1、质粒DNA的提取及检测实验报告四川大学实验报告 题目:质粒DNA的提取及检测 一 实验目的: 1. 学习碱裂解法提取质粒的原理和方法; 2. 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。 二 实验原理 1. 质粒 (Plasmid): 一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,常常编码一些对宿主有利的酶的基因,这些基因的表型包括抗生素抗性,产生抗生素、限制酶、修饰酶等。 2.载体(Vector): 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段,转化到细胞中去进行繁殖和表达,需要运载工具,携带外源基因进
2、入受体细胞的这种工具就叫载体。目前除了大肠杆菌中的质粒、 噬菌体、噬菌粒外,还有酵母人工染色体载体以及动、植物病毒载体等。噬菌体、M133.分离质粒DNA: (1)培养细菌使质粒扩增; (2)收集和碱裂解细菌; (3)分离和纯化质粒DNA。 4.碱裂解法 (1)溶液:50mmol/L葡萄糖,10mmol/EDTA-Na,25mmol/LTris-HCl (pH8.0) 作用:分散细胞,螯合金属离子使酶失活,防止DNA的降解 (2)溶液:0.4mol/L NaOH,2% SDS,临用前1:1配制 作用:细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与染色体DNA发生变性 1 / 9 四川大学实验报告
3、 (3)溶液 :5mol/L 醋酸钾60ml,冰醋酸11.5ml,双蒸水28.5ml 作用:酸性条件上质粒DNA复性,留在上清液。大肠杆菌DNA和蛋白质-SDS复合物等发生沉淀。 5.电泳 带电荷的物质,在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率(U)的对数与凝胶浓度(T)之间存在反平行线性关系。因此,要有效地分离不同大小的DNA片段,选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 6.提取质粒 在质粒提取的过程中,由于操作原因,提取的质粒可能有三种:线性DNA、开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒
4、 DNA泳动速度:闭环超螺旋线状开环。但有时也有也会出现相反情况,因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核酸染料含量有关。 三 实验材料及设备 1. 实验材料: (1)含质粒pUC18大肠杆菌,1.5ml塑料离心管,EP管架,微量取液器和取液器吸头,常用玻璃器皿(如三角瓶、量筒、试剂瓶等); (2)提取的pUC18,琼脂糖,锥形瓶,一次性手套,胶铲,封口膜,剪刀,取液器吸头。实验设备: 2. 实验仪器: 2 / 9 四川大学实验报告 (1)恒温摇床,高压灭菌锅,超净工作台,10、100、1000L取液器各一支,台式高速离心机,制冰机,漩涡器; (2)电泳仪,电泳槽,样品槽模板(梳子),有机玻璃
5、内槽,水平仪,取液器,微波炉,凝胶成像系统。 3. 实验试剂: (1)质粒的提取 a.LB培养液:胰蛋白胨(Tryptone)10g,酵母提取物(Yeast extract)5g,NaCl5g,琼脂(固体培养基)15g,用1N NaOH调pH7.5; b.溶液,溶液,溶液; c.氨苄青霉素(50mg/mL); d.抽提液(饱和酚:氯仿:异戊醇=25:24:1) 作用:氯仿可使蛋白质变性,有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大,可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。 e.无水乙醇 作用:除去DNA水化层,使DNA沉淀。 f.70%乙醇 作用:纯化质粒DNA。 g.TE缓冲液或ddH2O 作用
6、:溶解DNA 3 / 9 四川大学实验报告 (2)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 a. Gold view(DNA染料) b.1TAE缓冲液 c.上样缓冲液(6) 四 实验方法及步骤 1. 质粒DNA的提取 a) 将带有质粒pUC18的大肠杆菌接种在液体培养基中(加氨苄青霉素50g/mL),370C培养过夜; b) 取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中,10000rpm2min,弃上清液; c) 加入100L溶液I,漩涡器上充分混匀,在室温下放置10 min; d) 加入200L新配制的溶液,轻轻翻转23次,使之混匀,冰上放置5 min; e) 加入150L冰冷的溶液,盖紧后,温和颠倒3-
7、5次使混匀,产生白色絮状物,冰上放置15 min; f) 10000rpm 5 min,取上清液于另一干净的离心管中; g) 向上清液中加入等体积(约400L)酚:氯仿/异戊醇(25:24:1,v/v),振荡混匀,10000rpm 10 min,将上清液转移至新的离心管中; 4 / 9 四川大学实验报告 h) 加入等体积(约370L)氯仿/异戊醇(24:1),混匀,10000rpm 2min ,取上清液于新离心管中; i) 向上清液加入2倍体积无水乙醇,混匀, -200C放置1h; j) 12000rpm 5 min,倒去上清液,吸干液体; k) 加800L70%乙醇,离心12000rpm 1
8、 min,倒尽上清液,吸水纸吸干液体,室温自然干燥30min,直至变得透明无乙醇味; l) 加20L ddH2O ,混匀使DNA溶解完全,取5L做电泳检测,剩余的溶液放置-200C保存备用。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳检测 a) 琼脂糖凝胶板的制备 b) 称取0.3g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入30mL1TAE缓冲液,微波炉加热直至琼脂糖溶解; c) 待胶液冷却到650C(不烫手为宜),加入1L Gold view混匀,搅拌器上搅拌排除气泡,缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽(插入样品槽模板梳子 )内 ,静置30min左右,轻轻晃动拔出梳子; 3. 加样 5 / 9 四川大学实验报告 胶板放入电泳
9、槽中(样品孔位于负极),注入1TAE缓冲液淹没过胶板5mm,用取液器将提取的质粒DNA5L与1L上样缓冲液( 6 )混匀,加入胶板的样品小槽内。 4. 电泳 将电泳槽与电泳仪接通,调节电压为100V左右,直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约12cm处,停止电泳。 5. 观察和拍照 将胶板小心取出,放入凝胶成像系统中,调节位置居中,波长为254nm的紫外灯下,观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。 五 实验结果 6 / 9 四川大学实验报告 15000bpA带: B带10000bp Marker 7500bpC带 带D5000bp pEGFP-N3 带3000bpE 带1000bpF pE
10、T-28a-c 带250bpG 质粒凝胶电泳紫外荧光检测结果 1碱裂解法提取pEGFP-N3与pET-28A-c图DL15000Maker说明:从左到右依次为:pEGFP-N3、pET-28A-c、 可通过琼脂凝胶电泳进行检测。一般情况下,DNA所提取的质粒,常DNA是共价闭合环状提取的质粒为3条带。在细胞内,质粒DNA以超螺旋形式存在;如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻,分;若两子就能旋转而消除链的张力,这种松弛型的分子叫做开环DNA 条链在同一处或相近的部位断裂,则变成线性分子。DNA的构型不同而异,其速度在电泳时,同一质粒的电泳速度因DNA 7 / 9 四川大学实验报告 从大到小的次
11、序为:cccDNA线性ocDNA,共价闭环DNA的泳动速度最快,电泳速度最快的条带显色最深。但在优化条件下,如在冰浴中或使用试剂盒提取时,可以只出现一条带或主要出现一条带,即超螺旋带。 由图可知,本次实验结果出现了明显的三条带,表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。与Marker比照,分子量基本符合对应的分子量条带。实验结果较好。 六 结果讨论与结论: 1. 实验结论: 通过碱裂解方法,我们将细菌的质粒变性提出,又通过多个洗涤、纯化步骤,得到了提纯的质粒,在最后的本次实验结果出现了明显的三条带,表明该样品中同时出现共价闭合环状DNA、开环DNA和线性DNA分子。与
12、Marker比照,分子量基本符合对应的分子量条带,实验结果较好。 2. 讨论一:溶液II为什么现配现用?而且需放置在常温下?答:溶液中NaOH放置过久会与空气中CO2反应变质,导致溶液pH下降,无法达到很好的裂解效果;溶液中SDS成分在温度较低 环境下由于溶解度下降导致析出,溶液失去效果。3. 讨论二:抽提液(饱和酚:氯仿:异戊醇)的作用。氯仿: 8 / 9 四川大学实验报告 异戊醇为什么加两次? 作用:使样品中杂质蛋白变性析出,被抽提出样品;第二次加入异 戊醇目的为洗净上一步抽提中样品残留的饱和酚。4. 讨论三:实验中无水乙醇与70%乙醇的作用。 用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀
13、DNA的方法.乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂. DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合;70乙醇的作用不是沉淀DNA,而是通过漂洗上一步得到的沉淀,使沉淀中的盐溶解,从而进一步纯化DNA。 5. 讨论四:电泳检测中忘加指示剂会出现什么情况?拔梳子和点样步骤的注意事项。 如果没有指示剂,则无法准确追踪电泳的进度。容易导致电泳不足或者过度。 拔梳子时,应当动作轻缓,轻微左右摇晃使梳子缓慢脱出。注意不要前后摇晃,导致跑胶起点不一或者胶板变形。 点样时,枪口要深入凹槽底部,但又不能使枪口触碰挤压胶板。 9 / 9
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