于一些微小隐匿病变仍然无法提供具有高诊断准确性的MRI图像。而且单模态对比剂毒性大，在体内会产生非特异性聚集，使非病变组织产生增强的MR信号，从而导致高的非特异性背景和低目标背景比。因此，单模态的磁共振对比剂正面临巨大的挑战。基于此，我们提出将阴性超顺磁性纳米粒子氧化铁对比剂和阳性PEG-Gd2O3对比剂相结合的可激活磁共振对比剂。可激活对比剂具有高弛豫率、细胞毒性小、

30、靶向性好、特异性强、敏感性高等特点。目前，关于可激活对比剂的报道并不多，因此可激活对比剂成为众多学者研究的重点。SPIO和PEG-Gd2O3表面都含有羧基（CO）,通过表面含有两个氨基（NH）的胱胺相连接，当没有肿瘤细胞存在时，由于SPIO产生的磁场对PEG-Gd2O3的磁共振信号有淬灭作用，在磁共振T1图像上没黑色或灰黑色，当有肿瘤细胞存在时，由于肿瘤细胞中谷胱甘肽（GSH）含量比正常细胞高出许多，谷胱甘肽将连接SPIO和PEG-Gd2O3的双硫键打开，在磁共振T1图像上表现为明亮或白色信号。从而实现对肿瘤的靶向作用。提高诊断的准确信和特异性。1.3论文结构和各章节安排论文第一章简要介绍了本

31、实验的研究背景，且阐述了本文研究内容的提出。论文第二章对阳性对比剂PEG-Gd2O3和阴性对比剂SPIO以及“连接物”胱胺的合成方法、性质进行了详细的阐述和介绍。论文第三章讨论了可激活对比剂Fe3O4-SS-Gd2O3的制备过程及优化。论文第四章进行了可激活对比剂Fe3O4-SS-Gd2O3的细胞毒性研究，利用MTT法考察其生物相容性。论文第五章：总结与展望。2 材料合成2.1四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子合成2.1.1引言氧化铁( 通常指磁铁矿 Fe3O4 或者磁赤铁矿 Fe2O3) 纳米粒子，应用于磁共振成像已有20多年的历史了。超顺磁性氧化铁( SPIO，粒径小于30 nm) 纳米粒子网状内皮组织吸收，在肝、脾、骨髓等组织会器官处富集会大大缩短T2弛豫时间，SPIO 作为 T2造影剂的典型代表，已经临床多年，如 Feridex IV Resovist Lumirem 进行肝脏造影、追踪成像等32-36。近年来，随着纳米技术的飞速发展，四氧化三铁纳米颗粒作为功能材料，在磁记录材料、特殊催化剂原料、磁流体的基本材料和磁性颜料、药物等方面显示出许多特殊功能，有关纳米磁性Fe3O4的制备方法及性质的研究也受到广泛关注。SPIO纳米粒子的合成方法有许多种，常用的有共沉淀法、微乳液法、超声空气法等37-38。其中，共沉淀