分子生物学方法及其在中医研究中的应用.docx

1、分子生物学方法及其在中医研究中的应用上海中医药大学实验中医学教案（7）课程名称 实验中医学（理论部分） 总学时数 36专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤内容实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研究中的应用时数16本次课目的要求1掌握不同学科实验研究方法的特点和优势。2掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法（包括一种或几种方法）。3了解各学科的主要实验研究方法。4了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用。5了解了解各学科研究中医药学的现状。本次课的重点难点第一节 解剖学方法及其在中医研究中的应用1大体解剖学的主要方法。2大体解剖学方法研究中医的现状。第二节 组织学方法及其在中

2、医研究中的应用1组织学的主要研究方法。2组织学方法研究中医的现状。第三节 电镜技术及其在中医研究中的应用1电子显微镜及电子显微术概况。2电子显微术研究中医的现状。第四节 生物化学方法及其在中医研究中的应用1生物化学的主要方法。2生物化学方法研究中医的现状。第五节 生理学方法及其在中医研究中的应用1生理学的主要方法。2生理学方法研究中医的现状。第六节 免疫学方法及其在中医研究中的应用1免疫学的主要方法。2用免疫学方法研究中医的现状。第七节 核医学方法及其在中医研究中的应用1核医学的主要研究方法。2用核医学方法研究中医的现状。第八节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用1分子生物学的主要技术和方法

3、。2用分子生物学方法研究中医的现状。本次课的应用教具多媒体设备。第八节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用（2学时）分子生物学是本世纪中叶才诞生并迅速发展起来的学科，被誉为本世纪最伟大的科学成就。如今，分子生物学技术已成为医学领域中使用最为广泛的技术，在揭示新的生命现象、认识和战胜种种疾病等方面起着愈来愈重要的作用，并成为医药学研究的领先学科。中医学的实验研究在近一二十年来取得了突飞猛进地发展，中医药，包括针灸、推拿、气功在防治疾病方面的作用已被大量的实验所证实、重复，在此基础之上，中医的实验研究已深入到探讨不同组织基因转录、表达调控的层次上来。与此同时，以分子生物学技术支持的基因工程、生物

4、工程在中药及其有效成分生产上显示出辉煌的前景。一中医药实验研究为什么要采用分子生物学技术1一些不同的认识有人认为中医是宏观的，讲整体的，讲辨证的，讲阴阳平衡的。微观的分子生物学是没有办法来研究中医的，不能研究中医的。也有人担心采用现代技术研究中医，中医会被西医吃掉；或者认为中医的灵魂在临床。于是一些人对此技术格格不入，学不进去。这里就有这样一些疑问，持这些观点的人是否真正了解中医药的发展历史，是否了解分子生物学及其技术，是否了解当今医学研究发展的现状？回答大多是否定的。回顾历史，教训是很多的。中医药一度比较发达的解剖、麻醉、化学药物合成，这些有时早已丧失；宋以来的人痘人工免疫、明以来的疠气学说

5、、当代的水蛭素等，优势已经或还在不断地丧失！医学存在客观上存在的竞争。面对这样的竞争，怎么办？此外，中医药还要不要发展、要不要创新，采用什么手段去发展和创新？一边是深深的忧患意识，一边却是动嘴不动手的妄加评判。我们不赞成这样的做法。2中医药实验研究采用分子生物学技术的必要性40年来，中医现代化实验研究从无到有，经历了临床验证性研究，初步的机理研究，以及全方位展开的深入的机理研究和探索，包括采用先进的分子生物学技术，研究实现了与世界医学实验研究的接轨。在研究中大家逐渐认识到，加强分子生物学研究中医药是新时期中医药发展的迫切需要！这是因为：1）振兴中医的重要机遇。分子生物学、细胞生物学以其实验条件

6、便于控制、实验稳定、重复性好、实验周期短、仪器试剂（包括各类试剂盒）发展快，手段丰富、国际研究普遍（使新方法、新技术层出不穷）、研究积累快、参考文献丰富，可以观察人体的不同组织的细胞、分子（这又强于动物实验），给应用该方法技术研究创造了绝佳的条件；同时，业已进行的研究揭示和开拓出生命科学广大的未知领域。也由于分子生物学新兴、发展快，给国内外、中西医创造了同等的发展和应用的机会，再次使中、西医有可能站到同一起跑线上。抓住这个千载难逢的机会，充分利用它、驾御它，必将给中医学注入强大的生命。2）保持中医药优势的需要。几千年来，中医在运用天然药物方面积累了丰富的经验。比如其中一些天然动植物药物的粗制品

7、，比如水蛭素、蛇毒抗栓酶类粗制品已经作为我国的传统医药产业。但是当国外采用了分子生物学技术和生物工程，生产出水蛭素、类凝血酶素，既降低了成本，又提高了质量的稳定性。反销我国和国际市场，对我国传统医药产业形成了巨大竞争。有识之士开始呼吁不能坐视祖国医学优秀遗产的优势失去，主张抓紧采用分子生物学研究天然中药的有效成分，开发新药，不然势将失去优势。通过几十年的研究，中药所面临的问题已经暴露得十分清楚，比如中药材的质量稳定、占用耕地、有效成分和若干有效成分最佳组合的探索、有效成分得率需要提高，以及服用的安全、方便等均有赖于大量的中药学基础研究，而已有的研究表明，分子生物学是十分重要、有效的研究手段。中

8、药的研究有赖于中医基础的研究，而不加强分子生物学技术对中医基础的研究，没有强大的基础研究的积累和支撑，药物的研究、开发将成为无本之木。3）继承和发展中医基础理论的需要。中医药的作用发挥，脏腑病机的变化、不同治法（具体落实到中药复方及其有效成分，针灸、推拿等治疗方法）的作用环节和最终作用的发挥，均落实到人体基因转录与表达的调控。已有的研究表明，中医药的取效，往往是通过对基因的转录与表达调控实现的。甚至，一些基因缺失或突变所引起的疾病，中医药通过对其它有关基因的转录调控，进行补偿，达到治疗疾病的目的。深入研究对于阐明中医药的作用机制、阐明生命的调控原理，均具有重要的科学意义。作为对中医学优秀遗产的

9、继承和发展，这部分的研究具有广阔的天地，是中医基础理论研究的重头。另一方面，还应该看到，证的临床研究局限性与困难日益明显。主要表现在限于种种困难，证治的动态演变观察研究难以深入；临床证治的干扰因素多且复杂，严重影响到证治疗效的观察、评估；由于受到实验室检查经费昂贵、病员顾虑，不予配合等因素的限制，临床病人证治的实验室检查、复查均有困难，观察难以完整，广种薄收；由于创伤性检查在在我国目前临床上难以展开，因此细胞水平、分子水平，尤其是细胞、分子的调控研究无法进行，致使研究深入不下去。而采用分子生物学、细胞生物学技术能在很大程度上弥补其不足。3分子生物学的发展历程1871年，首次发现DNA（鲑精DN

10、A）。1943年，证明DNA为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery）。1953年，DNA双螺旋模型提出（J D Watson（美）和F H C Crick（英），1962年或诺贝尔生理学、医学奖）。从而为分子生物学这一学科奠基。1961年，合成mRNA，破译第一个遗传密码（M W Nirenberg（美），1968年获诺贝尔生理学、医学奖）。1970年，分离出第一个限制性内切酶（W Arber（瑞士），1978年获诺贝尔医学奖）。1976年，重组DNA成功（H Boyer（美）和S N Colen（美？），1981年获诺贝尔化学奖），强调其科学精神。有人统计，自19571982的

11、25年间，从事核酸研究而获得诺贝尔奖的有29位！1982年，美国一制药公司在2000升发酵液中提取出100克精制胰岛素！相当于从1600磅动物胰腺中的提取量。后来居上的事例是，荷兰最早把分子生物学产品“猪牛痢疾疫苗”投放市场，比以上美国的胰岛素早半年！这对后来的中医基础研究很有启迪意义。那么，如果学习的话，用在哪，如何用？二分子生物学技术在中医药研究中的实例但是，如何运用分子生物学方法技术来研究中医，如何把两者紧密结合起来，这些技术对中医学术发展有什么帮助，如何找到最佳的切入点，等等，诸如此类的问题、困惑还萦绕在许多中医工作者和学生的脑中。归结起来，如何用、怎样用的问题并没有得到普遍地解决。为

12、此，我们先以中医药延缓衰老的理论和研究发展为例，看看分子生物学在中医研究中的应用。早在黄帝内经时代，中医学对人体的衰老和防治已经积累了丰富的经验，并在理论上把衰老归结为五脏精气虚，最终导致肾气虚、天癸竭，生殖系统衰老而丧失生殖能力。此后，预防和延缓衰老主要从补五脏、补肾入手。但是补有不同的补法，各有家传不同、门户之异，就中药复方而言，仅补肾便有平补、温补、凉补、阴阳并补、填精等区别，还有滋阴泻火、温肾祛寒、数法兼用，等等。用药讲究君臣佐使、轻重缓急，即便同一治法，用药还会有很大的区别。发展到了唐宋，已经积累起大大小小、许许多多的延缓衰老的单方和复方，面对如此众多的处方，临床应该如何选择，有没有

13、最好的？金元后期，朱丹溪提出阳常有余，阴常不足，治疗主张滋阴泻火，留有著名的大补阴丸。在明代李时珍本草纲目“黄柏”条下，也记载有长期服用单味黄柏以延缓衰老的论述。然而，明末的张介宾则极力反对，认为阳气是人体的大宝，不应该采用寒性药物大肆克伐，而力主温补。就这样，中医界寒温之争持续了几百年。几百年来，临床上有人禀承丹溪学说，也有人推衷景岳学说，没有定论。当现代临床实验研究方法引入中医临床观察以后，发现同样是老年人，激素水平、神经递质水平存在显著差别，这些递质、激素在部分人群当中可以长期维持在一个较高的水平，而部分人群随着衰老则明显下降。其中，这些年大量实验研究所观察到的与寒证、热证有明显关系的儿

14、茶酚胺类递质在老年人中波动就很大。我们采用动物实验研究中药二仙汤及其寒温两个拆方的作用机理时发现，温肾药对老年和去势大鼠下丘脑-垂体-性腺（去势动物观察肾上腺）轴兴奋作用突出，而滋阴泻火药对这些轴的延缓衰老和保护作用突出，部分揭示出寒、温治法的差别。联系到临床研究结果，显然，对那些激素、神经递质水平高、热象明显的老年人，补肾以偏重于滋阴泻火为妥；而对于那些激素、神经递质水平低、寒象明显的老年人，补肾以偏重于温肾壮阳为妥。这些中医基础理论研究丰富了中医学延缓衰老的理论和方法，对临床上延缓衰老的辨证论治起到了积极的指导作用。生物医学研究表明，生殖的发生和衰老与下丘脑-垂体-性腺轴的发育成熟和衰老有

15、关。在下丘脑水平，促性腺激素释放激素（GnRH）释放的一定数量和频率对于保持正常生殖能力是十分必要的。GnRH是由下丘脑位于弓状核和视前区的GnRH神经元所分泌。为了进一步了解二仙汤的作用机制，我们采用了分子生物学实验技术观察了二仙汤对老年大鼠下丘脑、垂体GnRH含量的变化。研究发现，24月龄老年大鼠下丘脑GnRH mRNA含量（Northern blot）较5月龄青年大鼠下降、垂体GnRH（下丘脑合成的GnRH通过垂体门脉系统直接释放到垂体）含量也下降；而经过二仙汤的治疗，同龄老年大鼠下丘脑GnRH mRNA含量、垂体GnRH含量较老年对照大鼠增加，表明二仙汤治疗更年期综合征取效的部分机制与

16、该处方延缓下丘脑GnRH神经元的衰老，并增进其功能有关。上海第二医科大学进而采用细胞生物学的研究方法，发现与若干常用经典温肾中药复方相比，二仙汤能使GnRH细胞系GT1-7的GnRH分泌峰提前，并维持时间最长。这些研究采用了细胞生物学和分子生物学技术加深了我们对中药复方作用机制的认识。如果不借助分子生物学、细胞生物学的技术和方法，我们便难以高效、准确、深入地观察到中药复方作用的分子机制，也就无从开展更进一步的深入研究，并在此基础上发展和丰富中医药学。医学和生命学科的研究探索是没有止境的。近十年来所采用的分子生物学技术研究表明，GnRH基因有3000bp左右的启动子，在这些启动子上一些区域在特定

17、的细胞系中对于GnRH基因的高表达十分重要，被称之为增强子。GnRH细胞在胚胎初始由鼻小坑向下丘脑迁徙，并逐步分化成熟。研究发现来源于不同部位的GnRH细胞系，对GnRH的表达数量有着很大的区别，比如GT1-7（来源于发生在前脑的肿瘤，接近GnRH细胞迁徙的终点）可以高表达GnRH，而Gn10（来源于GnRH细胞迁徙途中的肿瘤）则GnRH表达甚微。鉴此，研究人员推测两个细胞系中调节GnRH基因启动子的核蛋白构成会有所不同，由于这些核蛋白的构成不同，导致两个细胞系GnRH表达的多寡。我们采用分子生物学足迹法（Footprint）技术发现，来源于GT1-7和Gn10两个细胞系的核蛋白在GnRH启动

18、子，尤其是其增强子上结合的数量以及所结合的DNA序列确实有所异同，可以推测，这些不同的结合蛋白可能是调节GnRH表达数量多寡的重要蛋白，由此也提示两个细胞系中基因的表达有所差异。我们采用另一项新近发展起来的DDPCR技术进一步研究证实，GT1-7和Gn10两个细胞系中确实有许多基因表达不同，有的是仅仅在其中一个细胞系中表达，而另一细胞系中阙如；大多基因在两个细胞系中表达的数量明显不同。在这些差异表达的基因中，有一个基因产物称之为Ark，仅仅在Gn10中表达，之前的研究表明Ark是一个跨膜蛋白，但是采用报道基因技术研究发现，一旦使Ark基因在GT1-7细胞中表达增加，便会明显地抑制GnRH基因的

19、表达。该现象不但新观察到Ark的新功能，同时也提示同一基因产物在细胞中可能存在的多功能。我们进一步采用cDNA Array研究发现，有许多基因在GT1-7和Gn10两个GnRH细胞系中表达差异。其中哪些基因，或哪些基因组合对GnRH表达多寡会发生作用，目前尚不清楚，研究正在进行之中。这些研究已经是GnRH研究的国际前沿工作。那么我们自然要问，中药复方和其它中医药治法，比如二仙汤是否对以上这些调节GnRH表达的基因产物发生影响，影响了哪些，是哪些中药有效部位或有效成分所起的作用，这些有效成分的量效关系如何，有没有最佳的组合，与已知西药的作用异同如何，等等。这样的研究势将把中医药延缓衰老的研究引向

20、深入。以上研究揭示出单一细胞内生物调控现象的混沌复杂，而位于组织和机体中的细胞还受到周边细胞、组织、其它系统的影响，因而变化就更复杂、更微妙，这就在细胞、分子水平印证了中医学的整体观、恒动观，丰富了中医学的整体观、恒动观。澳大利亚的一研究发现，刺激下丘脑某一特定核团可以促使GnRH的释放，但是随着研究的深入，发现不同实验动物，对相同的刺激反应表现却不同。这一结果令人联想到中医的体质学说和证的变化。延伸出去，这些变化，就有可能是体质、证在基因、细胞、组织层次的表现，而辨证论治有可能在改变这些环节而发生作用。所以，中医延缓衰老的深入研究要求采用以上的这些分子生物学技术，推而广之，其他中医药领域的研

21、究也要求采用以上这些分子生物学技术，在这些研究的基础上，结合临床有效中药复方的疗效优势，给予进一步干预研究，了解作用于那些基因、调整了那些蛋白产物，与已知中西药的作用异同，等等。如此，可以极大地提高研究的效率、研究的深度、研究的可靠性、研究的竞争性。这样的研究不仅将有利于进一步揭示中药复方的作用机制，丰富中医藏象学说、辨证论治理论、治则治法学说，以及中药新药的开发、中药产品的升级换代、加强中医药产业国际的竞争力，还将发现新的生命及其调控现象，拓展人类对生命学科的认识。因此，加大分子生物学方法技术在中医药研究中的应用，是新世纪发展中医学的重要途径。三中医药研究经常使用的分子生物学技术综合目前中医

22、药研究中常用的分子生物学技术，以及将有可能普遍涉及到的技术，主要包括以下内容：1中医药对基因组（DNA）作用的研究人类基因组计划的人类基因测序工作已接近尾声。一些实验动物、植物，包括中药植物的测序工作正在展开，或计划展开。鉴于中医药研究中这方面开展的研究不多，主要包括基因组DNA提取、Southern blot（观察DNA的变化，方法大体接近以后我们要介绍的Northern blot）、PCR技术、点突变PCR（研究DNA的功能及其意义）、DNA测序等。2中医药对某个已知基因转录（mRNA）水平调整作用的研究主要包括提取总RNA，做Northern blot或RTPCR。以上实验涉及到多项分子

23、生物学常用技术和方法，包括：重组质粒、转化宿主细菌、筛选阳性克隆、扩增细菌、从细菌中制备已扩增了的DNA、利用限制性内切酶切开重组插入的DNA片段和载体、电泳分离插入DNA片段和载体、回收插入并放大的DNA基因片段、标记探针，以及制备组织或细胞的RNA，RNA电泳、把RNA 转移到硝酸纤维素膜上（印迹转移）、固定，Northern杂交、放射自显影，等等。我们详细介绍和实验操作。3中医药对多个已知基因转录（mRNA）水平调整作用的研究cDNA列阵（cDNA Array）和基因芯片（Micro Array）这些在九十年代迅速发展起来的技术效率最高。这些实验所提供的信息量大，一个实验，可以观察多至1

24、万个以上的基因变化，给研究复杂的中医药调控机制和变化提供了强有力的武器。鉴于基因芯片研究目前还需要专门的仪器设备，在一般实验室内无法开展，所以我们在第四章中详细介绍cDNA Array技术。4中医药对广泛未知基因差异转录（mRNA）作用的研究该实验主要采用DDPCR技术。相关的还有cDNA库建立、基因全序列cDNA库筛选，RACE PCR技术。 5观察中医药对某一已知蛋白表达水平的调整作用：比较常用的方法是ELISA技术、免疫组化和Western blot等技术。还有单克隆抗体制备技术。6观察中医药对若干已知或未知蛋白表达水平的调整作用：蛋白双向电泳和蛋白芯片技术。7中医药对某基因转录调控的研

25、究：包括Footprint技术、凝胶阻滞实验、报道基因技术、功能基因插入哺乳类细胞表达载体技术、基因转移技术，等等。四推荐的参考书籍有关分子生物学方法技术的书籍有许多，以下一些书籍我们经常参考，因此推荐给读者。方肇勤主编分子生物学技术在中医药研究中的应用，上海科学技术出版社，2002年6月，第1版金冬雁等译分子克隆实验指南，科学技术出版社，1992年10月，第2版。颜子颖等译精编分子生物学实验指南，科学技术出版社，1998年 6月，第1版李永明等著实用分子生物学方法手册，科学技术出版社，1998年6月，第1版五分子生物学的主要技术和方法1989年，美国冷泉港出版了分子克隆实验指南（第二版），该

26、书比较全面地介绍了有关方法与技术，以下主要摘要介绍一些该著的基本概念与方法，另外再补充一些新近发展起来且使用较广的方法，具体内容可查阅参考文献所列举的原著或原作。由于分子生物学技术与方法发展十分迅速，日新月异，因此，我们建议在研究中应及时追踪最新的研究报道，以及各有关公司最新产品介绍。6811 载体载体的使用目的：1重组基因，以便放大某一基因片段，用于探针、基因功能检测、报道基因研究等。方法是：把某一DNA片段插入到相应的载体（比如质粒、噬菌体、哺乳类细胞表达载体等），给予扩增，用以标记探针、测序、cDNA库建立、基因功能检测等多种分子生物学实验。因此重组质粒就成为中医药实验研究中最为常规的实

27、验。通常，扩增目的DNA主要借助两类方法，即PCR技术和载体重组技术，鉴于PCR技术受到酶的性能和方法学等多方面的限制，某些DNA和超过一定长度DNA的扩增会有困难，所以载体重组技术倍受青睐。2DDPCR产物的克隆和测序。3RACE PCR产物的克隆和测序。4构建基因库、cDNA库，等。5基因功能检测。6基因工程（包括基因治疗之类）。以上一一介绍。1）质粒。质粒是一类双链、闭环的DNA分子，长度为3kb左右，存在于细菌体中，独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。通过改造，使实验室常用质粒具备了以下几种特性：1）含有多克隆位点区域，可方便的插入目的DNA片段。2）对细菌的可转移性，

28、即在实验中，可将质粒诱导入细菌。3）选择标记。常用的有抗生素抗性基因。这样，一旦质粒进入细菌，便可使该细菌对相应的抗生素产生抵抗能力，在含这一抗生素的琼脂平板上传代，如此，便于鉴定质粒诱导入细菌成功与否。4）在细菌体内可获得较高的拷贝数，例如一种叫pUC的质粒，在单一细菌体中的拷贝数可达500-700个。因此质粒已成为分子生物学中应用最为广泛的载体。2）噬菌体。噬菌体的基因组是一组长度约为50kb的双链DNA分子。在噬菌体颗粒内，该DNA为一双链分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端)。当噬菌体进入宿主细胞后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状分子，相隔12bp有两个交错切口。宿主体内的

29、DNA连接酶很快将切口封闭而形成闭环DNA分子，该DNA分子在感染早期充当转录模板。实验用噬菌体，在其DNA的中部有一可取代区，含多克隆位点，供插入DNA之用。噬菌体较质粒的优点在于可插入较大的DNA片段，如有的噬菌体可插入长达20000bp的外源性DNA。此外还有粘粒载体、单链丝状噬菌体等等。6812 分子克隆常用酶1限制性内切酶（限制酶）。限制酶能特异性地结合于一段该酶能识别的特殊DNA序列之上或这一DNA附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。切割结果可产生两类末端：1）粘端。许多限制酶在二重对称轴的5侧切割底物DNA的每条链，则双链DNA交错割开，产生带突出的粘端的DNA片段。例如，P

30、stI识别双链DNA的这样一段序列并切割如下： 5N N N N N C T G C A G N N N N N3 3N N N N N G A C G T C N N N N N5切割后产生两片段： 5N N N N N C T G C A pG N N N N N3 3N N N N N Gp A C G T C N N N N N5这类限制酶主要有：BamH I、Bgl、EcoR I、Hind 、Kpn I、Pst I等等。2）平端。有些限制酶在二重对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生带平端的DNA片段。例如：Hae识别双链DNA的这样一段序列，并切割如下： 5N N N N N N

31、G G C C N N N N N N3 3N N N N N N C C G G N N N N N N5 切割后产生平端的片段： 5N N N N N N G G pC C N N N N N N3 3N N N N N N C Cp G G N N N N N N5这类限制酶主要有：Hae、Mst I、Sca I、Sma I等等。目的在于方便地剪贴DNA。2DNA聚合酶。DNA聚合酶主要用于催化DNA 体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成产物的序列与模板互补。最常用DNA聚合酶有PCR用的Taq酶、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）等。3连接酶。连接酶用于将两段DNA拼接起来，最常用的是T4噬菌体连接酶。4脱氧核糖核酸酶I。DNA酶I为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA 。产物为5端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下，DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布。5反转录酶。这类酶可以将RNA作为模板合成互补DNA链。6813 重组载体（目的同前面在载体中所介绍的） 有了载体、酶和DNA片段，便可以重组载体。采用某限制酶切割开载体，用DNA连接酶将载体DNA片段与拟插入的目的DNA片段重新连接成一个环状的DNA分子。连接时，插入片段的平端与载体的平端对接，