DNA分子标记研究进展.docx

1、DNA分子标记研究进展DNA分子标记研究进展第 7 卷 第 1 期 天 津 农 学 院 学 报 17, 11 N o V o l, 20002000 年 3 月 Jo u rna l o f T ian jin A g r icu ltu ra l Co llege M a rch () 文章编号: 1008- 5394 200001- 0021- 04 分子标记研究进展 DN A 1 2 王晓梅杨秀荣 ( )1 天津农学院水产科学系, 天津 300384; 2 天津市植保所, 天津 300112 摘 要: 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记。 本

2、文概述了几种主要的 DN A 分子标记的基本原理和特点, 同时对它们的优缺点进行了比较。 关 键 词: 分子标记 原理 特点中图分类号: Q 75 文献标识码: A遗传标记是基因型的特殊的易于识别的表现形式, 它是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与 1 进化等研究的主要技术指标之一。 理想的遗传标记主要应具备以下几条标准: ?具有较强的多态性; () ?表现为共显性, 因而能鉴别出纯合基因型和杂合基因型; ?选择中性 即无基因多效性; ?对主要的 农艺性状无影响; ?经济方便和易于观察记载。传统上一直沿用形态标记, 生物学研究进入细胞水帄后, () 人们开始利用细胞标记作为遗传标记, 该标

3、记是指染色体核型 染色体的数目、大小、着丝粒位置等和 ()带型 带、带、带等。随着同工酶技术的发展, 又广泛应用了从蛋白质水帄反映生物遗传差异的生 C G N 化标记。这三种标记的数目有限, 往往不能满足研究的需要, 并且它们有些是基因表达加工后的产物, 其 标记易受环境条件和发育阶段等因素的影响。 进入 80 年代, 随着分子生物学及分子克隆技术的发展和 完善, 诞生了直接从 水帄上进行遗传分析的分子标记, 在人类基因组计划的推动下, 分子标记的 DN A 研究与应用得到了迅猛的发展。 分子标记直接以 的形式表现, 不受环境条件和发育阶段的影响, DN A 标记的数目多, 多态性高。并且有许

4、多分子标记表现为共显性, 能提供完整的遗传信息, 当前分子标记已 广泛应用于基因组研究的各个方面。 ()1 限制性片段长度多态性 , R FL P R e st r ic t io n F ragm en t L en g th Po lym o rp h ism R FL P 是 80 年代中期发展起来的一种最早的分子标记。1980 年 Bo ste in 首先提出了利用 R FL P 作 为标记构建遗传图谱, 直到 1987 年 D o n is K e lle r 等人才构建出第一张人的 R FL P 图谱。R FL P 是由于分子中限制性内切酶酶切识别序列中出现碱基的插入、缺失、置换、

5、倒位而导致酶切位点的增减所 DN A 2, 3 引起的基因型间限制性片段长度的差异。 它的基本原理是: 不同材料的 用已知的限制性内切 DN A 酶消化后, 产生许多大小不等的 片段, 电泳分离、印迹转移到硝酸纤维膜上, 用放射性标 DN A So u th e rn 记的探针与膜上变性的酶切 进行杂交, 放射自显影, 即可显示出不同材料的多态性图谱, 即显示 DN A 出所分析的 序列间的 。目前, 有 2 种方法可进行 的 分析。一是上述原理所述, DN A R FL PDN A R FL P 其中用作 的探针可以是特殊基因的 克隆、克隆、随机的基因组 克隆和合成的 R FL P DN A

6、 cDN A DN A () 低聚核苷酸克隆。 二是对那些分子量较小的 样本 如线粒体 、核糖体 等, 可在酶切后 DN A DN A DN A 4 对其产物直接电泳, 将不同大小的限制性酶切 片段分离, 从而得到该 的 图谱。DN A DN A R FL P R FL P 标记呈孟德尔式遗传, 大多数 R FL P 的等位基因为共显性, 在任何分离群体中能区分纯合基 收稿日期: 1999211229 ( ) ) ( , 女 汉族, 讲师, 硕士, 主要从事分子生物学、组织学等方面的研究工作。 作者简介: 王晓梅 1962-因型与杂合基因型。标记的数目多且稳定, 可用于构建高密度的遗传图谱。但

7、该技术在操作过程中涉及 了 的提取、酶切、电泳分离、探针的制备和 杂交等一系列分子生物学技术, 步骤繁杂, 工 DN A So u th e rn () 作量大, 且分析中需要的 量大 2, 10 , 因此在很大程度上限制了 技术的应用。DN A gR FL P ()2 随机扩增多态 , RA PD R an dom A m p lif ied Po lym o rp h ic DN A DN A 是 1990 年由和领导的 2 个研究小组几乎同时发展起来的建立在 基 RA PD W illiam s W e lsh PCR 5, 6 () 础上的一种新型的分子标记技术。它的基本原理是: 采用

8、随机合成的寡核苷酸 通常 10 作 DN A bp 反应的引物, 对所研究生物基因组 进行 扩增。 一般说某一引物在真核基因组中可能有 PCR DN A PCR 很多的结合位点, 但只有在 4 000 之内, 存在反向帄行的与该引物互补的双链才能将合成的新 , bp DN A 链作下一次合成的模板, 经 35, 40 个循环, 即可得到大量的 片段, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、 DN A 染色, 紫外下显示 带纹。EB RA PD 探针; ?使用随机引物, 合成引物时无需预知 RA PD 技术具有其自身独特的优点: ?不需要 DN A 被研究的生物的基因组序列, 一套引物可用于不同生物的研究;

9、 ?RA PD 技术操作简便、快速, 可免去 中的克隆制备、同位素标记、杂交等步骤; ?分析所需 量少, 每个反应仅需R FL P So u th e rn RA PD DN A 样本受限制的情 几十纳克的 DN A , 仅为 R FL P 的 11 000, 1200, 这对生物早期取样鉴定或在 DN A 况下大有益处。但 RA PD 技术也有自身的局限性, 主要表现在两个方面。第一, RA PD 标记为显性分子 标记, 因此不能在 代区分纯合体与杂合体, 必须进行 分析; 第二, 扩增中退火温度较常规的 F 2 F 3 RA PD 反应低, 一般为 36 ?左右, 这样能保证短核苷酸引物与

10、模板的稳定配对并允许适当的错配, 增大 PCR 了引物在基因组 中配对的随机性, 提高了对基因组的分析效率, 但是由于采用的引物短, 值DN A Tm 低, 扩增结果易受外界因素的影响, 实验的重复性较差, 因此在实验中要严格控制实验条件, 才能得到可重复、理想的扩增效果。()3 扩增片段长度多态性 , A FL P A m p lif ied F ragm en t L en g th Po lym o rh ism 7 是 1993 年由荷兰 公司科学家 等人发明的一种 分子标记技术, 该技 A FL P k eygen e Zab eau DN A 术的基本原理是: 对基因组进行限制性酶

11、切片段的选择性扩增。主要步骤是: 将基因组进行DN A DN A 酶切片段的两端, 从而形成一个带接头的特异片段, 通过接 限制性酶切后, 将特定的接头连接在 DN A 头序列和 引物 3端的识别, 进行 扩增, 最终经过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 通过银染 PCR PCR 或放射自显影检测。技术实际上是将 和 相结合的一种技术。 该技术既继承了 的稳定性, 又具 A FL P R FL P PCR R FL P ( )有 反应快速、灵敏的特点, 同时克服了 和 的缺点, 且扩增的带纹多 50, 100 条。 PCR R FL P RA PD 的大多数扩增片段与基因组的单一位置相对应, 实

12、验重复性高, 该标记为孟德尔式遗传。 但该技 A FL P 术目前在国内多用试剂盒来完成整个实验, 实验成本高; 此外该技术已申请专利, 目前人们只能自由地 将该技术用于非赢利性的科学研究, 因此在某种程度上也限制了该技术的应用。 ()4 简单序列重复 , SSR S im p le Sequ en ce R ep ea t 在真核生物基因组中, 散在分布着由 1, 4 个碱基对组成的简单重复序列, 即 它又称为微卫星, SSR ()。序列的侧翼具有保守的序列, 由于重复基数的数目变化大, 因此 DN A m ic ro sa te llite DN A SSR DN ASSR 显示出较强的多

13、态性。 人们把以微卫星 DN A 标记建立的遗传连锁图称为继 R FL P 作图后的第二 代遗传连锁图。 1985 年 已从人肌红蛋白位点获得了 3 核心序列作探针, 与人的酶切后的总 Ieff rey s bp 体 进行杂交, 得到了杂交带谱, 大多数带纹代表人基因组内不同座位上的卫星 它们组合在 , DN A DN A 一起成为人的 指纹图, 它有高度的个体差异, 且按孟德尔方式稳定遗传, 此法流行了近 10 , 在法 DN A a8 医鉴定方面作出了贡献。1993 年和 改用小卫星探针显示带谱的方法, 创造了用 侧W u T an k sley SSR 第 1 期 23? ?王晓梅, 等

14、: DN A 分子标记研究进展 翼序列作引物的一部分, 用来扩增重复序列本身, 由于重复序列的长度变化极大, 因此是检测多态性的 一种有效的方法。 该技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点, 此标记为共显性, 所得的结果重 复性高。为了提高分辨率, 常使用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 它可检测出单拷贝差异。该标记比 R FL P 8 的多态性更丰富, 且操作上比 简便快速, 因此正在被广泛应用。R FL P ()5 2 SCA R Sequ en ceC h a rac te r ized A m p lif ied R eg io n 标记是 1993 年在 技术的基础上发展起来的。 基本

15、流程是: 先作 分析, 然后把 SCA R RA PD RA PD 目标的 片段回收、克隆和测序, 再根据该序列设计特定引物, 此引物通常包含有原来的 引 RA PD RA PD 9 物序列, 多为 20, 24 , 再用该引物对所研究的基因组 进行 扩增, 这样就可以把与原来 bp DN A PCR 的 片段相对应的单一位点鉴定出来。该标记为共显性遗传。由于 标记使用的引物长, 因而 RA PD SCA R 实验的可重复性高, 因此比 和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好。RA PD ()6 2单链构象多态性 , SSC P S in g leS t ran d Co n f

16、o rm a t io n Po lym o rp h ism 技术的基本原理是根据双链 经变性处理后, 进行非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 由于SSC P DN A 可形成二级结构, DN A 分子在凝胶中的迁移率与其分子量和空间构型有关, 在非变性胶中, 单链 DN A 而这种二级结构与单链 DN A 的序列有关, 且单链 DN A 的迁移率受到其二级结构的影响。 因此通过电 10 泳, 不同的单链 被分离, 单链 在凝胶中的位置差异反映了 序列的差异, 所以 DN A DN A DN A SSC P可以检测到点突变和多态性位点。1993 年日本学者 建立了 技术。 它是将 和 技术相结合,

17、 对 - T ak ao Sek iya PCR SSC P PCR SSC P 产物中的 片段中的点突变进行检测, 它是用一对引物对基因组 进行扩增, 对 产 PCR DN A DN A PCR 物变性后, 通过聚丙烯酰胺凝胶分离, 来检测有无单链点突变。 该技术在癌症和遗传性疾病的突变位点 11 的检测中发挥了重要作用。 ()7 2单核苷酸多态性 , SN P S in g leN u c leo t ide Po lym o rp h ism 同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异, 因此从分子水帄上对单个核苷 片段的序列变化, 只能逐个克隆进行序列分析, 费时 酸的差

18、异进行检测具有重要意义。 过去检测 DN A 费力。 随着计算机和 DN A 芯片技术引入分子生物学领域, 研究者可同时对成千上万个克隆测序, 用计 算机分析数据和显示最终结果。1998 年科学家建立了 技术, 目的是检测人类基因组中单个核苷酸 SN P 的改变。利用 制作的人类遗传图被称为人的第三代遗传图。作为一种新的遗传标记, 几乎完 SN P SN P 全建立在 芯片技术的基础上。DN A 分子标记作为新的遗传标记, 具有比形态标记、细胞标记和同工酶标记显著的优点, 因此自分子标记诞生短短十几年的时间, 已发展了许多种分子标记技术, 尽管分子标记有许多优势, 但目前发现的任 何一种分子标

19、记均不能满足作为理想的遗传标记的所有要求。上述列举的几种分子标记各有优缺点, 应 用中应根据研究的需要及实验条件选择相应的标记技术。 参 考 文 献: () 1 贾继增. 分子标记种质资源鉴定和分子标记育种 J . 中国农业科学, 1996, 29 4: 1, 10 2 B row n W M . M ech an ism o f evo lu t io n in an im a l m ito cho nd r ia l DN A J . A nn N. Y. A cad. Sc i, 1981, 361: 119, 134 () 3 邓务国. 物种遗传多态性研究方法的发展. 生物学通报,

20、1994, 29 1: 7, 9J () 4 王文, 等. 银额果蝇自然群体中的 多态性研究 . 遗传学报, 1994, 21 4: 263, 274m t DN A J , . . 5 W illiam s J G K e t a lDN A po lym o rp h ism s am p lif ied by a rb it ra ry p r im e r s a re u sefu l a s gene t ic m a rk e r s J N u2 () , 6 535, 1990, 18 22: 6 531c le ic A c id s R e sea rch 6 W e l

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22、ro 2 7 . 0534858 , 1993.p ean P a t te rn A pp lica t io n , . . , 1993, 241: 226,W u K Se t a lA bandance po lym o rp h ism and gene t ic m app ing o f m ic ro sa te llite in r ice J M GG 8 235 , . . ,Zh ang Y H ie t a lY ch rom o som e sp ec if ic m a rk e r s and th e evo lu t io n o f d io ecy i

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25、p a r tm en t o f F inh e ry Sc ience, T ian jin A g r icu ltu ra l co llege, T ian jin 300384, C h ina; )2 , 300112, T ian jin In st itu te o f P lan t P ro tec t io n R e sea rch T ian jin C h ina, A bstra c t M o lecu la r m a rk e r s w e re new ly advanced gene t ic m a rk e r s deve lop ed af

26、te r m o rp ho lo gyce ll and iso zym e . , m a rk e r sIn th is p ap e rth e au th e r summ a r ize s th e ba sic p r inc ip le s and ch a rac te r ist ic s o f a few typ e s o f m o lecu la r m a rk2 . , .e r sA t th e sam e t im eth e ir advan tage s and defec t s a re com p a red ; ; Key word s M o lecu la r m a rk e rP r inc ip leC h a rc te r ist ic