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wb原理

、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热（以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和1%（w/v）N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

）储于棕色瓶，4℃避光保存。

严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:

10%（w/v）0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:

1.5mmol/LTris-HCL（pH8.8）:

18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后4°C保存。

4、浓缩胶缓冲液:

0.5mmol/LTris-HCL（pH6.8）:

6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。

过滤后4°C保存。

这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

PH太低时，聚合反应受到抑制。

AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。

去离子水配制数ml，临用前配制.

6.10%过硫酸铵溶液：

称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。

7、SDS-PAGE加样缓冲液:

在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

8、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:

30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。

PH8.3

9、转移缓冲液：

2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。

10、丽春红染液储存液：

丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。

使用后应予以废弃。

11、脱脂奶粉5%（w/v）。

12、NaN30.02%叠氮钠（有毒，戴手套操作），溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）。

4.2.4  22.聚丙烯酰胺凝胶溶液：

分离胶12.5%,PH8.85ml10ml15ml

超纯水1.5ml3.0ml4.5ml

30%丙烯酰胺溶液2.1ml4.2ml6.4ml

pH8.8、1.5mol/LTris溶液1.3ml2.6ml3.8ml

10%SDS0.05ml0.1ml0.15ml

TEMED0.002ml0.004ml0.006ml

10%过硫酸铵0.05ml0.1ml0.15ml

浓缩胶：

5%，pH6.8  2ml  4ml  6ml

超纯水  1.4ml  2.8ml  4.1ml

30%丙烯酰胺溶液  0.3ml  0.6ml  1.0ml

pH6.8、1.0mol/LTris溶液  0.25ml  0.5ml  0.75ml

10%SDS  0.02ml  0.04ml  0.06ml

TEMED  0.002ml  0.004ml  0.006ml

10%过硫酸铵  0.02ml  0.04ml  0.06ml

一．配胶

1．  注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

2．  分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:

100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:

100）及TEMED（分离胶用0.4:

1000,15%的可用到0.3:

1000，浓缩胶用0.8：

1000）即可

3．  封胶：

灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。

封胶后切记，勿动。

待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。

4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。

拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。

若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。

30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。

二．样品处理

1．培养的细胞（定性）：

⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loadingbuffer。

⑶100℃，1min。

⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex2~3次。

⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。

若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

⑹待样品恢复到室温后上样。

2．培养的细胞（定量）：

⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。

⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。

⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。

⑷12000g离心，4℃，2min。

⑸取少量上清进行定量。

⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。

3．组织：

⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。

可手动或电动匀浆。

注意尽量保持低温，快速匀浆。

⑵12000g离心，4℃，2min。

⑶取少量上清进行定量。

⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。

三．电泳

1．上样前将胶板下的气泡赶走。

2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积。

2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。

3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。

四．转膜

1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：

湿转使用常规电转液：

Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去离子水至1,000ml。

干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。

浸泡NC膜：

将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。

PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。

将滤纸也浸入转移液中。

2．取胶：

将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。

注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）

3．转膜：

湿转：

电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。

将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。

降温，将电泳槽置于冰水混合物中。

恒流100mA过夜，或400mA，4h。

注意不同蛋白的要求不同。

干转：

用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。

负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。

五．封闭及杂交

1．封闭：

将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。

必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。

2．结合一抗：

一抗的准备：

使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。

反贴法的操作：

含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。

在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。

3．洗涤：

一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

4．结合二抗：

根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:

1000~1:

10000），室温轻摇一小时。

5．洗涤：

二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

六．发光鉴定

一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。

1．HRP-ECL发光法：

将A、B发光液按比例稀释混合。

膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。

取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

2．AP-NBT/BICP显色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。

将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。

七．增强敏感性

若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：

1．  用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。

2．  将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。

3．  封闭40~60min

4．  一抗杂交，室温1h。

37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。

5．  PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

6．  二抗杂交，37℃1h。

7．  PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

8．  发光鉴定。

9．  若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

10．三抗杂交，室温1h。

37℃1h会更强，但可能增加非特异条带。

三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。

11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

12．发光鉴定。

八．NC膜的多次使用

一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。

1．  如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。

2．  如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

3．  对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。

Western的原理

几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。

最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。

变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。

在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。

样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。

曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。

样品和积层胶中含Tris-Cl（pH6.8），上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3），分离胶中含Tris-Cl（pH8.8）的。

系统中所有组分都含有0.1%的SDS（Laemmli,1970），样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。

从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

电泳丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。

这种方法分离效果极好，可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模，因为随着胶厚度的增加，电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。

Westernbloting首先是要将电泳后分离的蛋白从凝胶中转移到NC膜上，通常有两种方法：

毛细管印迹法和电泳印迹法。

毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片NC膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。

缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到NC膜上，NC膜可以与蛋白质通过疏水作用产生不可逆的结合。

但是这种方法转移效率低，通常只能转移凝胶中的一小部分蛋白质（10%-20%）。

而电泳印迹可以更快速有效的进行转移。

这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和NC膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到NC膜上。

常用的电泳转移方法有湿转和半干转。

两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。

湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。

这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。

半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。

与湿转相比，这种方法要快（15-45分钟）。

转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。

印迹首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。

处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。

处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

目前有结合各种标记物的抗体特定IgG的抗体（二抗）可以直接购买，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。

在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）。

碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以将H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。

另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺并发光，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测出辣根过氧化物酶的存在，即目标蛋白质的存在了。

除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记的DNA，可以检测印迹中的DNA结合蛋白。

在Westernbloting实验中，有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色。

这种方法叫直接法，与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。

所以一般情况下都釆用间接法进行检测。

Westernbloting要注意的一些问题

1、为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：

阳性对照（最好有标准品（比如β-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）

2、一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景

3、实验设计时所釆用的抗原批次要一样，尽量的避免人为的带来个体差异。

特别在做裂解液时更要注意所釆用的操作条件，尽可能的排除可变因素给实验带来不确定性。

4、凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：

凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEMED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。

5、电泳、转膜时特别要注意正负极，电压电流都不能过高；转膜时“三明治”的叠放次序不错，同时要防止产生气泡；尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。

6、封闭时一般在室温下2h就够了，但是要注意如果是生物素标记的二抗就不宜用牛奶，因为牛奶中含有生物素，用BSA效果更好。

7、加一抗二抗要严格保证反应时间，洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净，有利于降低背景；

容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用

上样电泳：

上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。

其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的）。

当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。

电泳结果检查：

如果要做WesternBlot，是否需要先检查电泳结果呢？

能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。

考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。

可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的WesternBlot实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。

所以最经济实惠的方法是：

丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。

丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。

转膜：

经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行WesternBlot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。

WesternBlot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（NitrocelluloseBlottingMembranes，NC）和PVDF膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。

选择的根据主要有：

a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。

  NC膜  尼龙膜  PVDF膜

灵敏度和分辨率  高  高  高

背景  低  较高  低

结合能力  80－110ug/cm2  >400ug/cm2  125－200ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）

材料质地  干的NC膜易脆  软而结实  机械强度高

溶剂耐受性  无  无  有

操作程序  缓冲液润湿,避免气泡  缓冲液润湿  使用前100%甲醇润湿

检测方式  常规染色，可用放射性和非放射性检测  不能用阴离子染料  常规染色，比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测。

适用范围  0.45um一般蛋白

0.2um一分子量小于20kD蛋白

0.1um一分子量小于7kD蛋白  低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸检测中）  糖蛋白检测和蛋白质测序

价格  价格较便宜  便宜  较贵

1.硝酸纤维素膜

硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。

NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。

转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。

选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。

另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。

另外提醒一句：

由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。

一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。

如果NC膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。

Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTraceNTNitrocelluloseTransferMembrane。

卷膜肯定是最实惠的选择，只不过要自己动手裁剪——切记，必须带手套操作。

2.PVDF膜

与硝酸纤维素膜相比，PVD