细胞生物学实验教案.docx

1、细胞生物学实验教案e细胞生物学实验授课教案课程细胞生物学实验班级11级3、4、5班学期2012-2013-2课时2教师何飞上课日期课程类型实 验课程名称（章、节）细胞生物学实验实验一 细胞大小测定和生物绘图法教学目的、要求1. 掌握用测微尺测定细胞大小的原理和方法。2. 掌握生物绘图的基本方法。教学重点1.测微尺测定细胞大小的原理和方法。2.生物绘图的基本方法。教学难点主要教具设备材料1. 实验材料：口腔黏膜上皮细胞，洋葱内表皮，西红柿，芹菜，韭菜，红辣椒2. 实验用品：普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签、烧杯、吸管、0.9%生理盐水、0.1%亚甲基兰、蒸馏水、吸水纸，HB及2H或

2、3H绘图铅笔、橡皮、直尺、绘图纸、铅笔刀、各种细胞标本玻片。思考题人口腔上皮细胞、洋葱表皮细胞差异课后记教学内容备注（一）测微尺的原理测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两尺配合使用，可以测量细胞大小。目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片，圆片中央刻有一条直线，此线分为若干格。物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm（10um）。当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来测定，求出某一放大率时目微尺

3、每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：物测微尺格数目微尺每格所代表的实际长度= 10um 目测微尺格数例如：目微尺是100倍，其对应的物微尺使80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100=8um。测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5倍，则此细胞横径为85=40um。（二）生物绘图的基本要求1. 具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，要求真实

4、感，立体感，精美而美观。2. 图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。3. 绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。4. 绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。5. 绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。 6. 绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及放大倍数。细胞生物学实验授课教案课程细胞生物学实验班级11级3、4、5班学期2012-2013-2课时2教师何飞上课日期课程类型实 验课程名称（章、节）细胞生物学实验实验二 细胞

5、中过氧化物酶的显示教学目的、要求1. 观察过氧化物酶的分布2. 掌握过氧化物酶显示方法的原理及操作步骤教学重点过氧化物酶显示方法教学难点主要教具设备材料1. 材料：洋葱根尖2. 药品：0.1%钼酸胺，1%联苯胺，生理盐水（0.7%-0.9%）0.1%钼酸胺：取0.1g钼酸胺溶于100ml双蒸水中。1%联苯胺：取1g联苯胺溶于100ml双蒸水中。 联苯胺混合液：联苯胺（研磨）0.2g溶于100ml蒸馏水，过滤，于滤液中滴加3% H2O22滴，储存于棕色瓶中。3.仪器用品：显微镜、载玻片、盖玻片、解剖刀片思考题课后记教学内容备注1. 取新鲜洋葱根尖于载玻片上压片。2. 加1滴0.1%钼酸胺，置5分

6、钟。3. 加1%联苯胺溶液1滴，待其出现蓝色。4. 用生理盐水冲洗1次。5. 加盖玻片，观察。细胞生物学实验授课教案课程细胞生物学实验班级11级3、4、5班学期2012-2013-2课时2教师何飞上课日期课程类型实 验课程名称（章、节）细胞生物学实验实验三 细胞内糖类的显示教学目的、要求1. 掌握多糖鉴定的PAS法的原理与技术，2. 观察细胞内多糖的分布。教学重点线粒体的超活染色技术教学难点主要教具设备材料1器材显微镜、剪刀、镊子、解剖针、染色缸、载玻片、盖玻片、吸水纸、恒温水浴箱、小烧杯（10ml）2材料马铃薯块茎3试剂及其配制Schiff试剂、0.5%过碘酸溶液、70%乙醇、pH4.2磷酸

7、缓冲液、淀粉酶思考题简述PAS法的反应原理，绘图描述细胞内多糖的分布。课后记教学内容备注切取马铃薯块茎，放入过碘酸溶液中，10min后用70%乙醇漂洗一下。将薄片放入Schiff试剂中2025min。取出薄片放入70%的乙醇中浸1min。用70%乙醇中冲洗（将薄片放在载玻片上，用吸管吸乙醇滴片）。加上盖玻片镜检。对照薄片可于切下后，以pH4.2磷酸盐缓冲液配制的淀粉酶消化40min，再进入染液。结果：块茎组织细胞内可见到紫红色或深红色淀粉颗粒，对照无色或色淡。细胞生物学实验授课教案课程细胞生物学实验班级11级3、4、5班学期2012-2013-2课时2教师何飞上课日期课程类型实 验课程名称（章

8、、节）细胞生物学实验实验四 细胞Feulgen反应教学目的、要求1. 了解孚尔根反应的原理。2. 学习DNA的孚尔根染色方法及其操作步骤。3. 观察染色结果。了解细胞中DNA的分布。1. 教学重点DNA的孚尔根染色方法教学难点主要教具设备材料1. 仪器设备：普通光学显微镜、冰箱、烘箱、水浴锅、染色缸、100ml小烧杯、载玻片、盖玻片若干、吸水纸若干、1L棕色试剂瓶。2. 实验材料：洋葱根尖或蚕豆根尖切片、人血涂片。3. 试剂：1mol/L HCl：82.5ml浓盐酸稀释于1000ml蒸馏水中。Schiffs试剂配制：100ml蒸馏水煮沸，加入0.5g碱性品红，搅拌溶解，溶液为红色。待溶液冷却到

9、50，过滤，加入10ml 1mol/L HCl,摇动；继续冷却至25，加1.0g偏重亚硫酸钠，摇匀。室温，暗处保存24h,直到溶液变为淡黄色或近于无色。此时，品红已转化为无色品红衍生物，这一溶液称为Schiffs试剂。如果急用，加几粒活性炭，摇匀，过滤。漂洗液配制：此溶液用时新鲜配制。配制漂洗液与配制Schiffs试剂所用偏重亚硫酸钠必须一致。偏重亚硫酸钠 5ml1mol/L HCl 5ml蒸馏水 90ml5%三氯乙酸：5g三氯乙酸溶解定容于100ml蒸馏水中。0.5固绿酒精溶液：0.5g固绿粉末溶于100ml95%酒精中。思考题1. 绘图表示蟾蜍或鹌鹑血细胞中DNA的原位分布情况。2. 简述

10、Feulgen反应的原理及关键步骤。说明Feulgen反应中设立对照组的必要性课后记教学内容备注实验原理：核酸是最重要的生物大分子之一，它和蛋白质一起构成生命的主要物质基础。核酸的最主要的生物学功能是它直接参与生物遗传信息的传递过程.在真核细胞中DNA主要分布在细胞核中,并与蛋白质结合核蛋白,构成染色质(体)的主要成分.在线粒体和叶绿体中也有少量DNA存在。根据核酸三种成分的不同特性,可用不同方法加以显示。核酸的碱基具有共轭双键,具有吸收紫外光的性质,其吸收高在260波长处,因此,可有紫外吸收法对核酸进行定量测定。核酸的戊糖部分经稀酸水解后生成醛，可与Schiff氏试剂生成特异性的反应.这就是

11、显示DNA的传统细胞化学方法Feulgen反应。Feulgen反应的机理:用稀酸水解DNA,首先破坏糖键,然后破坏糖和嘌呤碱之间的苷键,从而暴露出脱氧核糖化合物,通过磷酸键被连结在核糖主键中,稳定地保持着呋喃糖的形式,并在脱氧核糖的一端(C)性成游离的醛残基,像醛一样可以和Schiff氏试剂(无色品红亚硫酸)结合,形成紫红色化合物,所以只有DNA的部位,才能呈现紫红色阳性反应。如果稀酸水解DNA继续进行,则会使蛋白质和核酸进一步被去除。所以过度水解会使Schiff氏试剂的染色深度下降,甚至使反应呈阴性。实验框图：固定酸水解染色水洗镜检1.固定:血涂片 室温干燥正常反应片 对照片 90三氯醋酸1

12、5min 蒸馏水略洗 2.稀酸水解:1mol/L盐酸 冷3 min 1mol/L盐酸 60水浴5-12 min 1mol/L盐酸 冷略洗3.染色: Schiff氏试剂 暗盒避光30 min亚硫酸水I,II,III 各3 min4.水洗:流水冲洗 2 min 蒸馏水 略洗 镜检5.Feulgen反应的结果：由于DNA主要分布在细胞核，所以经Schiff氏试剂反应着色后，细胞核呈现深紫红色，而细胞的其它部分无色。如用固绿复染，则细胞质和核仁呈现浅绿色。6.Feulgen反应应注意的问题：做对照实验：为了检验Feulgen反应的阳性的可靠程度，最好用DNA酶消化细胞材料，取得Feulgen阴性反应作

13、为对照。如果没有DNA酶，也可以用5%三氯醋酸抽提核酸作为阴性反应对照。稀酸水解的时间: Feulgen反应的一个关键步骤是水解DNA，使其释放出游离的醛残基，但水解时间要适宜。若水解时间不够,嘌呤硷脱落不下来，反应就变弱；反之，若水解时间过长，则可使DNA和蛋白质过度降解，使反应变弱，甚至呈阴性反应。 稀酸水解的时间一般为5-15 min，随动植物种类以及固定剂的不同而异。 Schiff氏试剂的质量: Schiff氏试剂的好坏直接影响着DNA的呈色反应，所以应选用质量好的碱性品红来配制Schiff氏试剂，并注意避光保存，防止氧化变红失效。细胞生物学实验授课教案课程细胞生物学实验班级11级3、

14、4、5班学期2012-2013-2课时2教师何飞上课日期课程类型实 验课程名称（章、节）细胞生物学实验实验五 细胞融合教学目的、要求1.了解PEG 诱导细胞融合的基本原理。2. 通过PEG 诱导的鸡红细胞之间或鸡红细胞与大鼠红细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合技术。教学重点PEG 诱导细胞融合教学难点主要教具设备材料(一) 材料:新鲜鸡血，大鼠若干只。（二）器材: 离心机、显微镜、天平、水浴锅、血球计数板、滴管、离心管、容量瓶、广口瓶、细口瓶、烧杯、注射器、盖玻片、载玻片。（三）试剂1. Alsever 溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，溶于100ml双蒸水中

15、。2. 0.85生理盐水。3. GKN 溶液：NaCl 8g，KCl 0.40g，Na2HP042H2O 1.77g，NaH2P04.H2O0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml 双蒸水中。4. 1%詹纳斯绿B 溶液（原液）：称取50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer 氏液，稍加微热(3040)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1原液。5. 詹纳斯绿B 溶液（应用液）：取1原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混匀即可。现用现配。6. 50PEG 溶液：称取一定量PEG(WM：4000)放入烧杯，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至50时，加入等体积预热至50的GKN

16、 溶液，混匀，置37备用。7.Ringer 氏液 氯化钠 0.85g 氯化钾 0.25g 氯化钙 0.03g 蒸馏水 100ml思考题简述PAS法的反应原理，绘图描述细胞内多糖的分布。课后记教学内容备注细胞融合(cellfusion)或细胞杂交(cellhybridization):是指真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。细胞融合包括质膜的连接与融合，胞质合并，细胞核、细胞器和酶等互成混合体系。细胞融合技术广泛应用于细胞生物学、遗传学、病毒学、肿瘤学的研究。例如，细胞周期调控的研究，基因互补分析、检测病毒，胞对病毒敏感因素的分析、肿瘤细胞恶性分析等等。单克隆抗

17、体技术就是通过细胞融合技术发展起来的，对生命科学的研究及医学方面的应用产生了重大影响。在人工条件下，只有在某些诱导物（如仙台病毒、聚乙二醇等）的诱导下，使亲本细胞膜发生一定的变化，才能使两个或多个或更多的细胞融合。细胞融合过程，首先是在诱导物的作用下出现细胞凝集现象。然后，在细胞粘连处发生融合，而成为多核细胞。最后，经有丝分裂，细胞核进行融合，遂形成新的杂种细胞。除了同种类细胞间可以融合,种间远缘细胞也能融合,细胞与组织不同,不排斥异类、异种细胞,动物细胞如此，植物细胞也是如此。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heter

18、okaryon)。细胞融合后的多核细胞大多只能存活一段时间（约十几日）就相继死亡，而只有双核的异核体才能存活下来。存活下来的异核体经有丝分裂，染色体合并在一个细胞核内，形成杂种细胞(hybrid cell)。诱导细胞融合的方法诱导细胞融合的方法诱导细胞融合的主要方法有： 1.病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。病毒被膜中目前发现了两种糖蛋白。较大的

19、一种具有粘附细胞和凝血的作用；较小的一种可介导病毒同宿主细胞融合,也可诱导细胞与细胞融合，称为融合蛋白(fusionprotein)。人工利用病毒诱导细胞融合即是利用病毒的这一特性,使用时先用紫外线将病毒灭活,稀释到一定浓度后加入到细胞悬液中诱导细胞融合。病毒介导细胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖与灭活，如灭活不完全易对实验人员造成伤害。2.化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：可促使细胞凝集；破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞

20、膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。3.电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。本实验采用鸡红细胞和大鼠红细胞为研究对象，在融合剂聚乙二醇(PEG)的作用下，促使鸡-鸡红细胞、鸡-鼠红细胞等发生融合。实验操作1. 红细胞的制备(1) 鸡血红细胞的制备注射器内先吸入 2ml Alsever 溶液，从鸡翼下静脉取2ml 鸡血，注入离心管，再加入6ml Alsever 溶液，使之成为1：4 悬液。(2) 取lml 鸡血悬液，加入4ml 0.85生理盐水，混匀平衡后，800rmin离心3min，弃去上

21、清液，再按上述条件离心2 次。最后，弃去上清液，加GKN液4ml，离心1 次。(3) 弃去上清液，加GKN 液(体积比1：9)，制成10细胞悬液。(4) 大鼠血红细胞的制备左手抓住大鼠，将大鼠头部向下，右手持尖头镊子，轻轻将镊子插入大鼠眼眶内，然后将眼球向外拉出，此时流出的血液置于预先盛有10ml Alsever 溶液的烧杯中，操作顺利的话，可以得到610ml 大鼠血。然后按上述鸡血红细胞制备的方法制成10细胞悬液。2. 细胞计数取以上悬液以血细胞计数器计数，若细胞密度过大，用GKN溶液稀释至(34)107 个ml。3. 温育取以上细胞悬液 lml 于离心管，放入37(39左右更佳)水浴锅中预

22、热。同时将50PEG 液放入水浴锅中预热。4. 融合（1）待温度恒定后，在lml 细胞悬液中慢慢逐滴加入0.5ml 50PEG 溶液(慢慢沿离心管壁流下融合剂)，且边加边摇匀，然后放入水浴锅中。（2）细胞融合一段时间(2030min)后，加入GKN 溶液至8ml，静止于水浴锅中20 min 左右。（3）取出离心管，1500rpm/min的转速离心5分钟，使细胞完全沉降。弃去上清液，加GKN 溶液，再离心1 次。5. 染色弃去上清液，加入少量 GKN 溶液，混匀，取少量悬液于载玻片上，加入Janus green 染液小半滴，用牙签搅匀，3min 后盖上盖玻片，观察细胞融合情况。6.实验设计实验共

23、分为三种融合方式进行，即鸡红细胞鸡红细胞、大鼠红细胞大鼠红细胞、鸡红细胞大鼠红细胞融合，每位同学可选12 融合方式进行实验。实验步骤1 实验时取0.2ml鸡血保存液于EP管中。1500rpm离心10min 弃去上清，可见血细胞沉淀。2.用手轻弹管底，使沉淀松散，加入无血清1640培养液0.2ml制成悬液。然后放入38水浴中预热10min。3.吸取预热在38水浴锅中的50%PEG 0.2ml在38水浴锅中于1min内沿离心管壁逐滴加入离心管中，边加边摇动离心管，使之与细胞混匀，38水浴中保温。4.保温1520min 后轻轻混匀。取细胞液一滴制成临时制片，并加入少量Giemsa染色，用牙签混匀，3

24、min后，显微镜下观察细胞融合情况。（注意：1.细胞液不能多2.显微镜观察只用40观察）结果1. 在显微镜下，观察细胞融合情况，计算融合率。2. 融合率=视野内发生融合的细胞核总数视野内所有细胞核总数100注意事项1影响细胞融合的因素很多，其中对PEG要求更严格。实验时最好选择分子量在15006000（视细胞种类不同来定，也可参考文献）；PEG 的浓度以50%为好。2. 细胞融合对温度很敏感，过高过低的温度均不利于融合。实验最佳温度 应控制在3739范围内。3. PH 也是影响细胞融合成功与否的关键因素之一。所配的试剂溶液PH 值应控制在7.07.2。4. 为了便于观察到细胞融合的形态，需要对

25、细胞进行染色。除Janus green染液外，也可选择HE 染色或姬姆萨染液。细胞生物学实验授课教案课程细胞生物学实验班级11级3、4、5班学期2012-2013-2课时2教师何飞上课日期课程类型实 验课程名称（章、节）细胞生物学实验实验六 动物细胞培养教学目的、要求熟练掌握细胞的传代培养法。教学重点教学难点主要教具设备材料药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25胰蛋白酶，Hanks液。仪器：C02培养箱，倒置：显微镜，超净台。思考题课后记教学内容备注实验原理：传代培养是组织培养常规保种方法之一。也是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其

26、稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。【实验步骤】1人无菌室之前用肥皂洗手，用75酒精擦拭消毒双手。2倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37下预热。 3超净台台面应整洁，用0.1新洁尔灭溶液擦净。 4打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。5点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。 6将培养用液瓶口用75酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于

27、酒精灯旁的架子上。7倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用23 mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。8每个大培养瓶加入1 mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。9加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(710 mL大瓶，35 mL小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 10对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将

28、细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 细胞生物学实验授课教案课程细胞生物学实验班级11级3、4、5班学期2012-2013-2课时2教师何飞上课日期课程类型实 验课程名称（章、节）细胞生物学实验实验七 细胞膜通透性的观察和细胞活力测定教学目的、要求1、观察红细胞的溶血现象；2、掌握细胞膜的选择通透性原理。3、学习台盼蓝排斥实验的原理和方法教学重点台盼蓝排斥实验的原理和方法教学难点主要教具设备材料器材：试管，试管架试剂：血红细胞、0.32M葡萄糖、0.17M硝酸银、0.32M甘油、0.32M硫酸钠、0.32M乙醇、0.17M草酸胺、0.4%台盼蓝染液思考题课后记教

29、学内容备注一、1.观察 10%的血红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体2.观察溶血现象 取一支试管，加入0.4ml血红细胞悬液，再加入4ml蒸馏水，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。3.观察血红细胞对不同物质的通透性二、1. 将待染色细胞稀释至所需浓度。（方法及浓度范围与细胞计数相同） 2. 每0.1ml细胞悬液约加新鲜配置的染液一小滴，室温下染35min 。3. 染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放在高倍镜下观察。4. 死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽；活细胞不着色并保持正常形态，有光泽。计数100200个白细胞。统计未染色细胞。可按公式计算出细胞活力。 细胞活力（%）=未染色的细胞数/观察的细胞总数 100细胞生物学实验授课教案课程细胞生物学实验班级11级3、4、5班学期2012-2013-2课时4教师何飞上课日期课程类型实 验课