piRNA的生物学功能及生源论.docx

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piRNA的生物学功能及生源论

piRNA：

一类新的非编码小RNA

最近，印度科学家SaiLakshmiS及其合作者建立了一个piRNA数据库———piRNABank，以保存新发现的piRNA序列。

piRNABank是一个高度用户友好的资源，它收录了包括人、小鼠和大鼠的近2000万个piRNA相关序列，经过同源序列去除、基因组定位等筛选，最近得到10万多个在基因组中具有唯一靶位点的piRNA序列。

数据库支持物种和染色体方式的多种的搜索方式，包括登录号、染色体定位、基因名或符号，基于同源性的序列检索，簇和相应基因及重复元件。

它也可以在基因组大图谱上显示每个piRNA或piRNA簇。

数据库内的信息也将随着新的研究进行不断更新，果蝇和其它物种的piRNA信息也将会被收录，作者还计划增加一些序列和结构预测的软件，更方便科研人员使用［35］。

6　存在的问题与展望

piRNA的发现为非编码小分子RNA的研究开辟了一个新领域，被Science评为2006年十大科技进展之一［36］。

到目前为止，piRNA的研究已经取得了阶段性的成果，但要预测piRNA在生物医学上的应用还为时过早。

其中仍然有许多问题需要进一步研讨，如piRNA的序列在不同物种中的同源保守性还不好分析；在piRNA生源论中，仍旧不知道3′端的分裂机制和piRNA扩增循环是如何调节的。

另一个尚未解决的问题是piRNA在特异位点表达的结果所产生的功能以及piRNA3′端甲基化的机制还没有弄清楚。

piRNA和Piwi蛋白在后生调控中起的作用很可能大于转座子沉默的作用，目前，本实验室正研究非生殖器官Piwi蛋白高表达组织中，piRNA的克隆及调控作用，但尚未取得有意义的进展。

因此，piRNA的研究不仅可以丰富小分子RNA的研究内容，同时，也有利于我们进一步了解生物配子发生的分子调控及其机理，具有十分重要的理论价值和应用前景。

1piRNA的生物学功能

　　目前的研究表明,piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中，通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物（piRC）来调控基因沉默途径。

对Piwi亚家族蛋白的遗传分析以及piRNA积累的时间特性研究发现，piRC在配子发生过程中起着十分重要的作用。

经过研究人员分析发现，只有17%--20%的哺乳动物piRNA对应于标记的重复序列，包括转座子和逆转录转座子。

因此，piRNA从后生程序化和抑制转录到转录后调控可能会有不同的功能。

根据Piwi蛋白已知的功能推测piRNA的功能可能有3个方面。

（1）沉默转录基因过程

　　在果蝇中的研究已经表明Piwi和rasiRNA的作用是沉默重复元件。

在裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）中，小RNA和RNAi途径涉及到了转录基因沉默（TGS）。

在研究哺乳动物中TGS的因子时，纯化得到了一个包含小RNA和Riwi的复合物（与人类Piwi同源），该复合物称为piRNA复合物。

它的制备物中包含rRecQ1，与脉孢菌（Neurospora）qde-3基因的表达蛋白同源，而该基因参与沉默途径。

因此推断，哺乳动物的piRNA可能在TGS中起作用。

　　在果蝇中，一个as-yet-uncloned异染色质基因的功能性等位基因flamenco能抑制内源性逆转录酶病毒gypsy。

Piwi突变体，是已经知道的影响RNA介导的同源决定的转基因沉默，也说明了在限制性的雌性生殖腺中阻断gypsy的抑制作用。

因此，推断piRNA的功能和Piwi蛋白密切相关，具有Piwi依赖性。

最近又发现，在flamenco敲除突变体中成熟piRNA的表达水平大量地减少，而在Piwi敲除突变体中gypsyRNA的表达水平却增加了150倍，这些结果说明Piwi蛋白结合的piRNA的功能是维持转座子沉默。

　　最近，在另一项研究中发现了果蝇中存在的一种Aub-associate-piRNA的沉默机制。

Aub突变体导致了卵巢和睾丸中的逆转录转座子的积累，以及睾丸中的Stellate转录物的积累。

在卵巢中Aub-associate-piRNA来源于包括逆转录转座子在内的基因间的重复元件。

而在睾丸中的Aub也联合着不同的piRNA。

大多数piRNA与Stellate抑制基因转录本的反义链对应，Stellate是已知的关于基因沉默的基因，另一个富含的种类是由来自X染色体和与vasa转录本高度互补的序列组成。

这是首次以生物化学的观点提出了由Aub和piRNA介导的沉默机制。

（2）维持生殖系和干细胞功能

　　Piwi是一个表观遗传调控因子，起着调节生殖干细胞维持的作用。

Polycombgroup（PcG）蛋白可以维持关键的发育调节因子。

在果蝇中，PcG与PcG反应元件（PREs）结合沉默持家基因。

在果蝇基因组中，Piwi与PcG蛋白体共定位簇集成PcG反应序列。

这样，一些Piwi有关的piRNA可能与表观遗传调控有关。

研究人员在果蝇中检测了关于RNA积聚而假定的RNA沉默机制的效果。

这些积聚的RNA包括不同的gypsy序列并报道了沉默的效果确实是与存在于卵巢中25～30nt长度的有义RNA的数量有关。

实验结果发现rasiRNA对gypsy转录本的有义链有下调作用，而且，在雄性生殖系中，Piwi蛋白能够阻止逆转录转座子的转录。

这样证据表明一些piRNA可能与后生调控有关。

　　Piwi亚家族主要有3个成员，分别是MIWI，MILI和MIWI2，是生殖系细胞中的特异性蛋白，与精子的发生有非常密切的关系，敲除Miwi，Mili或Miwi2基因，都会造成小鼠精子产生明显缺陷，表现为雄性不育。

MILI在早期的精子发生时表达，即从精原细胞的有丝分裂到精母细胞的粗线期，缺失MILI的小鼠则停止在粗线期;MIWI的表达则要晚一些，从粗线期到球形精细胞期，基因敲除的MIWI会导致精子发生停止在球形精细胞期。

而基因敲除的MIWI2的小鼠在减数分裂早期有减数分裂进展的缺陷，并且生殖细胞随着龄期有显著的损失。

MIWI2突变体中生殖细胞表型的损失，和果蝇中Piwi突变体一样，证明了小鼠中的MIWI2和果蝇中的Piwi在维持生殖系和干细胞时起着类似的作用。

　尽管piRNA的具体功能还未完全弄清，但是生殖细胞中的piRNA富集现象和Miwi突变种的雄性不育表明了piRNA在配子发育的过程中起重要作用，并且可能参与配子发生过程中基因表达模式及染色体组结构的调节。

（3）调节翻译和mRNA的稳定性

　　最初，Wilson等在果蝇胚胎发育时发现aub在osker翻译时有很重要的作用。

尽管aub突变体似乎没影响oskermRNA或Osker蛋白的稳定性，但在这突变体中Osker蛋白表达量却明显地减少了。

Megosh等对果蝇中的Piwi蛋白研究发现，Piwi的减少不能影响Osk和Vasa蛋白的表达但能导致极质维持和原始生殖细胞（PGS）形成的失败，而增加Piwi蛋白的表达量能提高Osk和Vasa蛋白的水平，也相应成比例地提高PGS的数量。

由此推断，Piwi和Aub在果蝇胚胎发育时的翻译可能具有正调节作用。

同样Miwi也可能促进睾丸中精子形成时一种主要调节子（CREM）的稳定性和目标mRNA翻译的稳定性。

2piRNA的生源论

　　piRNA发现后，这类小RNA的来源一直是研究人员的研究重点之一。

piRNA簇的链的强偏向性说明了它们可能产生于单链的前体，为了支持这个观点，EST分析和RT-PCR实验都显示了假定的初始转录本，但是在反义转录本中却未检测到。

与miRNA前体不同，覆盖有piRNA克隆的区域没有折叠入茎环结构。

因此，piRNA的生物发生途径明显不同于miRNA和siRNA。

尽管之前的研究表明人类的Piwi蛋白能够与Dicer酶相互作用，但并没有确定piRNA生物发生过程中是否与RNAaseIII如Dicer和Drosha有关。

　　为检测Dicer酶的必备条件，研究人员将携带有纯合子dicer突变体的生殖细胞放在dicer野生型细胞的周围。

然后，从这些动物精巢中分离纯化发现了标准水平的piRNA，这强有力地说明了piRNA的生物发生是与Dicer无关的。

　　于是，研究人员提出了几种可能的piRNA生源论机制:

（1）长距离dsRNA结构可能形成了前转录物，它能够解释piRNA链的偏向性;

（2）反义转录物可能以很低的水平表达来避免检测;（3）前转录物可能由ssRNA-directed未识别的酶消化;（4）piRNA可能来源于由逆转录转座子的逆转录酶产生的RNA-DNA双链体。

　最近，在果蝇和斑马鱼的研究中提出了Piwi蛋白作用的piRNA的生源论机制。

Gunawardane等在果蝇卵巢中免疫纯化了Aub和Ago3，并且分析了结合有不同Piwi蛋白的小RNA的序列。

发现Piwi关联的RNA与果蝇基因组中缺失的转座子元件相对应。

他们预测了与siRNA或miRNA相似的加工机制，首先在piRNA的两条链的3′端由RNaseIII产生的2nt的悬突，即piRNA的两条链在5′端的23nt处切割（假定piRNA的平均长度为25nt）。

他们绘出了piRNA5′端和5′近邻端的反义链的距离，根据预测的23nt的峰值处，发现piRNA5′端的互补链经常是在10nt处切割的，还发现piRNA在Ago3和Aub复合体中有很强的互补关系。

在piRNA两条链中的10nt的重叠促使了Piwi蛋白在piRNA的生物发生中起作用的假说。

因此，提出了一个ping-pong模型（图1）:

一个反义piRNA，衍生于络合有Aub或Piwi的piRNA基因座，能识别和分离有义链的转座子转录物。

这个分离事件发生在反义piRNA相对的10～11nt的位置，从原初piRNA末端的相反链上，产生了一个距5′端长度为10nt的片段。

分离的产物将装载入第二种Piwi蛋白家族，根据观测链的偏向性很可能是Ago3，与Ago3相关的piRNA在位置10处有很高的腺嘌呤百分比例。

最终，经3′端未知的机制加工后成为新的piRNA。

　　Houwing等在研究斑马鱼中的piRNA时发现，piRNA簇集与所有的GypsyDR1和GypsyDR2的位点有义链匹配，也是缺少U的偏向性。

相反，如前面所述，在10nt位置富含A。

这说明了进化的保守不仅是piRNA生物发生的策略，还是转座子调控的一种生物化学途径。

　　先前的文献表明哺乳动物的piRNA在3′端的2′-O甲基化。

piRNA的生物合成机制和修饰功能仍旧不清楚。

Kirino等报道了植物miRNA2′-O-甲基转移酶HEN1在小鼠中的同源蛋白mHEN1，它在体外培养的睾丸中特异性表达并且使piRNA的3′端发生了甲基化，而HEN1在果蝇中的同源蛋白Pimet则介导了piRNA3′端的2′-O-甲基化作用。

Iguchi等在研究小鼠中的两种蛋白（MSY2和Translin）时发现，包含有Nct1和Nct2的一段序列与piRNAs的序列相同，并检测到它们主要存在于精母细胞的粗线期。

此外，还发现在精子发生进行时，单一拷贝的piRNAs，gsRNA10（其序列与在Nct1的29nt相同）的增加伴随着Nct1和Nct2的减少，因此提出了Nct1和Nct2是piRNA前体的一部分。

这些结果对piRNA的生源论研究提供了很好的理论基础。

3piRNA的生物信息学研究

最近，印度科学家SaiLakshmiS及其合作者建立了一个piRNA数据库———piRNABank，以保存新发现的piRNA序列。

piRNABank是一个高度用户友好的资源，它收录了包括人、小鼠和大鼠的近2000万个piRNA相关序列，经过同源序列去除、基因组定位等筛选，最近得到10万多个在基因组中具有唯一靶位点的piRNA序列。

数据库支持物种和染色体方式的多种的搜索方式，包括登录号、染色体定位、基因名或符号，基于同源性的序列检索，簇和相应基因及重复元件。

它也可以在基因组大图谱上显示每个piRNA或piRNA簇。

数据库内的信息也将随着新的研究进行不断更新，果蝇和其它物种的piRNA信息也将会被收录，作者还计划增加一些序列和结构预测的软件，更方便科研人员使用。

4存在的问题与展望

　　piRNA的发现为非编码小分子RNA的研究开辟了一个新领域，被Science评为2006年十大科技进展之一。

到目前为止，piRNA的研究已经取得了阶段性的成果，但要预测piRNA在生物医学上的应用还为时过早。

其中仍然有许多问题需要进一步研讨，如piRNA的序列在不同物种中的同源保守性还不好分析;在piRNA生源论中，仍旧不知道3′端的分裂机制和piRNA扩增循环是如何调节的。

另一个尚未解决的问题是piRNA在特异位点表达的结果所产生的功能以及piRNA3′端甲基化的机制还没有弄清楚。

piRNA和Piwi蛋白在后生调控中起的作用很可能大于转座子沉默的作用，目前，本实验室正研究非生殖器官Piwi蛋白高表达组织中，piRNA的克隆及调控作用，但尚未取得有意义的进展。

因此，piRNA的研究不仅可以丰富小分子RNA的研究内容，同时，也有利于我们进一步了解生物配子发生的分子调控及其机理，具有十分重要的理论价值和应用前景。

科学家在老鼠睾丸中发现了一类全新的ＲＮＡ（核糖核酸），这一发现进一步拓宽了ＲＮＡ的研究范围。

        据英国《自然》杂志网络版报道，美国冷泉港实验室的格雷格·汉农等科学家在对老鼠睾丸中的所有ＲＮＡ编目时，新发现这类ＲＮＡ。

科学家说，这类ＲＮＡ比已发现的其他小ＲＮＡ，如微ＲＮＡ和短干涉ＲＮＡ等都要稍长。

        科学家对从老鼠睾丸中提取出的ＰＩＷＩ蛋白质进行了分析，结果发现这种蛋白质上附着了新发现的ＲＮＡ。

他们将这类新ＲＮＡ命名为“ＰＩＷＩ互动ＲＮＡ”（简称ｐｉＲＮＡｓ）。

ＰＩＷＩ蛋白质通常在睾丸中得到表达，如果这种蛋白质不起作用，老鼠将无法产生正常的精子。

        科学家们正在试图弄清这类新ＲＮＡ的确切作用。

研究显示，斑马鱼、苍蝇体内以及人类睾丸中都存在类似的ＲＮＡ。

由于老鼠需要ｐｉＲＮＡｓ和ＰＩＷＩ蛋白质来制造精子，科学家推测，ｐｉＲＮＡｓ和ＰＩＷＩ蛋白质能控制导致精子生成的一些重大变化，如减数分裂过程中使遗传物质减半的细胞分裂。

        虽然目前还没有任何证据支持上述猜想，但研究人员指出，新型ＲＮＡ的发现拓宽了ＲＮＡ研究的领域。

两研究小组掀起小分子RNA研究新浪潮  

        来自冷泉港实验室（Cold  Spring  Harbor  Laboratory）的Gregory  Hannon研究小组和纽约洛克菲勒大学（Rockefeller  University  in  New  York）的Thomas  Tuschl研究小组的研究人员发现了数千种不同的哺乳动物小分子RNA的一个新成员——piRNAs（Piwi-interacting），该种小RNA在小鼠精子发育中普遍存在，并起到了重要作用。

这一研究成果公布在6月4日的《Nature》网络版。

        两个小组发现大概90%的piRNA序列以尿嘧啶开始，与其它的小RNA分子的特点一样。

Hannon和他的同事们在小鼠睾丸中发现了52,934种候选piRNAs，在人类中发现了52,099种，而在老鼠中发现了47,024种。

在这些物种中，大部分piRNAs成簇形成相对少量的基因座（loci），小鼠中大约形成100个主要的基因簇。

这种成簇现象表明大量的piRNA由长距离转录加工而成。

        与microRNAs和siRNAs不一样，piRNAs来源于单链RNA前体（precursor）而不是双链RNA前体。

Tuschl和他的同事们认为，与近亲老鼠的基因组比较，小鼠的piRNA序列保守性良好，但是与遗传距离较远的物种相比，保守性较差。

尽管如此，大部分小鼠的piRNA簇能在人和老鼠染色体上相同的位置找到。

“它们就好象是染色体上某类基因的划分地界线。

这强有力的说明它们可能与染色体生物学有关。

”Hannon说。

        PiRNAs在人内出现的丰度比小鼠小，假设piRNAs的功能是识别互补的信使RNA，也许人的RNA结合蛋白则代替了一些piRNAs的功能。

RNA结合蛋白是人类基因组中最大种类的蛋白之一。

两个研究小组利用northern  blotting分析发现piRNAs出现在小鼠的精子细胞中，尤其是在减数分离开始时大量积聚，在成熟的精子产物中消失。

“我们仅能在人类和小鼠的睾丸中发现piRNAs，它们也许在卵子的发育过程中也有表达，”Tuschl说。

        “在精子细胞的减数分裂结束前，我们发现了基因转录的爆发，而在基因转录爆发前有巨大的、迅速的piRNAs最终爆发。

”  

        来自底特律韦恩州立大学的Stephen  Krawetz说。

“有趣的是会看到piRNAs是否参与转录的调节或者RNA的存储。

”  

        将来的实验应该研究什么样的蛋白与Piwi-linked核蛋白复合体相联系，来弄明白piRNAs怎样与已知的过程联系，或者研究者们也想知道在Piwi基因敲除的动物中的piRNA表达情况。

                （生物通：

亚历）  

        来自冷泉港实验室（Cold  Spring  Harbor  Laboratory）的Gregory  Hannon研究小组和纽约洛克菲勒大学（Rockefeller  University  in  New  York）的Thomas  Tuschl研究小组的研究人员发现了数千种不同的哺乳动物小分子RNA的一个新成员——piRNAs（Piwi-interacting），该种小RNA在小鼠精子发育中普遍存在，并起到了重要作用。

这一研究成果公布在6月4日的《Nature》网络版。

        自2000年RNA研究进展被Science杂志评为年度重大科技突破之后，2001年的RNAi，2002年的“Small  RNA  &  RNAi”，以及2003年的小核糖核酸都相继在重大科技成就上榜上有名。

RNA研究风声水起，就连在DNA的传递遗传物质和蛋白的执行功能这些“专长”方面也发现是由RNA最初具有的。

        piRNA，即Piwi-interacting  nucleotides，在之前的发育精子研究中就发现其对于合子的形成的复杂过程中势必可少的，但是它们的功能和起源仍然是不清楚的，洛克菲勒大学的Tuschl认为“如果piRNAs研究趋势与microRNAs相似的话，那么生物界将会由这些从事piRNA未知领域研究的科学家们带来一股研究新浪潮。

”  

        研究人员主要的研究对象是来自无脊椎动物和小鼠中研究精子细胞发育过程中起重要作用的Piwi蛋白——这些蛋白分子组成了Argonaute家族蛋白的一个结构域，microRNA靶向Argonaute蛋白标志来使基因沉默。

        两个研究小组都分别对能与小鼠睾丸组织包含Piwi蛋白的核蛋白复合体免疫共沉的RNA进行了纯化、克隆和测序。

其中Tuschl和他的同事们的实验利用了Piwi蛋白的同源蛋白MILI蛋白，而冷泉港实验室的Gregory  Hannon则利用MIWI进行实验。

结果两个研究小组都在他们的免疫共沉淀试验中发现了21-23核苷酸长度的RNA分子。

Hannon小组的Northern印迹分析显示这些单链RNA与Piwi相连，而不是与其它Argonaute蛋白相连。

两个研究小组将这些RNA称作Piwi-interacting  nucleotides或者piRNA，并且发现与MIWI相比，MILI与稍微小一点的piRNA相结合。

  （生物通：

亚历）

发现新一类基因沉默的小RNA—piRNA

[DavidTowersimper评论:

本文来自于06年06月15日的《Science》杂志的网络版Sciencexpress上，中文翻译由DavidTowersimper完成，转载时请标明"DavidTowersimper翻译"字样。

]

     非编码性的小RNA调节着一些对细胞生长和发育必需的过程，包括mRNA降解，翻译抑制，转录阶段基因沉默（transcriptionalgenesilencing,TGS）。

在哺乳动物中寻找造成TGS的因子过程里，作者纯化出一个含有小RNA和Riwi（老鼠中的人类Piwi的同源物）。

这些RNA，长度通常在29-30nt，被称为与Piwi相互作用作用的piRNA复合物的（piRC）制备物中含有rRecQ1，其中rRecQ1是脉孢菌（Neurospora）qde-3基因表达蛋白的同源物，该基因参与沉默途径。

Piwi在苍蝇里就已与TGS在遗传上联系起来，也与纯化的piRNA复合物的具有切割活性的共分级分离（cofractionate）物联系。

这些结果就与piRC中存在着一个基因沉默作用相一致。

该研究成果已经发表在06年06月15日的《Science》杂志的网络版Sciencexpress上。

     小RNA指导的基因沉默途径或在转录阶段上发挥作用，或在转录后阶段上发挥作用。

转录后基因沉默通过mRNA去稳定化或者mRNA翻译抑制起作用，而转录阶段基因沉默则是通过改变染色质构象抑制基因表达。

这两个途径均利用一个核心复合物，该复合物含有小RNA和Ago（Argonaute）蛋白家族的一个成员。

然而，它们之间不同的机制也意味着复合物的组成上也有差别。

小RNA介导的TGS虽然在裂变酵母和其他真核生物中已被研究，但是在哺乳动物中这个过程的机制仍然有待阐述。

     通过将制备的老鼠睾丸粗提物进行离子交换Q柱分离，分成流出物和洗脱物两部分，同时监控小RNA，构建cDNA文库后进行测序，发现流出物中的RNA主要是microRNA（miRNA），洗脱物中的RNA（69%）主要是从那些平常被认为不能表达的基因组区域获得的，长度大多在25-31nt，而且Northern印迹分析也显示出一个睾丸特异性的特征。

大多数的洗脱物中RNA5’端大多以尿苷开始（约84%），但没有特征性序列或基序被检测到。

而且，在洗脱物中RNA观察到一个明显的亚群体（subpopulation）长度在29-30nt，然而它们与洗脱物中的其他的RNA无论是在5’核苷，基因组上的位点，还是注释上都不能去区别开来。

因此，所有洗脱出的RNA不能与已经注释的非编码性的RNA（miRNA,tRNA,rRNA,snRNA）匹配，而一起被认为代表着新鉴定出的一类小RNA。

      随后又通过五步的实验程序纯化与这类小RNA作用的蛋白，质谱结果鉴定出老鼠中存在人类Piwi和RecQ1蛋白的同源物（分别称为Riwi和rRecQ1）。

Western印迹结果也证实Riwi和rRecQ1与这些小RNA共纯化。

因此，作者将这类小RNA命名为与Piwi相互作用的RNA（piRNA），并将与老鼠Piwi同源物一起形成的复合物称为piRNA复合物。

      已知的起沉默作用的RNA（siRNA,miRNA）起源于双链RNA前体物或者呈折叠结构的RNA。

不同于miRNA和siRNA，piRNA中的94％能对应到基因组中100个确定的区域（每个区域长度小于100kb）。

在在这些区域里，piRNA通常只沿着基因组的一条链分布，或有时不规则地分布在两条链上，但是相互分开，而不重叠在一起，但是都没有证据表明piRNA起源于折叠的结构或双链RNA。

piRNA在基因组上的位点分析表明大约2/3的piRNA序列中的每个都完美地匹配单个位点，不过也一些情况下也单个位