化脓性球菌的分离鉴定.pptx

1、化脓性球菌 的分离鉴定,实验任务 实验目的实验材料,录CONTENTS目,0102030405,实验方法及步骤化脓性病原菌的鉴定,实验任务,01,实验任务,化脓性球菌分离鉴定并设计方案“机械学院王 斌同学皮肤表面有一化脓感染病灶，经久不愈。请设计一个方案：从脓汁标本中分离、鉴定化脓 性病原菌，并提出防治原则”。,实验目的,02,实验目的,掌握化脓性球菌的分离及鉴定方法掌握葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈 瑟菌的形态及特征。了解葡萄球菌、链球菌在普通平板及血琼脂平板 上的菌落特点。,化脓性炎症是临床上常见病。但是除了病 原性球菌外，其他微生物也可以引起化脓性 感染。常见的标本有脓汁、咽拭子

2、、痰液、血液、脑脊液等。本次实验以脓汁标本进行病原性球菌的分 离鉴定。,脓汁中病原球菌的查程序,血琼脂平板（分离培养）,菌落观察,涂片：阳性：可能存在葡萄球菌，链球菌革兰氏染色阴性：可能存在脑膜炎奈瑟菌大小及形态,溶血现象,溶血环 草绿色溶血环（溶血环）,革兰氏染色,阳性,不溶血阴性：存在脑膜炎奈瑟菌成葡萄串状排列,血浆凝固酶试验甘露醇发酵试验,呈链状排列，菌体为球形或椭圆形,菌体呈矛头装，多为双排列,实验材料,03,实验材料,脓汁（取自疑为化脓性感染患者）试剂准备：血平板培养基、营养琼脂平板、营养肉汤培养基、革 兰染色液、生理盐水、镜油、二甲苯，甘露醇发酵管、菊糖发酵管等仪器准备:恒温培养箱

3、、摇床、光学显微镜、试管、吸管、接种 环、酒精灯等,实验方法及步骤,04,实验步骤,1.采集标本对损伤范围较大的创伤，从不同部位采集多份 标本；采集部位应首先清除污物、消毒皮肤；标本较少则需加入无菌生理盐水以防干燥；开放性脓肿及脓性分泌物：用无菌棉采取脓液或病灶深部分泌物；封闭性脓肿用注射器抽取；怀疑厌氧菌感染，应隔绝空气采集。,实验步骤,菌落培养用生理盐水以适当比例稀释脓汁，以平板划线分离培养 法分别接种在血平板及营养琼脂平板上，在37恒温培养 箱中培养过夜；次日，观察营养琼脂平板及血平板上菌落 性状，并挑单克隆菌落至营养肉汤培养基中培养1824h；革兰染色取洁净玻片一张，在玻片中央滴一小滴

4、菌液，均匀涂布、自然干燥并固定后进行革兰染色（或直接取脓性分泌物涂 片染色镜检）镜检光镜下观察细菌形态。,化脓性病原菌的鉴定,05,化脓性病原菌的鉴定已学习的与讨论病案相关的能引起皮肤化脓性感染的球菌有：葡萄 球菌和A群链球菌（与人类疾病密切相关的主要为化脓性链球菌）。,葡萄球菌的鉴定,葡萄球菌的鉴定,直接观察革兰染色镜检观察光镜下观察为紫色葡萄串样排列，球形，G+菌。固体培养基菌落性状观察在营养琼脂平板上，葡萄球菌菌落性状：菌落直径12mm，圆形、凸起、边缘整齐，表面光滑、湿润、不透明的菌落。根据 其产生的色素不同，可分为：金黄色葡萄球菌菌落金黄色，表 皮葡萄球菌菌落呈白色或柠檬黄色（含白色

5、葡萄球菌，柠檬 色葡萄球菌）在血平板上，金黄色葡萄球菌菌落呈金黄色且周围可形成完全透明的溶血圈（溶血）；而白色、柠檬色葡萄球菌菌落周围则 无溶血圈。,葡萄球菌的鉴定,生化反应检测血浆凝固酶试验原理：金葡菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中可溶性的纤维 蛋白原变为不溶性的纤维蛋白，结合型血浆凝固酶附着于细菌 表面，在玻片上形成凝块；游离型的血浆凝固酶则可使试管中 的血浆发生凝固；方法步骤（玻片法）：在在玻片两端各滴生理盐水1d，取肉 汤培养菌液与生理盐水混匀，在其中一端的菌液中滴加兔血浆 1d混匀，观察结果。因致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可 凝固兔血浆，故如血浆中明显小凝块出现，而生理盐水中无此

6、现象者为阳性，若血浆中无凝块时为阴性。,葡萄球菌的鉴定,甘露醇发酵试验原理：致病性葡萄球菌能发酵甘露醇产酸，使培养基由紫色变为黄色；方法步骤：取肉汤培养菌液和白葡菌（阴性对照）分别接种于甘露醇发酵管，其上覆盖无菌液体石蜡油，37培养1824h，观察结果。金葡菌发酵甘露醇产酸，使培养基变浑浊，颜色由紫色变黄色，是为甘露醇 发酵试验阳性，而白葡菌相反。触酶试验原理：金葡菌能产生过氧化氢酶，将对细菌有害的H2O2,分解成水、氧 气；方法步骤：在载玻片上，滴加3%H2O2溶液12d，用接种环挑取菌液，观察结果。观察到产生大量气泡者为金葡菌。,葡萄球菌的鉴定,3.免疫学方法检测协同凝集试验原理：金黄色葡

7、萄球菌细胞壁上的A蛋白(SPA)，具有和大多 数哺乳动物IgG的Fc片段发生非特异性结合的特性，而IgG的 Fab片段暴露在菌体的表面，仍保持抗体的活性，当与特异性抗 原相遇时，IgG的Fab片段便与抗原结合起来，从而由抗原把已 标记有IgG的SPA菌相互连接，而引起协同凝集反应。,葡萄球菌的鉴定,方法步骤：i.SPA菌稳定液的制备在肉汤培养基内经37培养1824h，再转种有营养琼脂的克氏培养瓶中，每瓶35ml，摇匀，使菌液布满整个培养基表面，放37温箱培养1820h。每瓶以1020ml无菌生理盐水洗下菌苔，以3 000 r/min离心15min，弃去上清液，再用无菌生理盐水将沉淀悬浮后离心，

8、如此再洗涤两次菌体，然后用含0.5%福尔马林的0.01mol/L PBS制成10%的菌悬液(V/V)，室温放置3h或过液。将上述菌悬液放56水浴加热30min，迅速冷却，再用PBS洗离3次，最后用含叠氮钠(NaN3)为0.01%0.05%的磷酸盐缓冲盐水制成10%(V/V)的菌悬液。4 冰箱保存。,葡萄球菌的鉴定,ii.SPA菌诊断液的制备即将上述稳定液与已知的抗血清结合。取10%SPA菌稳定液1ml，离心弃上清，再用PBS洗菌体一次，并加PBS至 1ml，悬浮菌体，然后加沙门氏菌AFO多价血清0.1ml，(注：血清预先放56水浴加 热30min，进行灭活处理)。SPA菌和血清充分摇匀，放37

9、水浴中作用30min，此间 应不断振摇，以保持菌体呈悬浮状态，以利于菌体与IgG结合。将与抗体结合后的SPA菌液以3 000 r/min的转速离心15min，弃上清，并用PBS悬浮菌体洗离2次，以洗去未给合的剩余血清，最终加含0.05%0.1%NaN3的缓 冲盐水10ml。这种菌悬液即为1%标记的SPA菌诊断液。在制备稳定液、诊断液的过程中，应同时作不含A蛋白的葡萄球菌及含A蛋白葡萄 球菌与正常血清感作的对照。iii.操作方法试验时，取诊断试剂一滴和待检或已知菌苔或抗原置于玻片上，用白金环或玻棒 混匀，在数分钟内即可观察结果。如此为葡萄球菌，则凝集成清晰可见的颗粒。,葡防萄治球原菌的则防治原则

10、,金黄色葡萄球菌注意个人卫生，要做到：及时使用消毒药物处理皮肤创 伤；皮肤化脓者不宜从事餐饮行业；预防院内交叉感染；治疗应根据药物敏感实验结果等。可使用红霉素、庆大霉 素等治疗。,A群链球菌的鉴定,A群链球菌的鉴定,直接观察革兰染色镜检观察紫色球形或椭圆形，呈链状排列，G+菌。固体培养基菌落性状观察血琼脂平板上，形成灰白色、表面光滑、边缘整齐、直径 0.50.75mm的细小菌落，多数菌落周围形成较宽的透明溶血环（溶血 现象）。,A群链球菌的鉴定,生化反应检测触酶试验原理：链球菌不能产生过氧化氢酶，不能将H2O2分解成水、氧气方法步骤：在载玻片上，滴加3%H2O2溶液12d，用接种环挑取菌液，观

11、察结果。观 察到产生不气泡者为链球菌，可与葡萄球菌区别。菊糖分解试验原理：利用链球菌不分解菊糖的特性方法：接种环蘸取菌液分别接种于菊糖发酵管中，37培养10-24小时。观察细菌在 菊糖管中生长后的情况，以溴甲酚紫变色与否作为是否发酵菊糖的判断依据，不变黄为阳 性。胆汁溶菌试验原理：利用其不被胆汁溶解的特性方法：在血平板上找到单菌落，分别滴加1d胆汁；37，30min观察结果，菌落不消 失为阳性。,A群链球菌的鉴定,免疫学方法检测抗链球菌溶素O试验（抗O试验）原理：抗链球菌溶血素O(ASO)胶乳试剂的制备:将羧化聚苯乙烯乳胶与 纯化溶血素“O”用碳化二亚胺交联，离心洗涤后用pH7.6甲酸盐缓中液

12、配成1 悬液，加0.1 NaN防腐(即溶血素O 免疫微球)。被检测血清中的ASO与ASO胶乳试剂反应时，根据间接乳胶凝集试验的原理，可引起乳胶颗粒的聚集。若预先将被检测血清(含ASO)用25结合单位/毫升的溶血素“O中和，然后再与 ASO胶乳试剂反应，乳胶颗粒仍出现凝集者，说明被检测血清含ASO250单位。方法：取1:50稀释的患者血清与正常血清各1滴，分别滴于玻片的两侧，然后 于两侧各加1滴链球菌溶血素“O”，轻轻晃摇1分钟，使其充分混匀。于上述混合液中各加1滴乳胶试剂，轻轻晃摇8分钟，使其充分混匀，将反应板放在实验桌 上。,A群链球菌的鉴定,3.2 吡咯烷酮试验（PYR）检验方法 原理：特

13、异检验A群链球菌氨基肽酶 方法步骤：用PYR缓冲液A液浸润PYR测试条末端滤纸；用接种环从适合的琼脂培养基上挑取可疑待测菌落，在末端滤纸上 涂抹开或直接蘸取菌落；放置于密闭容器；352，孵育5min10min；滴加一滴PYR缓冲液B液至末端涂抹细菌处，观察是否有红色产生。产生红色即为阳性，则该菌为A群链球菌；否则，该菌非A群链球菌。,A群链球菌的防治原则,A群链球菌主要通过飞沫传播，应对病人和带菌者及时治疗，以减少传染源。另 外，还应对空气、器械和敷料等消毒。对急性咽喉炎和扁桃体的病人，尤其是儿童，须彻底治疗。以防止急性肾小球炎、风湿热和亚急性细菌 性心内膜炎的发生。首选药物为青霉素G。,THANKS,