线粒体与细胞凋亡调控.docx

1、线粒体与细胞凋亡调控线粒体与细胞凋亡调控土上II 1 I比 g线粒体与细胞凋亡调控朱玉山1,佺陈 1,2*(1南开大学生命科学学院,天津300071; 2中国科学院动物研究所,生物膜与膜生物工程国家重点实验室，北京100101摘要:细胞凋亡是一个受到一系列相关基因严格调控的细胞死亡过程。线粒 体是细胞凋亡调控的活 动中心。在凋亡因子的刺激下，线粒体释放出不同促凋亡因 子如细胞色素C、Smac/Diablo等激活细胞内凋亡蛋白酶Caspasa我们发现，活化后的Caspase可以反过来作用于线 粒体,引发更大量线 粒体细胞色素C的释放，构成细胞色素C释放的正反馈调节机 制,从而导致电子传递链的中断

2、、膜电 势的丧失、胞内ROS的升高以及线粒体产生ATP功能的完全丧失。Bcl-2家族蛋白在细胞色素C释放和细胞凋亡调控中起关 键作用。关键词:线粒体;细胞色素C ;细胞凋亡；C a s p a s e ; B cl -2中图分类号：Q244; Q255 文献大标题:AMitochondria and apoptosis regulationZHU Yu-shan1, CHEN Quan1,2*(1 College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China; 2 National Key Laboratory of Bi

3、omembra ne andMembra ne Biotech no logy, In stitute of Zoology, Chin ese Academy of Scien ces,Beijing 100101, Chi naAbstract: Apoptosis is a highly regulated form of programmed cell death, which plays a key role in thedevelopme nt and homeostasis of multicellular orga ni sms. Mitochondria play a cen

4、tral role in the regulation ofapoptotic cell death. Upon death stimuli, differe nt apoptoge nic factors such as cytochrome c and Smac/Diabloare released duri ng the early stages of apoptosis. A small amount cytochrome c may be sufficie nt for activat in gcaspases. Once activated, caspases can positi

5、vely feedback to attack mitoch on dria lead ing to a more profo un dloss of cytochrome c and con seque ntly mitoch on drial dysf unction. This caspase-mediated late stage of cyto-chrome c release causes the complete disrupti on of mitoch on drial electro n tran sport cha in, lead ing to theincrease

6、in cellular ROS and complete loss of ATP generation, late stage of apoptotic eve nts or sec on dary necrosis. Bcl-2 and its family prote ins are importa nt for regulat ing cytochrome c release and apoptotic processes.Key words: mitoch on dria; cytochrome c; apoptosis; caspase; Bcl-2文章编号：1004-0374（20

7、0804-0506-08收稿日期:2008-07-17基金项目：“97项目（2006C B 910102国家自然基金项目（30630038 & 30400098;科学院知识创 新项目（KSCX2-YW-R-02*通讯作者:E-mail: chenquan细胞凋亡（apoptosis是程序性细胞死亡（programmed cell death的一种形式之 一，是细胞一种生理性、主动性的细胞 自杀行为”。细胞程序化死亡最早是由Lockshin和Wiliams在1965年提出。随后在1972年Kerr等从形态学的角度描 述 了细胞的生理死亡，并将这种细胞死亡命名为凋亡（apoptosis细胞凋亡是机

8、体在生 长、发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保 持机体内环境平衡和维持正常生理活动过程的一种自我调节机制。这种调节机制的异常与多种疾病的 发生有关,如癌症的发生与 细胞凋亡的抑制有关，而老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关。目前对细 胞凋亡的 研究已经涉及到肿瘤生物学、发育生物507第4期朱玉山，等:线粒体与细胞凋亡调控学、神经生物学、免疫生物学等方面，已经取得很多突破性的成果。2002年诺 贝尔生理学或医学奖 分别授予来自英国的Sydney Brenne、来自美国的H. Robert Horvitz和来自英国的John E. Sulston以表彰他们发现了在器官发育和 程序性细

9、胞死亡”过程中的基因调控。1线粒体与细胞凋亡细胞凋亡受到一系列相关基因严格调控。不同 的凋亡信号在细胞中引发不同的凋亡信号转导通路。根据凋亡信号的来源可以将细胞凋亡信号转导 通路分成两条:外源通路(死亡受体通路 和内源通 路(线粒体通路。这两条通路最后都汇集于 下游的 效应Caspase即凋亡蛋白酶Casapse的激活。活 化Ca spase在细胞中能够 切割400多种底物，如Lamins、信号分子如蛋白激酶、骨架蛋白、 DNA修复酶以及包括调控mRNA剪切、DNA复制的功能 蛋白。这些重要蛋白质的降解和核酸 酶的激活最终导致细胞凋亡1。线粒体是细胞的能量工厂，是真核细胞生存的基础。越来越多的

10、实验证据表明， 线粒体是细胞凋 亡调控的活动中心。线粒体在细胞凋亡中的作用主 要表现为2:第一，在凋亡发生过程中，多种促进细胞凋亡的蛋白转移至线粒体，从而使线粒体膜 的通透性和完整性受到破坏。由于内膜对氢离子的 通透性增加引起线粒体膜电位消失；Bcl-2家族蛋白主要通过调节线粒体的功能来调控细胞的凋亡 ；第二，有多种凋亡诱导因子从线粒体释放，如细胞色素C(cytochrome c AIF(apoptosis-inducing factor、 Smac/Diablo(sec ond mitoch on dria-derived activator of caspase/direct IAP bi

11、nding protein with low pI 和 Caspase前体蛋白 procaspase-2,-3,-8和-9 等在 凋亡发 生过程中从线粒体膜间隙被释放到细胞质 中，随后引起典型的凋亡变化；第三，有一些凋 亡诱导物能够诱导线粒体上的膜透过性转变孔 (permeability transition pore,PTP开放,导致线粒 体膜电位消失和释放促凋亡蛋白。由于诱变剂、化疗药物和电离辐射造成细胞内 不可修复的基因组损伤会激活凋亡的内源通路，即线粒体通路。线粒体这种特殊的细胞器在其中起着 关键性的调控作用。在多种形式的刺激信号作用于 线粒体后,将会引起线粒体释放细胞色素 C3、AI

12、F 4、Smac/Diablo5和 procaspase-2,-3,-8和-96,7等促 凋亡因子。最新 研究发现，线粒体在凋亡发生时还可能释放一种核酸内切酶en do nuclease G8,9 Endo- nuclease G的相对分子质量为26 k,以同源二聚体 形式存在并行使其功能，它 能选择性地在鸟嘌呤富 集区(dGn (n=9切割DNA双链。细胞色素C从线粒体被释放出来后，与Apaf-1 (apoptosis protease activating factor-1在ATP/dATP存在下发生构像变化并形成巨大的复合体 (700 k/1.4 M ,称为凋亡体(apoptosome同

13、时凋亡体吸引 Caspase-9前体加入该复合体，Caspase-9前体 聚合后被反式催化激活。活化的 Caspase-9继而作用于 下游的效应 Caspase(Caspase-3,-和-7，引起细胞 凋亡。AIF是一种不依赖于 Caspase的凋亡效 应因子，当它从线粒体释放出来，并从细胞质移位至细 胞核时，会引起染色质凝集，并 将DNA降解为50 Kb的大片断6,7,10-13。在细胞中还存在一些抑制凋亡蛋白 IAP(i nhibitor of apoptosis prote in s,它们可以与细胞色素C和Apaf-1激活的Caspase-9结合，并且阻止活化的Caspase-9激活 C

14、aspase-3前体蛋白，使凋亡不能进 行下去。Smac/Diablo在凋亡发生时与细胞色素 C 一起被释放，它能与IAP等抑凋亡蛋白结合，释放Caspase-9, Caspase-随后激活 Caspase-3使凋亡进行下去。另外，这些I A P蛋白不但能抑制Caspase的活性，而且 能介导Caspase在细胞内的降 解过程,维持Caspase在细胞内的合适含量，可防止由 于细胞中少量Caspase的意外激活而导致的细胞凋亡14。内源和外源两条凋亡通路并不是孤立存在的，它们互相之间存在着交流(crosstalk 。细胞膜上的 死亡受体与配体结合后引起 Caspase-8勺激活,活化的Casp

15、ase-8 能切割Bid。Bid是Bcl-2家族中的一种促凋亡蛋白，切割后产生的羧基端片段(tBid可以转移到线粒体，与线粒体外膜结合并随后引起线粒 体释放细胞色素C等 促凋亡物质，从而引发典型的 凋亡反应15,16。2线粒体细胞色素C释放线粒体是调控细胞凋亡的中心，细胞色素C释放是线粒体凋亡途径的标志事 件。关于细胞色素C释放的机制，目前有不同的假说，但尚无定论。第一种是Bax 依赖的线粒体外膜通透模型。鉴于 Bax和Bak等在细胞色素C释放中的不可或缺 的作用,有人提出Bax可以在线粒体膜上形成多聚体并形成大 通道使细胞色素C等促凋亡物质从线粒体内外膜之 间释放17,18。也有人提出，Ba

16、x和Bak等正常情 况下能与抑凋亡蛋白分子Bcl-2/Bcl-xL/Mcl-1相互结508生命科学 第20卷合。而仅含BH3结构域的Bcl-2家族促凋亡蛋白tBid、Bim等能与Bcl-2/Bcl- xL/Mcl-1相互作用，使Bax/Bak等从抑凋亡蛋白游离，进而形成多聚体，促使线粒体膜 通透,导致细胞色素C释放。Shimizu等19认为Bax或Bak与VDAC结合后，可以 调节线 粒体的膜电位，并导致细胞色素C从Bax/Bak和VDAC共同形成的大通道释 放，该小组应用电生理 方法检测记录到了这样一个大通道的存在。目前我 们课题组相关研究结果认为细胞凋亡时，Bax从胞浆转移到线粒体上，促使

17、细胞色素C释 放。同时我 们对Bax的激活机制研究发现，H2O 2处理细胞后，明显观察到Bax从胞浆转移到线粒体上，同时伴随 细胞核的破 碎和皱缩。同时，发现Bax的62位半 胱氨酸是其转位所必需的，而126位半胱氨酸 对其转位没有作用20。也有研究报道发现Bid/tBid也可以在人工脂质体或平面 膜上形成通道，Bid/tBid形成的通道有可能参与Bid/tBid诱导的线粒体释放细胞色 素C的过程21,22。尽管如此，我们还观察到，在Bax/Bak缺失的细胞中，棉酚仍能 诱导细胞色素C释放，很可能是通过诱导Bcl-2构象变化来促进线粒 体细胞色素C 释放。这说明Bax和Bak对线粒体细胞色素C

18、释放不是绝对必需的。第二种模型认为,PTP参与的外膜破裂,PTP开放使线粒体肿胀，外膜破裂,引起内外膜间细胞色 素C释放。3 Bcl-2家族蛋白与细胞凋亡在细胞凋亡过程中,Bcl-2家族蛋白起着至关 重要的调节作用。对于Bcl-2家族 蛋白的研究是细胞凋亡研究领域中最为热门的课题之一。Bcl-2、Bcl-xL等细胞凋亡负调因子在许多类型的细胞受到外界刺激时能保护 细胞免于凋亡。它们主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜 上。其疏水性C末端定位于细胞内膜系统上，而N末端朝向细胞质。与膜的结合对于其发挥功 能是极其重要的。实验表明，失去膜定位能力的Bcl-2蛋白的抗凋亡能力减弱了许 多23,2

19、4。BH4结构域是Bcl-2等抗凋亡蛋白所特有的（Bcl-Xs除外。虽然BH4 不是形成二聚体所必需的区域，但它的缺失或使蛋白 质丧失功能，或产生一个促凋亡 而不是抗凋亡的突 变体25。这说明BH4对于Bcl-2或Bcl-xL发挥其抗凋亡功能 是必需的。线粒体膜上的Bcl-2至少在三个水平上发挥功能 来抑制凋亡:（1主要通过与 Bax/Bak相互作用来抑 制细胞凋亡；Bax是一种可溶性的蛋白分子，主要位于细胞质 中，但当凋亡发生时，它能从胞浆转移到线粒体并与线粒体膜相结合26。实验证明, 位于线粒体膜上的Bcl-2能与Bax相互作用，而后者也必 须在线粒体上才能发挥其 诱导凋亡的作用。同时把微

20、量的重组Bax加入到分离的线粒体中能够诱导细 胞色素C的释放和Caspase激活，而只含有Bax的BH3结构域的多肽则没有这种功能。 Bax与Bcl-2相反,能促进PTP开放,并促进线粒体促凋亡因子 的释放，Bax的促凋 亡作用能被Bcl-2所抑制。并且，只有定位于线粒体上的Bcl-2和Bcl-xL才能拮抗 Bax蛋白和阻止细胞色素 C释放、Caspase激活 和凋亡，Bcl-2? TM则无此功能 27; （2Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来调控线粒体膜电位从 而调控细胞凋亡。在细胞凋亡过程中，线粒体的巯基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器， Bcl-2可能是通过抑制谷胱甘肽（GSH

21、的外泄，降低胞内的 氧化还原电位来抑制细胞 凋亡的；（3Bcl-2能通过抑制PTP开放来抑制促凋亡蛋白从线粒体中释放，从而保 护细胞免于凋亡；有证据显示,Bcl-2还能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜 上，使其不能发挥促凋亡作用。通过质膜研究发现Bax能够在脂质双层形成孔道,促进脂质体包埋的荧光素释 放,同时这一过程 被Bcl-2所抑制。Narita发现在分离的线粒体体系 下，Bax和Bak 与PTP的组分VADC结合而促进细 胞色素C释放，细胞色素C释放会引起如膜电 势的丧失、细胞器的肿大等典型的 PTP改变。上述过 程都是线粒体依赖的和能够 被CsA和Bongkrekic aci

22、d所抑制，抗VADC抗体也能够抑制Bax诱导的细胞 色素 C的释放和膜电势的丧失。也有研究发现与以 上结果相反通过镁离子促进介导细胞色素C的释放。以上研究说明体内存在至少有两种不同的细胞 色素C释放机制：一种是钙离子介导的并被 CsA抑制的途径，另一种是Bax依赖和镁离子介导而非 CsA所抑制的途径28。许多实验结果证明,Bax在凋亡信号诱导下可以发生构像变化（conformational change从而能够直接结合到线粒体上形成 Bax寡聚体孔道，诱导细胞色素C释放 29-31。据报道，全长的B i d和经Caspase-8切割形成的tBid能够诱导Bax发生构 像变化,而Bcl-2则能够

23、通过与Bax竞争结合形成异源二 聚体抑制细胞凋亡。Bax 和Bcl-2之间尽管存在着竞 争,它们也可能独立地调控细胞凋亡。4 Caspase的活化与线粒体结构蛋白最近的研究表明，活化的Caspase-3可以反过509第4期朱玉山，等:线粒体与细胞凋亡调控来作用于线粒体，引发线粒体细胞色素C的释放，细胞色素C经Caspase级联反 应又可以激活Caspase-3构成细胞色素C释放的正反馈调节机制32,33。我们最 近发现线粒体复合物III的一个亚基能够被活化 的Caspase-3特异性切割介导细胞 色素C的释放。线粒体细胞色素C释放会促进相应的Caspase激活，同时激活的 Caspase直接攻

24、击线粒体，进一步引发更 多的促凋亡因子从线粒体释放，从而形成凋 亡信号的正反馈。线粒体在这里成为细胞凋亡信号的放大 器。我们以前的实验结 果显示，在凋亡早期只有少 量的细胞色素C的释放，线粒体保持氧化磷酸化功 能，提 供凋亡需要的能量；一旦Caspase激活后反馈攻击线粒体从而导致更多的线粒体细 胞色素C释放到胞浆中，导致凋亡信号放大，细胞线粒体功能 丧失和细胞死亡。Ricci等34发现线粒体复合物I的一个亚基p75能够被Caspase-3切割为相对 分子质量为47k和28k两个片段，进而影响细胞色素C的释放和ROS的产生。颗 粒酶A能够通过切割新线粒体复合物I的亚基-基质蛋白NDUFS3作用

25、于线粒体, 从而介导线粒体ROS的产生和膜电势的丧失，特异性表达到其突变体能够抑制颗 粒酶A诱导的细胞凋亡，但是颗 粒酶B却能够使之诱导凋亡35。凋亡的过程是通过激活如 C a s p a s e -3, -7 (executio ner caspa和相应底物的 切割过程。因 此,凋亡过程中的核心事件就是 Caspase底物的切害叽研究主要集中 在理解Caspase如何识别底物、 如何切割以及如何导致凋亡表型。目前已经知道大约有400个蛋白被证明是Caspase的底物并被其切害叽通过正常细胞与凋亡细 胞2D胶比较会发现几 百个变化蛋白点。虽然这些蛋白不能够完全证实是 Caspase的靶点，但是

26、这种蛋白质组学的方法已经 证实其中有很多是Caspase的底物1,36。虽然目前很多蛋白被证明是Caspase勺底物并被切割，但是有些蛋白在凋亡过 程中并不被切割或者很晚才被切割，以及不同细胞结果不同。如f-actin只有在卵巢 癌细胞才被切割，在其他细胞并没 有被切割。同时，切割位点并不是非常保守的，如 Cylin A在蟾蜍的卵母细胞凋亡过程被切割但是其他哺乳动物细胞并没有发生；还有 些蛋白如DNase-X蛋白序列中含有一个或者多个经典切点，但是在凋亡细胞中尽管 有大量的Caspase激活也不能够被切害叽而且，多数蛋白如果首先被Caspase切割， 其他位点也会被其他蛋白酶切割。例如 Ac

27、i nu s被Caspase-3切割是非常必要但又不足以激活DNA凝集活性，为使之全部激活需要一个附加且仍然不知道的丝氨酸 蛋白酶的参与，只有把二者结合起来才能产生成熟的片段进入细胞核发生核固缩。4.1 Caspase底物与细胞形态变化 许多蛋白为什么 被Caspase切割原因是不清楚的，但是有时一些蛋白水解是与细胞死亡的形态变化紧密联系的。典型 的例子是DNase抑制子ICAD , Caspase-3切割ICAD之后激活CAD核酸酶介导凋亡的DNA片段化，另外Acinus与Helicard(DNA螺旋酶的切割后发生染色 体凝集和细 胞核重塑;其他如Ge Isonli n和激酶ROCK-1、P

28、AK2的切割与典型的形态 膜出 芽有关，Gels on lin被Caspase-3切割产生一个相应活化 片段使F-actin去寡聚化，而 无Gelsonlin表达中性白细胞凋亡过程中表现膜出芽显著延迟，说明膜出芽需要 Caspase激活Gels on lin介导的actin识别。Caspase也可以切割激活 ROCK-1导致 Myosin轻链的磷酸化而最终产生膜出芽。Caspase可以切割破坏细胞骨架蛋白如中间纤维 cytokerati n-18和Vime ntin ,或者GAS2和Plect in ,这些蛋白都与纤维组织有关。这种切割会导致凋亡 细胞形状改变。有研究报道Caspase攻击大脑

29、皮层actin网络如Fodrin和中心黏附复合物 胞浆基质 中的肌动纤维和膜蛋白。这些中心黏附复合物有 Cas和Paxillin ,这些蛋白的切割与细胞收缩、细胞吸附和极其重要的阻断抗凋亡整合蛋白信号传导密 切相关。同时参与细胞黏附、通讯的骨架蛋白还有 3-cate nin、E-cadherin、plakoglobi n 和 desmogle in ,它们都是 Caspase的底物。在凋亡过程中，经常会发生内质网和高尔基体 结构的破坏，Golgin-160和 GRASP65的切割已经被证明会引起高尔基复合体去组装,Bap31的蛋白水解会破 坏内质网和高尔基复合体之间的物质运输，而Rab apt

30、i n-5或kin ect in的切割会妨碍囊 泡的运输加工。Caspase会切割大量核蛋白并破坏其功能，如导致lamina去组装和 核孔复合体对物质的运输。通 过对PARP-1、ATM和DNA-PK的切割阻碍对 DNA的修复，会进一步促进凋亡；其他如涉及到DNA合成和复制有关DNA聚合酶 Pole、MCM3等。RNA相关的RNA螺旋酶A和剪切因子U1 70-KDa snRNP都 会导致RNA合成、加工和运输中断。4.2 Caspase底物与信号传导通路 大量的信号传导中的蛋白涉及Caspase切割,导致功能的抑制或者中间体的活化。有些已经被确定的 Caspase切割激510生命科学第20卷活

31、的蛋白会涉及到凋亡信号的放大。Caspases关闭细胞保护机制而激活细胞 死亡信号通路，典型凋亡 抑制子Bcl-2蛋白和Caspase-8的抑制子c-FLIP能够被Caspase切割。Caspase切割Bcl-2和Bxl-xL的N端BH4结构域导致抗凋亡的功能 的丧失,甚至转变为促凋亡因子,相似的还有受体依赖途径的Caspase-8 切割Bcl-2家族Bid产生活化的tBid诱导细胞线粒体细胞色素C的释放。这种抗 凋亡与促凋亡因子之间的转变组成凋亡信号通路的正反馈通路。 在凋亡过程有些转录因子和激酶失去活性，如Akt和Raf-1就被Caspase-3切割导致活性丢失。这 些 激酶被促凋亡分子如

32、Bad失活，它们的降解可能 组成凋亡信号的正反馈机制。有些 蛋白抑制Caspasd舌性如热休克蛋白和cAMP应答因子CREB。在NF- k B信号通 路中，如Caspase的切割会产 生转录因子的抗凋亡功能完全丧失：（1对NF- k Bp65亚 基的切割会产生一个相反功能片段，仍然能够结合DNA ,但已经基本没有转录功能； （2 NF- k B抑制子I k-Boc可以被蛋白酶体诱导降解，其N端被Caspase切割产生一个 超级抑制子，其不具有清除蛋白酶体的功能；（3在受体介导的信号途径也有接头蛋 白TRAF-1和RIP-1的切割参与，破坏NF- k B勺激活和抗凋亡能力。有些底物不仅Caspase被切割之后丧失功能,而且导致其他的蛋白或蛋白酶激 活,这些主要是通 过Caspase去除抑制或者调控区domain。女口 PKC和MAP激酶通 路是通过切割得到激活的 N-端调控区和C-端催化区（p21激活的激酶PAK2和 ROCK-1 , PAK2和ROCK-1的激活对细胞