天然产物分离综述.docx

1、天然产物分离综述 四 川 大 学硕士研究生课程考试试卷姓名 冉艳 学号 S* 学院 华西药学院 专业 药物化学 任课教师 陈东林 课程名称 天然产物分离技术 课程成绩 考试时间 2011年12月 天然产物分离技术与方法摘要:本文概述了天然产物分离提纯的各种分离方法，简单介绍了各种方法的原理、特点，并以生物碱为例，介绍了各种方法在生物碱分离提纯中的运用。关键词：生物碱；分离方法；特点 生物碱广泛分布于多种植物中, 绝大多数具有显著生理活性。生物碱一般指存在于生物体内的碱性含氮化合物，多数具有复杂的含氮杂环，有碱性和显著的生理活性。其种类很多, 结构复杂, 共性是具有一定的碱性, 可与酸成盐。一些

2、生物碱因具有抗肿瘤、抗癌、低毒、低成本的特点，最近已成为人们研究的焦点。科学、高效地从植物中提取和分离纯化生物碱成分是扩大其实际应用的核心问题1。 分离纯化生物碱的方法有很多，笔者参考了近年来发表的有关天然产物分离纯化的分离技术文献，包括大孔吸附树脂、超临界流体、分子印迹技术、分子蒸馏、高速逆流色谱、高效液相色谱、离心分配色谱、真空液相层析等8种分离方法，比较各种方法的优缺点，为天然产物生物碱分离技术的发展提供参考。1 大孔吸附树脂1.1 大孔吸附树脂的概况 大孔吸附树脂是20 世纪60 年代发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂, 具有很好的大孔网状结构和较大的比表面积, 可通过物理吸附从水溶

3、液中有选择地吸附有机物。大孔吸附树脂具有良好的吸附性能, 主要应用于工业脱色、环境保护等领域。近年来, 大孔吸附树脂已广泛应用于天然植物中活性成分, 如苷类、黄酮、生物碱等大分子化合物的提取分离。对环烯醚萜苷、芍药苷、威灵仙总皂苷、淫羊藿黄酮、银杏总黄酮、延胡索生物碱、荷叶碱、多种天然色素、中药复方药物提取以及抗生素、维生素等生物化学制品的吸附分离都有良好的效果2。1.2 大孔吸附树脂的性能大孔吸附树脂是由苯乙烯、二乙烯苯或甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构, 其性质介于天然吸附剂(活性炭、硅胶和硅藻土) 和离子交换剂之间, 吸附特性与天然吸附剂类似, 比离子交换剂更容易再生。大孔吸附

4、树脂优点如下:（1)选择性良好,无机盐的存在有利于吸附；(2)分离和浓缩有机物, 得到的化合物灰份低；(3)物理化学稳定性高,不溶于酸、碱及有机溶剂, 机械强度好; (4)吸附和解吸较快,吸附容量大；(5)品种规格多,可根据化合物的性质来选择适当结构或极性的吸附剂；(6)吸附树脂呈小球状, 直径为0.20.8mm，因此流体阻力比活性炭小, 流速较快2 。1.3 大孔吸附树脂的分离原理 大孔吸附树脂是吸附性和分子筛性原理相结合的分离材料。吸附树脂表面上的原子力场不饱和, 有表面能, 因而可以吸附某些分子以降低表面能。其吸附性是范德华引力或产生氢键的结果, 分子筛性是由其本身多孔性结构决定的。大孔

5、吸附树脂可以有效地吸附具有不同化学性质的各种类型化合物, 其吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质,即表面的亲水性或疏水性决定了它对不同有机化合物的吸附特性。根据大孔吸附树脂的结构表面不带或带有不同极性的功能基, 可分为非极性、中极性和极性三类, 它们的结构特性和吸附性各异。非极性吸附树脂是由偶极距很小的单体聚合制得, 不带任何功能基, 孔表的疏水性较强, 可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物。极性吸附树脂是指含酰胺基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂, 通过静电相互作用吸附极性物质。中极性的吸附树脂是含酯基的吸附树脂, 其表面兼有疏水和亲水两部分。一般来说, 非极性树

6、脂在极性溶剂( 加水) 中吸附非极性物质, 极性树脂则易在非极性溶剂中吸附极性物质, 中极性树脂既可在极性溶剂中吸附非极性物质, 又可在非极性溶剂中吸附极性物质2。1.4 大孔吸附树脂在生物碱分离中的应用 分离生物碱可用阳离子交换树脂, 但洗脱时需用酸、碱或盐类洗脱剂, 这将会给后面的分离造成麻烦, 而用吸附树脂可避免引入外来杂质的问题。赵骏等利用4 种型号的大孔吸附树脂纯化荷叶生物碱, D- 101 型大孔吸附树脂对荷叶生物碱的比吸附量最大, 采用梯度洗脱可使荷叶碱产率达0.8%, 产品纯度( 重量百分比) 在5070%之间3。刘俊红等将3 种大孔吸附树脂应用于延胡索生物碱的提取分离, 吸附

7、的生药量为树脂的1倍, 用两倍树脂量的95 %乙醇能基本洗脱完全,对于优化生产工艺具有一定的参考价值4。2 分子印技术2.1 分子印技术的概况 分子印迹技术（Molecular imprinting technology,MIT）又称为分子烙印技术，属于高分子化学、材料科学、生物化学、分析化学等之间的一个交叉学科领域。分子印迹技术是为获得在空间结构和结合点位上与某一分子（通常称为模板分子）完全匹配的聚合物的实验制备技术。分子印迹聚合物（Molecularimprinting polymer，MIPs）是指以目标分子为模板分子，将具有结构互补的功能化聚合物单体通过共价或非共价的方式与模板分子结合

8、，加入交联剂进行聚合反应，反应完成后将模板分子提取出来后形成的一种有固定空穴大小和形状及有确定排列功能团的交联高聚物。分子印迹技术之所以发展如此迅速，主要是因为它具有预定性（Predetermination）、识别性（Recognition）和实用性（Practicability）。由于MIPs 具有抗恶劣环境的能力，表现出稳定性强和使用寿命长等优点，因此对其合成及应用研究十分活跃，涉及的范围很广，如手性物质分离，生物传感器，模拟抗体与受体，模拟酶催化，氨基酸及多肽等生物大分子、金属离子、药物分子、天然产物等的分离与纯化1。2.2 分子印技术的基本原理 在一定溶剂（也称致孔剂）中，模板分子与功

9、能单体依靠官能团之间的共价或非共价作用形成主客体配合物；然后加入交联剂，通过引发剂引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高联的刚性聚合物；最后将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来。这样在聚合物中便留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与模板分子官能团互补的由功能单体提供的功能基团，如果构建合适，这种分子印迹聚合物就象锁一样对此钥匙具有选择性。这便赋予该聚合物特异的“记忆”功能，即类似生物自然的识别系统，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性1。2.3 分子印技术在生物碱分离纯化中的应用 近年来生物碱类活性成分的提取已

10、成为分子印迹技术领域的研究热点。Mosbach 等在1993 年首次利用药物茶碱与甲基丙烯酸（MA）之间可氢键键合，制成了药物茶碱分析用色谱固定相。由此方法已合成了对药物、生物活性物质、酶等有识别功能的树脂、凝胶固定相等高分子材料，使分子烙印从最初的手性体分离材料制备和手性体分离这一单一应用范围迅速地扩展到化学、生物、医药等各个领域5。陈移姣等以咖啡因为模板分子，采用水溶液悬浮聚合法制备了用于色谱分离（作HPLC 的固定相）的微米级分子印迹聚合物微球（MIPMs）。结果表明当以茶叶碱为竞争分子时，MIPMs 对咖啡因有强的吸附和特异性选择识别能力，能满足茶叶中咖啡因分离富集的需要，这为在天然物

11、中质量分数低、药效高的成分的鉴定分析和分离纯化提供了方法借鉴6。张静等以士的宁为模板分子，采用原位分子印迹技术，合成了士的宁分子印迹整体柱。通过优化合成条件，确定了模板分子、功能单体与交联剂之间的比例以1416 最佳；对士的宁整体柱的色谱条件包括流动相组成、流速、柱温等进行了考察，并用于士的宁和马钱子碱的分离，其分离因子为3.57。Lai 等以苦参碱为模板制作了分子印迹膜，从槐属植物苦参中提取分离苦参碱。结果分子印迹膜对苦参碱的回收率可达到71.4%8。以上研究结果表明，分子印迹膜的最大特点就是对模板分子的识别具有可预见性，对于特定物质的分离极具针对性。其中分子印迹复合膜又将膜分离的可连续化操

12、作特点与分子印迹技术进行了结合，是最有应用前景的一种膜技术。3 高效液相色谱3.1 高效制备液相色谱的工作原理及特点 HPPC 的原理是利用混合物中各组分物理化学性质的差异, 使它们以不同程度分布在两个不相溶的相中, 且各组分可在两相的相对运动过程中, 在两相中发生多次分布, 从而达到分离的目的。与其它分离手段相比, HPPC具有以下特点:（1)采用高柱效色谱柱, 其填料多为细颗粒多孔材料, 分离效率高； （2)应用范围广泛, 对极性和非极性、离子型和非离子型、小分子和大分子、热稳定性和热不稳定性化合物均具有较好的分离效果； （3)根据所分离化合物的理化性质可配备不同类型的检测器, 如紫外检测

13、器( UV )、二极管阵列检测器( DAD )、荧光检测器( FD )、蒸发光散射检测器( ELSD )等, 实现稳定可靠的在线检测；（4)可连续自动化操作9。3.2 高效液相色谱在生物碱分离纯化中的应用Mueller等10采用多种型号的制备色谱柱, 以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱,从生长于澳大利亚的植物Mitrephora diversifolia中分离得到了抗疟药芴酮生物碱。艾秀珍11等对辣椒精进行预处理, 先制得白色辣椒碱类化合物, 再用适量流动相溶解, 采用自装ODS C18柱(200mm10.0mm,2540.m)对其进行纯化。确定的操作工艺为: 流动相为甲醇-水( 75#25),

14、辣椒碱类化合物进样质量浓度为180 g. L- 1, 进样体积为2.08mL,流速为4.0 mLmin-1。得到的辣椒碱单体纯度为95.23%, 回收率为93.27%, 产率为4.38 g.L-1.h-1,单位产品流动相消耗为0.087 L.g-1。边清泉12在从喜树碱提取物中分离制备喜树碱标准品时, 所用的色谱柱Shim.pack PREP.ODS(H)KIT(250mm20mm),流动相为甲醇-水-异丙醇(6:3.8:0.2),流速为10 mL.min-1,产品纯度达99.64%。4 高速逆流色谱4.1 高速逆流色谱概况高速逆流色谱( highspeed countercurrenthro

15、matography，HSCCC) 是一种连续高效的液液分配色谱分离技术。该技术由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附引起的样品损失、失活、变性等问题，特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、环境分析等领域13。4.2 高速逆流流色谱的分离原理高速逆流色谱分离原理是利用螺旋柱在高速行星运动时产生的巨大离心力，使螺旋柱中互不相溶的两相不断混合，达到一种特殊的流

16、体动力学平衡单向流体动力学平衡，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂都反复进行着混合和静置的分配过程，这一过程频率极高，当柱心以800r /min 旋转时，频率超过每秒13 次。流动相不断地穿过固定相，同时保留其中的一相( 固定相) ，利用恒流泵连续泵入另一相( 流动相) ，流动相载着溶质( 样品) 进入螺旋柱并不断反复穿过固定相，使样品在两相之间不断反复地进行分配，由于样品中各组分在两相中分配系数不同，导致在螺旋柱中的移动速度不同，因而能使样品各组分按分配系数的次序，依次得到分离。4.3 高速逆流流色谱的特点 高速逆流色谱技术的特点有以下几点: a.操作简单易行。传统的制备方法，如重结晶、柱层

17、析和高效液相色谱( 制备型) ，操作周期长且步骤繁琐，HSCCC无需对样品进行复杂的处理，出峰可以在线检测，且可以和灵敏度高的检测技术联用，方便、快捷、准确。b.应用范围很广。HSCCC 中使用的两相溶剂体系组成可以是任意的，故可以适用于各种极性范围的化合物的分离。c.无需固体载体。由于不使用固体载体，所以样品不会出现不可逆吸附、污染、失活、变性、以及峰形拖尾等现象。因此HSCCC 在经过多次重复分离均可以实现较好的重现性以及得到较高的回收率。d.产品纯度高。选择正确的溶剂体系，可以将样品分离后得到高于90% 纯度的产品。e.适用于制备型分离。4.4 高速逆流色谱在生物碱分离纯化中的应用 近年

18、来, 用HSCCC 已成功分离了多种生物碱。分离生物碱成分常用的溶剂体系主要有正己烷-乙酸乙酯-甲醇(或者乙醇、正丁醇) -水体系和三氯甲烷-甲醇-水体系。如LiuR以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水( 5：5：7：5)为溶剂体系, 从吴茱萸中分离出5种生物碱14。Tang Q F用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0. 2mo l/L HC l ( 1：3. 5：2：4. 5)从黄花乌头中分离出6种生物碱15。5 离心分配色谱5.1 离心分配色谱概况 离心分配色谱技术( centrifugal partitionchromatography, 简称CPC ) 属于现代逆流色谱技术的一种。广义上讲, 它和滴流

19、逆流色谱(DCCC) 、旋转腔室逆流色谱(RLCCC) 以及回旋腔室逆流色谱(GLCCC) 等同属于非螺线管式的逆流色谱。值得一提的是, 国内文献通常所说的高速逆流色谱装置( HSCCC) 多是专指基于多层螺线管行星式离心运动的色谱设备( 国外有文献为与离心分配色谱CPC 相区别而称之为CCC 设备) , 它与离心分配色谱最明显的差异是: 前者通过螺线管的行星式运动( 自转和公转) 来实现固定相的保留和两相的有效混合和传质；后者通过离心力场的作用在分配槽(channel)中保留固定相, 并实现两相间的有效接触和传质16。离心分配色谱以其高效率和无固相吸附剂污染等优点, 被广泛应用于天然产物粗提

20、物的进一步分离提纯中。5.2 离心分配色谱在生物碱分离提纯中的作用 为简明起见, 将CPC 用于天然产物中生物碱分离提纯的一些例子列于表2 中。表中的溶剂比均为体积比。更为具体的操作步骤和条件可以查阅相关的文献, 这里不再详细说明。6 真空液相层析6.1 真空液相层析的定义真空液相层析( Vacuum Liquid Chromatography, 简称VLC) 是近年来在国外化学实验室中迅速发展起来的一种新的层析技术, 它是利用柱后减压, 使洗脱液迅速通过固定相, 从而很好地分离样品。真空液相层析具有快速、简易、高效、价廉等优点, 目前已成功地用于萜类、木脂素、生物碱等生物活性天然产物的分离。

21、6.2 真空液相层析的特点真空液相层析每收集一个流分均需将柱子抽干, 相当于综合了制备薄层色谱( PTLC) 和真空抽滤技术。由于固定相颗粒细小, 表面积较大, 装柱合理, 加上真空抽滤使移动相快速通过柱子, 分离速度快, 一般几小时即可完成。由于减少了涡流与扩散现象, 分离效果较好。真空液相层析不同于常压柱层析和快速柱层析, 后者洗脱剂是连续的, 在操作过程中不能间断, 而且快速柱层析采用柱前加压, 比较而言真空液相层析所用设备极其简单、便宜, 操作方便。同时, 真空液相层析处理样品量可大可小。几十克的样品仍能以较快的速度完成。在快速柱层析中, 由于受玻璃柱的限制, 处理6g 以上的样品时非

22、常困难。常压柱虽然没有样品量的限制, 但极其耗时, 固定相和溶剂用量较大, 分离效果也由于样品涡流与扩散现象较严重而大打折扣。真空液相层析尤其适用于频繁的梯度淋洗。流动相的选择与一般柱层析相同, 即先用TLC 来选择条件。一般先用极性小的溶剂( 如石油醚) , 然后逐步增加洗脱液的极性。极性溶剂的增加开始时较慢(如按1%,2% ,3%递增),然后较快( 5%, 10%,20%,50% ) 直至100% 。当然VLC 法也有不足之处, 在使用低沸点熔剂( 如石油醚) 时, 要严格控制好真空度, 防止大量溶剂挥散。6.3 真空液相层析在生物碱分离提纯中的作用 采用真空液相层析可快速将乌头中二萜生物

23、碱分离纯化。如Aconitum columbianum 提取物中pH912 的生物碱混合物(1g) 经真空液相层析(氧化铝60) , 甲苯- 氯仿1.4 洗脱得到265mg talatizamine(4) ,再用氯仿- 甲醇19.1 洗脱可得到247mg cammaconine(5)17。7 结语 天然产物分离和纯化技术由于对象品种多, 而技术多样化。天然产物分离纯化技术发展很快, 不断融入新的技术如分子精馏、分子印迹等18。中国天然产物的分离和纯化技术还比较落后,和国外差别较大, 特别是制备色谱等高纯度制备分离技术, 导致中国目前依然是粗产品加工为主。因此新型分离纯化技术的研究特别是一些平台

24、技术如制备色谱等对中国中药现代化和新药开发有重要意义。参考文献：1 杨鑫,张华,董爱军,张英春,赵海田,姚磊,佘永新,王静. 分子印迹技术在天然产物分离纯化中的应用J.东北农业大学学报,2011, 42(8): 1461532 刘飞,赵莹. 大孔吸附树脂及其在天然产物分离纯化中的应用J.齐鲁药事，2008,27(10):6796813 赵骏,李小年.利用大孔吸附树脂纯化荷叶生物碱.中药材,2003,26(9):6696704 刘俊红,魏峻峰,王洪志等.大孔吸附树脂在延胡索生物碱提取分离中的应用.中草药,2002,33(1):37385 Vlatakis G, Andersson L I, Mo

25、sbach K, et al. Drug assay using antibody mimics made by molecular imprintingJ. Nature, 1993,361(6413): 645-246.6 陈移姣, 周兴国, 李桂玲. 悬浮聚合法制备咖啡因分子印迹聚合物微球及其性能研究J. 中草药, 2005, 36(5): 692-695.7 张静, 贺浪冲, 傅强. 体液中微量士的宁的富集及同时检测J.法医学杂志, 2005, 21(1): 36-38.8 Lai J P, He X W, Jiang Y, et al. Preparative separation

26、and determination of matrine from the Chinese medicinal plant Sophora flavescens Ait by molecularly imprinted solid phase extractionJ. Anal Bioanal Chem, 2003, 375(2): 264-269.9 陈鸳谊,李行诺,张翠萍,颜继忠.高效制备液相色谱在天然产物分离中的应用J.药学进展，2010,34(8):337343 10 Mue ller D, Dav is R A, Duffy S, et al. Antim a lar ia l ac

27、tiv ity of aza fluorenone a lkalo ids from the Austra lian tree M itrephora diversifo lia J . J Nat P rod, 2009, 72 ( 8 ):15381540. 11 艾秀珍, 沈波, 危凤, 等. 反相制备液相色谱分离纯化辣椒碱单体 J. 高校化学工程学报, 2008, 22 ( 5 ):774778. 12 边清泉. 喜树碱标样制备方法的研究 J. 绵阳师范学院学报, 2004, 23( 2): 5860.13 辛莉,施江,刘素云,郭永新,郁飞燕.高速逆流色谱及其在天然产物分离中的研究进展

28、J.食品工业科技,2009,30(11):335342 14 Liu R, Chu X, Sun A, et a.l Preparative iso lation and purifica tion of alka loids from the Chinese m ed ic ina l herb Evod ia rutaecarpa ( Juss. ) Benth by high speed coun tercurrent chrom atography J . J Chrom atog rA, 2005, 1074 ( 1 /2): 139144. 15 Tang Q F, Yang C

29、H, Y eW C, et a.l Preparativ e iso lation and pur ification of bioactive constituents from Aconitumco reanum by highspeed countercurrent chroma tog raphycoup led w ith evaporative ligh t scattering detection J. JChroma tog rA, 2007, 1144( 2): 203207.16 刘江,周荣琪. 离心分配色谱技术及其在天然产物分离中的应用J.化工进展,2003,22(11):1176118117 陈业高, 张燕,冯丽萍.真空液相层析及其在生物活性天然产物分离中的应用J.云南化工,2000,27(5):192118 谭天伟.天然产物分离新技术J.化工进展,2003.22(7):665668