基因家族分析套路.docx

1、基因家族分析套路基因家族分析套路（一）近年来，测序价格的下降，导致越来越多的基因组完成了测序，在数据库中形成了大量的可用资源。如何利用这些资源呢？今天小编带你认识一下不测序也能发文章的思路-全基因组基因家族成员鉴定与分析（现在这一领域可是很热奥）；一、基本分析容数据库检索与成员鉴定进化树构建保守domain和motif分析.基因结构分析.转录组或荧光定量表达分析.二、数据库检索与成员鉴定1、数据库检索1）首先了解数据库用法，学会下载你要分析物种的基因组相关数据。一般也就是下面这些数据库了Brachypodiumdb:.brachypodium.org/TAIR:.arabidopsis.org

2、/RiceGenomeAnnotationProject：rice.plantbiology.msu.edu/.Phytozome:Ensemble:ensembl.gramene.org/genome_browser/index.htmlNCBI基因组数据库：.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/?term=2）已鉴定的家族成员获取。 如何获得其他物种已发表某个基因家族的所有成员呢，最简单的就是下载该物种蛋白序列文件（可以从上述数据库中下载），然后按照文章中的ID，找到对应成员。对于没有全基因组鉴定的，可以下列数据库中找：a.NCBI:nucleotideandprotein

3、db.b.EBI:.ebi.ac.uk/.c.UniProtKB:.uniprot.org/uniprot/2、比对工具。一般使用blast和hmmer，具体使用命令如下：LocalBLASTformatdbidb.faspF/T；blastallpblastp(orelse)iknown.fasddb.fasm8b2(orelse)e1e-5oalignresult.txt.-b:outputtwodifferentmembersinsubjectsequences(db).Hmmer(hiddenMarkovModel)search.ThesameasPSI-BLASTinfunction

4、.Ithasahighersensitivity,butthespeedislower.Command:hmmbuild-informatafaknown.hmmalignknown.fa;hmmsearchknown.hmmdb.fasalign.out.3、过滤。Identity:至少50%.Coverregion:也要超过50%或者蛋白结构域的长度.domain:必须要有完整的该蛋白家族的。工具pfamdb(pfam.sanger.ac.uk/)和NCBIBatchCD-search.(.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi).EST支

5、持BlastandHmmer同时检测到4、通过上述操作获得某家族的所有成员基因家族分析套路（二）本次主要讲解在基因家族分析类文章中，进化部分分析的容。主要是进化树的构建与分析。一、构建进化树的基本步骤、多序列比对.Muscleprogram.、Model选择.分别针对蛋白序列和核酸序列的模型选择程序。ProtTestprogramforproteinandModelTestorJmodetlestforDNA(user.qzone.qq./58001704/blog).、算法选择。三种.NJ,MLandBI.、软件选择。MEGA(bootstrapleast1000replicates),ph

6、yMLandMrbayes(user.qzone.qq./58001704/main).、进化树修饰.MEGA:view-optionsandsubtree-drawoptions.Alsocanbedecoratedinword(user.qzone.qq./58001704/main)二、具体步骤2.1多序列比对。一般采用muscle。因为MUSCLEisoneofthebest-performingmultiplealignmentprogramsaccordingtopublishedbenchmarktests,withaccuracyandspeedthatareconsisten

7、tlybetterthanCLUSTALW.2.2模型选择。对于用蛋白序列构建进化树的可以采用下面命令：java-Xmx250m-classpathpath/ProtTest.jarprottest.ProtTest-ialignmfile.phy.运行结果如下图注意：1）“.Phy”format.Onlyallowtencharaters.注意名字不能重复相同。2）AIC:AkaikeInformationCriterionframework.3）Gammadistributionparameter(G):gammashape.3）proportionofinvariablesites:I.

8、2.3 构建进化树2.3.1意义：a聚类分析。如亚家族分类。像MAPKKK基因家族通过进化树可以清楚分为MEKK,RafandZIK三个亚家族.b亲缘关系鉴定。在进化树上位于同一支的往往暗示这亲缘关系很近c基因家族复制分析。研究基因家族复制事件（duplicationevents），两种复制事件类型常采用的标准：Tandemduplication:Identityandcoverregionmorethan70%andtightlylinked(Holub,2001).Chromosomalsegmentduplication:PlantGenomeDuplicationDatabase(PG

9、DD:chibba.agtec.uga.edu/duplication/)2.3.2进化树。一般ML树比较准确，但应结合方法，如NJ树，相互验证。2.3.3进化部分分析：KaKs计算2.3.3.1简单的方法.可以使用下面的网页PAL2NAL(.bork.embl.de/pal2nal/)2.3.3.2标准方法：.a.ParaAT:ParaAT.pl-htest.homologs-ntest.cds-atest.pep-pprocfaxtk-ooutputb.KaKs_CalculatormNG(orelse)-itest.axt-otest.axt.kaksc.分歧时间计算：Divergent

10、time（T）calculation.T=Ks/2.:mean5.1-7.110-9.d. Ka/Ks意义： Ka/Ks=1.中性进化。. Ka/KsKa/Ks1.正选择。Positivelyselectedgenesandproducefitnessadvantagemutationstoevolvenewfunctions.基因家族分析套路（三）本节主要讲基因结构分析套路1、Motif分析使用软件MEME，命令如下：memesample.fa-dnarevcomp-nmotifs10-modzoops-minw6-maxw50meme_htmlFormat.html2、基因结构分布图可以使

11、用在线GSDS2.0：website:用法如下：结果展示3、基因结构常见统计信息：自己excel或写程序统计a.Thenumberofintronandexon.b.Thesplicingintronpatterninculding0,1,2phase.c.Themarkedregion.Forexamplekinasedomain.d.sequencelength.e.UTR.4、启动子分析。：主要做植物的：bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/注意事项：a.IEbrower.b.Onlyonesequenceforonces

12、earchandthelengthwaslimitedin1000bp.c.DNAsequenceorigin:1000or1500bpupstreamofATGofonegene.分析结果：基因家族分析套路（四）一、转录组及芯片原始数据下载1、GEOdatesets/profile(.ncbi.nlm.nih.gov/gds).。用法见下图。GEO数据ID命名规则：GPL-GSE-GSM.GPL:platformGSE:multipleseries.GSM:multiplesamples.GDSGSE.ThedifferenceconcentratedonthedatalabeledGDSc

13、anbeanalyzedforonegeneonline.Itissimpleandeasily.ThedatainthesameGPLcanbeusedtocompareinexperiment下面是在线分析转录组数据的用法：2、EBIArrayExpress(.ebi.ac.uk/arrayexpress/)该数据库下载数据用法如下：3、PLEXdb(.plexdb.org/).该数据库下载数据用法如下，注意用户名和密码！4、SRAdb(.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)5、DRAdb（trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/）二、数据处理拿到原始数据，要

14、进行处理，才能进行后续数据分析。1、芯片数据。原始数据格式“.cel”格式。以AffyMicroarray数据处理为例讲述主要的命令如下：library(affy);library(makecdfenv);librarybarleyGenome=make.cdf.env(“barleyGenome.cdf)mydataesetwrite.exprs(eset,file=mydata.txt)designcolnames(design)fitcontrast.matrixfit2fit2topTable(fit2,coef=1,adjust=fdr,sort.by=B,number=10)#Ge

15、nerateslistoftop10(number=10)differentiallyexpressedgenessortedbyB-values(sort.by=B)forfirstcomparisongroup.write.table(topTable(fit2,coef=1,adjust=fdr,sort.by=B,number=500),file=limma_complete.xls,row.names=F,sep=t)#Exportscompletelimmastatisticstableforfirstcomparisongroup.results-decideTests(fit2

16、,p.value=0.05);vennDiagram(results)2、转录组数据处理。原始数据格式为sra或fastq格式。Sra可以转换为fastq然后运用下面的命令进行处理。1）获得cleandata；fastx_clipper:clipadapter.fastq_quality_filter:basequalitycontrol.fastq_quality_trimmer:trim5lowqualitybases.2）计算RPKM.bowtie2-buildpath/db.seqpath/dbtophatdbread.fastqbam_filterpath/accepted_hits.bamsamtoolsview-h-ooutput-uniq.samoutput_uniq.bamexcelforcalculation(lowfrequencyreads5wereomitted).3）差异表达的基因。寻找存在差异表达的家族成员，推测其可能的功能。有下面两种分析策略，均可采用。a.倍数法。对于基因家族分析，可以采用倍数法，以2倍为标准，得到上调和小的基因b.CV值。计算某个成员在不同处理下的基因表达变化。CV=SD/mean.Usedindifferenttissuesororgansanlysis.