微生物实验教学.docx

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微生物实验教学

微生物实验教学

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实验一培养基的制备

一、实验教学目标基本与要求

1、明确培养基的配制原理。

2、掌握配制培养基的一般方法和步骤。

二、实验内容

1、介绍培养基的配制原理和方法步骤

2、动手称量试剂、配制牛肉蛋白胨培养基

三、培养基的制备过程

称量--配置--调节pH值--过滤--分装--灭菌

1.称量

按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。

对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。

2.配调

向上述烧杯中加入所需要的水量（可视情况不同，一次或多次加入水），搅拌，使其溶解（可加热助溶）。

如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

待完全熔化后，补足所失水分。

如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。

3.调节pH值

一般做法是：

培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。

培养基配方为自然pH时，不用调节。

4.过滤

用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。

5.分装

将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。

固体培养基要趁热装。

分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。

分装量可分为下面几方面：

（1）斜面：

装量为管长的1/4-1/5。

（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：

装载量不超过管长的1/3。

（3）三角瓶：

装量不超过容积1/2。

6.灭菌

塞棉塞，包扎，灭菌。

高压蒸汽灭菌法：

是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度。

四、实验报告

记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。

五、问题和思考

l．配制培养基有哪几个步骤?

在操作过程中应注意些什么问题?

为什么?

2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?

若不能及时灭菌应如何处理?

已灭菌的培养基如何进行无菌检查?

3．试设计实验对饮料进行无菌检查。

实验二消毒与灭菌

一、实验教学目标与基本要求

了解消毒和灭菌的原理，掌握各种灭菌方法的操作步骤。

二、器材和试剂

培养皿、试管、吸管、电烘箱、牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（6套一包），手提式高压蒸气灭菌锅、培养基牛肉膏蛋白胨平板、紫外线灯等。

溶液或试剂3%~5%石炭酸或2%~3%来苏尔溶液等。

三、实验内容：

1．干热灭菌法

2．高压蒸汽灭菌

3．紫外线灭菌法

四、实验步骤

（一）干热灭菌法

1、基本原理

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

2、操作步骤

（1）装入待灭菌物品

将包好的待灭菌物品（培养皿、试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。

物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。

（2）升温

接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。

当温度升至100℃时，关闭排气孔。

在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温，此时如果还未达到所需的160—170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。

（3）恒温

当温度升达到160～170℃时，恒温调节器会自动控制调节温度，保持此温度2h。

干热火菌过程。

严防恒温调节的自动控制失灵而造成安全事故。

（4）降温

切断电源、自然降温。

（5）开箱取物

待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。

电烘箱内温度末降到70℃，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

3、思考题：

（l）在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么?

（2）为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长?

请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。

（二）、高压蒸气灭菌

1、基本原理

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。

待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。

导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。

其原因有三：

一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表2-1），二是湿热的穿透力比干热大（表2-2），三是湿热的蒸气有潜热存在。

1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ（千焦）的热量。

这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。

在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。

一般培养基用0.1Mpa（相当于15Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃,15～30min

2、操作步骤

（1）首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。

切勿忘记加水，同时水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

（2）放回内层锅，并装入待灭菌物品。

注意不要装得太挤，以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。

三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。

（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。

再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升。

当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。

本实验用0.1Mpa，121.5℃，20min灭菌。

灭菌的主要因素是温度而不是压力。

因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。

（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。

否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。

（6）将取出的灭菌培养基，需摆斜面的则摆成斜面，然后放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。

3、实验报告

（l）结果

检查培养基灭菌是否彻底。

4、思考题

（1）高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?

灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？

（2）在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素?

（3）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?

（4）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强?

为什么?

（三）紫外线灭菌

1、基本原理

紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。

波长为200~300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。

在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。

紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。

另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。

O3和H2O2均有杀菌作用。

紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。

紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。

此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前；可在无菌室内（或接种箱内）喷洒3%～5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。

无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。

2、操作步骤

（l）单用紫外线照射

a在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。

b将牛肉膏蛋白胨平板盖打开15min，然后盖上皿盖。

置37℃培养24h。

共做三套。

c检查每个平板上生长的菌落数。

如果不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。

（2）化学消毒剂与紫外线照射结合使用

a在无菌室内，先喷洒3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15imn。

b无菌室内的桌面，凳子用2%～3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。

c检查灭菌效果:

方法同“单用紫外线照射”。

因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光下工作。

3、实验报告

（1）结果

记录两种灭菌效果于下表中:

处理方法平板菌落数123灭菌效果比较紫外线照射3%-5%石炭酸+紫外线照射2%-3%来苏尔+紫外线照射

4、思考题：

（1）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线和的抵抗力会一样吗，为什么？

（2）你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的？

为什么不用普通灯用玻璃？

（3）在紫外灯下观察实验结果时，为什么要隔一块普通玻璃？

（四）微孔滤膜过滤除菌

1、基本原理

过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。

根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。

微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。

根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。

此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。

2、器材与药品

（1）培养基2%的葡萄糖溶液，肉汤蛋白胨平板。

（2）仪器或其他用具注射器，微孔滤膜过滤器，0.22μm滤膜，无菌试管，镊子，玻璃刮棒。

3、操作步骤

（l）组装、灭菌

将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装灭菌后待用（0.lMPa，121.5℃灭菌20min）。

（2）连接

将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（2%葡萄糖溶液）的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。

见图2-3。

（3）压滤

将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拨出。

压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过淀胶．

（4）无菌检查

无菌操作吸取除菌滤液0.1ml于肉汤蛋白胨平板上，涂布均匀，置37℃温室中培养24h，检查是否有菌生长。

（5）清洗

弃去塑料滤器上的微孔滤膜，将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜，组装包扎，再经无菌后使用。

整个过程应在无菌条件下严格无菌操作，以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗漏现象。

4、实验报告

（l）结果

记录无菌检查结果

5、思考题

（1）你做的过滤除菌实验效果如何?

如果经培养检查有杂菌生长，你认为是什么原因造成的?

（2）如果你需要配制一种含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基，其抗生素的终浓度（或工作浓度）为50μg/ml，你将如何操作?

（3）过滤除菌应注意哪些问题?

实验三土壤中微生物的稀释分离、纯化

一、教学目标与基本要求：

1、掌握倒平板的技术和分离纯化微生物的基本操作技术。

2、设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。

二、实验内容：

1．用稀释法从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。

2．用平板划线法分离纯化微生物。

三、实验步骤

（一）微生物分离的方法有很多种，但常用的有两种：

1.平板划线分离法

1）倒制平板：

将固体培养基熔化，冷却至50-55℃，以无菌操作将培养基注入培养皿内，约15ml，轻微转动培养基，使培养基均匀分布，然后静置于水平位置，凝固即成平板，并在皿该边贴上标签。

2）在平板培养基上划“Z”线。

2.稀释平板分离法

稀释手段，使样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿内，倒入培养基，摇匀静置凝固后培养，这样被分离的细菌被固定在原处而形成菌落，可作为一种记数方法。

1）制备土壤稀释液：

（细菌的分离）以无菌操作，称取样品10g，加入装有90ml无菌水的锥形瓶中，振荡10-20分钟，使土样与水充分混合，即成10-2土壤稀释液，然后用无菌移液管吸取9ml无菌水的试管内，制成10-3的稀释液将此移液管在试管内反复吸冲三次，然后取出移液管，并将其通过火焰，再插入原来包移液管的纸套内，以备再用，振荡10-3的稀释液试管，再从纸套取出原来的移液管插入已混匀的试管内，再吹洗三次，然后吸出1ml10-3的稀释液至另一支装有9ml无菌水的试管中，制成10-4稀释液。

用同样方法再制成10-5、10-6的稀释液，稀释完毕后，可用原来的移液管，从菌液浓度最小的10-6的稀释液开始吸取1ml10-6稀释液，加到相应编号10-6的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取1ml10-5、10-4的稀释液加到相应编号为10-5、10-4的无菌培养皿内，整个分离过程见下图。

2）平板的制作：

将固体培养基融化，待冷却至45-50℃左右，分别倾入到已盛有10-4、10-5、10-6稀释液的无菌培养皿内，迅速轻轻摇匀，静置凝固。

凝固后将平板倒置于30℃恒温箱中，培养24-48小时，细菌即在所固定的位置长成肉眼能见的菌落。

实验四微生物接种技术

一、教学目标与基本要求：

1、学习斜面接种、穿刺接种、平板接种、液体接种等接种方法。

二、实验内容

（一）接种方法

将有菌的材料或纯粹的菌种转移到另一无菌的培养基上，这个过程就称为接种。

微生物的接种方法，因使用不同的容器，不同的培养基以及不同的培养方法二有所不同，常用的几种方法如下：

1.斜面接种：

从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。

左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。

用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面话曲线或直线，勿使菌体沾污管壁，灼烧试管口，塞回棉塞（不要将试管去迎棉塞以免进入杂菌），灼烧接种环将接种后的斜面拿去培养。

此法用于好气性微生物的接种。

2.液体接种：

由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。

操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。

如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。

3.穿刺接种：

用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。

4.平板接种：

将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：

1）斜面接平板

a.划线法：

见平板划线分离法。

b.点种法：

一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。

2）平板接斜面：

一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。

三、思考题

1.稀释分离时，为何要将融化的培养基冷却到50℃左右，才倒入装有菌液的培养皿内？

2.接种时，为何要尽量使试管平放？

3.根据哪些菌落特征可区分细菌、放线菌、霉菌？

实验五显微镜油系物镜的使用

一、实验目与基本要求：

复习显微镜底倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握其使用方法。

二、实验内容：

1．学习油浸系物镜的使用方法。

2．用油浸系物镜观察枯划芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色装片。

三、显微镜的构造

1、目镜：

将被物镜放大了的实象进一步放大。

标配为5X、10X、16X，倍数越低镜头越长。

2、物镜：

是决定显微镜性能最重要的部件，3-4个。

10X以下为低倍镜，40-60X为高倍镜，90X以上为油镜。

放大倍数越低，物镜头越短，透镜直径越大-视野大。

3、集光器：

调整适宜的光度。

4、反光镜：

（有两面）可在水平与垂直两个方向上调动对准光源；平面镜：

反光较弱，室内光线强时用；凹面镜：

能汇聚光线，室内光线弱时用

5、镜座：

镜底部。

6、镜柱、镜臂和倾斜关节。

7、载物台（镜台）：

方型，中间有椭圆形通光孔，台上有十字推进器用于固定和移动玻片标本。

8、镜筒：

长为160CM，连接目镜和物镜。

9、物镜转换器：

上有3-4个物镜螺旋口。

10、调节器（调焦装置）：

粗调节器：

1圈升降10MM；细调节器：

1圈升降0.1MM。

注意：

搬动显微镜时，一般以右手握镜臂，左手托牢镜座，保持镜体直立，轻放于身体左前方，距台沿3-5CM处。

四、显微镜的成像原理

平行光线通过集光器透射过被检物体进入物镜，被检物体经过物镜与目镜连续两次放大，在人眼视网膜上形成倒置放大的实像。

在移动玻片标本时需注意：

观察到的物像与实际移动方向相反。

如：

在视野上方的物像，实际上是在玻片标本的下方，要把它移向视野中央，应将玻片标本向上方移动；同理，视野左侧的物像实际在玻片标本的右方，要将它移向视野中央，应将玻片标本向左侧移动。

明视距离：

要看清显微镜中的物像，必须有个最适宜的距离，这个距离叫做明视距离。

即眼球到放大虚像之间的距离，一般为25CM

五、显微镜的使用

1、环境要求：

室内宽阔而清洁；地基坚固无震动；很少潮气与尘埃；试剂没有腐蚀性。

2、光源：

可用荧光灯或自然光作为光源，避免直射日光。

3、低倍镜的使用

（1）调整光源：

将反光镜对准光源，上升集光器，打开虹彩光圈，使光量适宜（一般使用低倍镜时，光线宜暗一些）。

（2）放置玻片标本（从侧面观察）

（3）转换低倍物镜头（从侧面观察）

（4）调整物、镜距离（从侧面观察）

（5）通过目镜观看标本，调焦（先粗后细）至物像最清晰。

注意：

、转动调节器时必须缓缓转动，否则会逐步导致载物台自行下滑。

观察时必须双眼同时睁开，左眼观察，右眼绘图。

4、高倍镜的使用

低倍镜下找到目的物，移向视野中央，转换高倍镜，细调焦至清晰。

5、油镜的使用

（1）先用低倍镜找到欲观察的物体，再换至高倍镜，将目的物置于视野中央，并使集光器所收集的光量最大。

（2）将载物台下旋，并将香柏油一小滴加于所需观察部分的盖玻片上，降低集光器，把玻片标本翻过来，在与表面油滴相对的地方滴一滴油，再翻过来轻放在镜台中央心，升高集光器，使其上透镜与油滴接触。

（注意：

油滴不可过大，以免损坏玻片标本和镜头）。

（3）从侧面观察，将载物台缓缓升起，使油镜头浸入油滴，靠近盖玻片（极轻微接触，一定要小心，否则会将玻片压碎或损坏镜头）。

然后边观察边用细调节器缓缓向下调整载物台，找到并看清物体。

（4）观察完毕后，将载物台旋下，用擦镜纸擦去镜头上的香柏油、集光器上的香柏油和玻片上的香柏油。

六、显微镜的保养

防尘、防潮、防震、防镜头污染，用毕后按规矩摆放

实验六细菌形态的观察

一、实验目的和要求

目的：

巩固油镜的使用；掌握细菌形态观察的基本方法，了解细菌的基本形态。

内容：

1．观察细菌的基本形态染色装片。

2．观察枯草芽孢杆菌活菌。

3．观察细菌细胞结构的染色装片。

二、实验内容

（一）观察细菌的基本形态

用低倍镜、高倍镜和油镜观察溶血链球菌、棒杆菌、螺菌、浮游球衣菌的染色装片，并分别在油镜下绘图。

（二）观察细菌的细胞结构

用低倍镜、高倍镜和油镜观察巨大芽孢杆菌（示细胞壁）、巨大芽孢杆菌（示异染粒）、苏云金芽孢杆菌（示伴胞晶体）、普通变形菌（示鞭毛）、丙酮丁醇梭菌（示芽孢）、褐球固氮菌（示荚膜）等细菌的染色装片，并分别在油镜下绘图。

（三）观察枯草杆菌活菌，常用压滴法观察。

1．将洁净无油腻的载片放于自己右边前方，在中央放一小滴无菌水。

2．将酒精灯放于自己正前方，点燃。

3．用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体，与载片上的水滴充分混匀，把接种环上残留的菌体杀灭后，放回试管架。

4．用镊子夹一洁净的盖玻片，使其一边先接触菌液，然后将整个盖玻片慢慢放下，注意不要产生气泡。

如菌液过多，可用吸水纸适当吸去一部分。

三、思考题

1．用明视野显微镜观察细菌的形态时，你认为用染色装片好，还是用非染色的活体装片好，为什么?

观察活体装片与染色装片，光线调节各有什么不同?

实验七细菌单染色法及革兰氏染色法

一、实验目的和要求

目的：

1、巩固无菌操作技术，掌握细菌的涂片和单染色技术；

2、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤

二、实验材料和用具

大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylocosccusaureus）的斜面菌种。

苏云金杆菌或金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大肠杆菌（E.coli）菌液，待测菌菌液1～2种吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水；革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等）、香柏油、二甲苯。

显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。

三、实验内容

（一）单染色法

1．涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2（图7-1A、B）。

2．干燥将涂片于室温中自然干燥。

3．固定手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。

在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。

不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。

4．染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。

5．水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图7—1E）。

6．干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体（图7—1F）。

7．待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。

（二）革兰氏染色法

1、制片

（1）涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。

涂菌后将接种环火焰灭菌。

（2）干燥于空气中自然干燥。

亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥（温度不宜过

高）。

（3）固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即

将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。

此制片可用于

染色。

2、染色

（l）初染于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。

（2）媒染滴加卢戈氏碘液，lmin后水洗。

（3）脱色滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止（根据涂片之厚薄需时30s至lmin），水洗。

（4）复染滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。

（5）滤纸吸干，油镜镜检