单子叶植物CRISPR载体的构建资料.docx

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单子叶植物CRISPR载体的构建资料

目录

摘要-1-

引言-1-

1.材料与方法-3-

1.1实验材料-3-

1.1.1菌株-3-

1.1.2体质粒载-3-

1.1.2酶和试剂-3-

1.1.2.1酶-3-

1.1.2.2抗生素-4-

1.1.2.3生化试剂-4-

1.2仪器设备-4-

1.3实验方法-4-

1.3.1酶切-4-

1.3.2DNA片段补平-5-

1.3.3大片段去磷酸化

1.3.4乙醇沉淀纯化DNA-5-

1.3.5胶回收-6-

1.3.6连接

1.3.7KODplus高保真酶PCR反应

1.3.8检测PCR反应-7-

1.3.9Gateway技术

1.3.9.1BP反应-8-

1.3.10大肠杆菌转化

1.3.11质粒提取-8-

2.结果与分析-9-

2.1pWBVec8+Ga-b载体的酶切-9-

2.2载体去磷酸化-10-

2.3载体补平-10-

2.4Cas9质粒的酶切-10-

2.5含有Cas9元件片段的补平-11-

2.6Cas9元件片段与载体的连接-11-

2.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR质粒检测-11-

2.8入门载体的构建-12-

3.讨论-13-

参考文献-15-

致谢-17-

集胞藻6803基因的克隆及植物转化载体的构建

摘要：

关键词：

Gateway技术

Keywords:

Gatewaytechnology

引言

蓝藻是地球上最原始、最古老的一群植物，分布很广，主要生活在淡水中，海水中也有。

蓝藻它是在地球上几乎还是绝对无氧的还原环境下，第一个利用太阳能将二氧化碳制造成有机物并释放出游离氧气的先驱生物，它对地球上的其他自养生物和异养生物的产生和演化，乃至人类的起源有着无可替代的重大意义。

蓝藻藻体有单细胞体、群体和少数丝状体，为原核生物，细胞壁在电镜下分为四层，原生质体由中心质和周质组成，中心质含有DNA，无核仁和核膜结构，称为原核。

周质中有很多扁平膜状的光合作用片层，呈条状有规律的排列，分布在其表面的色素有叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白及一些黄色色素。

蓝藻的光合作用产物为蓝藻淀粉和蓝藻颗粒体。

周质中还有气泡。

蓝藻约有150属，1500种，分布很广，从两极到赤道，从高山到海洋，到处都有它们的踪迹。

根据其植物体的形态不同而分为三个纲：

1、色球藻纲：

包括所有单细胞体和单细胞群体种类。

2、藻殖段纲：

包括所有不分枝或假分枝丝状体种类及丝状群体种类。

3、真枝藻纲：

包括所有具真分枝的丝状体种类。

。

基因组编辑就是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列从而发生遗传改变的技术，主要是进行DNA序列的敲除、插入、定点突变和组合编辑等，从而实现基因功能与调控元件的系统研究[1]。

从基因组的角度出发对植物基因进行人工改造从而培育优良品种具有非常重要的意义。

由于外源DNA与基因组靶基因发生同源重组效率很低，因此对植物基因组进行人工改造就显得异常困难。

近年来，人们借用人工改造核酸酶来提高同源重组的效率，从而实现了对基因组的精确、定向的人工改造。

目前应用于基因组编辑主要包括巨核酶技术（Meganucleases）、锌指核酸酶（ZFN）、以及TALEN核酸酶，它们已在植物基因工程中已经得到了成功的应用。

然而传统基因组编辑技术存在明显不足，例如，ZFN和TALEN对于每一个新的ZFN或TALEN嵌合蛋白质都需要被改造才能识别靶序列，这就使两种基因组编辑系统广泛应用受阻。

然而最近发现的CRISPR系统介导的基因组编辑技术只需要一小段引导RNA就能够识别特定的DNA[2]。

而且一个新的位点只需要一个新的引导RNA，极大的简化了基因组编辑的过程，扩大了靶位点的选择。

CRISPR系统也可以应用于靶向基因突变和基因修正，并且该系统也容易设计，可以实现大片段DNA缺失以及用于复合基因编辑。

CRISPR-Cas（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats-CRISPR-associatedproteins）系统是细菌与古生菌中用来抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。

对于一个典型的CRISPR位点而言通常包含若干长度为20-50bp的保守性的正向重复序列和被其间隔开的短的非重复序列，以及位于重复上游的引导序列[3]。

CRISPR系统存在三种类型，尤其以

型CRISPR系统研究较多，在

型CRISPR系统中存在Cas9核酸酶，又称CRISPR/Cas9系统。

Cas9核酸酶具有改造crRNA和破坏双链DNA的双重功能[7]。

位于sgRNA5‘端的20个左右的碱基决定CRISPR/Cas9系统在应用时Cas9核酸酶特异性切割的部位，主要负责决定CRISPR/Cas9系统的特异性，因此，只要改变这段引导RNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列上，如果同时引用多个引导RNA也可同时进行基因组上多个不同位点的编辑，从而实现复合基因的编辑。

CRISPR/Cas9系统介导的植物基因的定点突变原理为：

首先，Cas9蛋白与sgRNA形成复合体。

其次，上述复合体切割与sgRNA的spacer互补的基因组DNA序列，随后造成双链DNA的损伤。

最后通过体内的NHEJ或HR修复机制将引入基因突变[4]。

受序列的限制以往的CRISPR载体往往是两个载体，也即表达sgRNA和Cas9元件位于不同的载体，共转化效率较低，为了克服这一困难，我们采用酶切连接和Gateway技术构建便式表达载体。

我们已经了解sgRNA5‘端的20个左右的碱基决定CRISPR/Cas9系统的特异性，但是20个左右的碱基片段链接不方便，使用起来操作不方便效率偏低。

本研究利用Gateway技术和改进后的定点突变技术将基因特异的靶序列构建到通用载体中得到表达特异基因sgRNA的入门载体，将其与目标载体同源重组即可得到特异的基因表达载体。

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株

大肠杆菌DB3.1和Trans1-T1感受态细胞均有周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供。

1.1.2质粒载体

入门载体：

pDONR207周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供

表达载体：

周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供

1.1.3酶和试剂

1.1.3.1酶

KODplusDNA聚合酶（Toyobo）

T4DNA连接酶（NewEnglandBiolabs）

热敏磷酸化酶（NewEnglandBiolabs）

1.1.3.2抗生素

Gentamycin（Sigma）

Spectinomycin（Sigma）

1.1.3.3实验试剂

琼脂、TAE缓冲液、Goldwiew试剂、6x上样缓冲液（loadingbuffer）、DNA分子大小标准参照物、无水乙醇、75%乙醇、异丙醇、75%甘油、蒸馏水、LB培养基各组成成分、高纯度质粒小量快速提取试剂盒购自艾德莱生物科技公司。

1.2仪器设备

普通PCR仪、超净工作台、精密电子天平、100mL的容量瓶、培养皿、移液枪、-20℃冰箱、-70℃冰箱、37℃摇床、37℃培养箱、恒温水浴锅、电泳仪、制胶板、一次性手套、微波炉、水平电泳槽、凝胶成像分析系统、离心机等。

1.3实验方法

1.3.1集胞藻基因组的提取

本次实验进行KODPCR扩增所需的模板（目的基因）为集胞藻的整个基因组，提取的方法为周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室人员自己探索的方法，先将集胞藻离心收集于离心管中，加入提取液、溶菌酶、0.2mm的玻璃珠后，轻轻震荡破碎集胞藻细胞，然后纯化DNA，即得到集胞藻的整个基因组。

1.3.2集胞藻6803CCM途径基因的KODPCR扩增

1.3.2.1KODPCR反应体系：

总体系为50μl

KODplus

1μl

MgSO4

3μl

dNTP

5μl

Buffer

5μl

模板

1μl

Primer1

2μl

Primer2

2μl

ddH2O

31μl

1.3.2.2引物

均为周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室购买，呈干粉状态，先经过高速离心，再稀释100倍。

1.3.2.3KODPCR的温度设置：

先经过95℃预变性8分钟，然后是95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行35个循环后，再经过72℃终变性5min，16℃保存，即完成整个循环。

1.3.3琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖

0.2g

TAE缓冲液

20mL

Goldwiew

0.6μl

（1）准备。

本实验需制备1%的琼脂糖胶液，称取0.2g琼脂糖溶于20mL的电泳缓冲液TAE中。

（2）熔解。

微波炉加热使琼脂糖充分熔解。

（3）加入Goldwiew。

由于溴化乙锭毒性较大，故本实验加入核酸染色剂Goldwiew，需戴上一次性手套。

（4）灌胶。

本实验选择的是小型制胶板，缓慢地将琼脂糖胶液注入1个带有“梳子”的胶床中，至胶完全凝固，约20分钟左右。

（5）放胶。

代胶凝固之后，轻轻拔出梳子，将制胶板放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑色电极），注入适量的电泳缓冲液。

（6）点样。

取适量KODPCR扩增产物及DNA分子大小标准参照物，加入6x上样缓冲液，混匀，采用移液器进行点样：

使吸管与加样孔垂直，吸管尖端刚好在加样孔开口之下，缓慢将DNA样品加入加样孔中。

（7）电泳。

加样完毕后，正确连接电泳槽和电源，黑色连阴极，红色连阳极，电压为130V，电流为135mA。

（8）拍照、保存。

跑胶30min后，切断电源，取出凝胶，用凝胶成像分析系统拍照保存。

1.3.4KODPCR产物纯化：

硅胶膜吸附法

缓冲液EB需事先预热

吸附柱先加入平衡液进行平衡

（1）300μl溶胶液、100μl异丙醇与PCR产物混合

（2）混合液转移至吸附柱，室温放置1min，3000rpm1min，12000rpm1min

（3）将吸附柱内下层液体倒掉，加入600μlWB（洗脱液），12000rpm1min

（4）重复3。

（5）将洗脱液倒掉以后，12000rpm2min

（6）把吸附柱放入新的1.5EP管，加入50μl缓冲液EB，37℃烘箱放置5min，12000rpm1min

1.3.5Gateway技术

1.3.5.1BP反应

以构建入门载体目的，5.2μl反应体系，配比如下，25℃,水浴1-3h。

转化普通大肠杆菌Trans-5阿尔法感受态细胞。

PCR纯化产物

4μl

pDONR207

0.7μl

BP重组酶

0.5μl

1.3.6Trans-5阿尔法感受态大肠杆菌转化

（1）-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞，将溶未溶时转化效率最后。

（2）加入BP反应产物，10μl混匀，冰浴30min。

（3）将感受态细胞在42℃水浴锅中热激90s，此过程要迅速。

（4）取出后迅速转移到冰山，冷却2min。

（5）无菌条件下，感受态中加入50μlLB培养液（不含抗生素）混匀后于37℃恒温箱150rpm摇床45min。

（6）在无菌条件下，均匀涂到含有Gen抗生素的LB固体培养基上，待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板37℃培养过夜。

（7）挑单克隆。

挑取大肠杆菌8处单菌落于8个50mL离心管中，加入LB培养液。

（8）37℃恒温箱150rpm摇床3h。

1.3.7菌液PCR反应

验证入门载体是否转到大肠杆菌内，PCR反应体系（15μl）。

2×Mix

7.5μl

Primer1

0.5μl

Primer2

0.5μl

菌液

1μl

ddH2O

5.5μl

PCR反应的条件：

95℃预变性8min,95℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸1min,扩增35个循环，72℃终变性5min,16℃保存。

1.3.8琼脂糖凝胶电泳

过程同1.3.3

1.3.9保菌

75%的甘油与菌液1:

1混匀后，放入-80液氮中。

1.3.10质粒提取

质粒DNA提取使用的是购自艾德莱生物科技公司的高纯度质粒小量快速提取试剂盒，操作步骤如下：

（1）摇菌：

从LB固体培养基平板上挑取大肠杆菌的单菌落，接种至5ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，将其放置在摇床上，230rpm震荡培养约8h。

（2）集菌：

取过夜培养的菌液，装入2ml离心管中，12000rpm于室温1min沉淀菌体，弃上清，反复进行2-3次。

（3）重悬：

加入250μlBufferP1，充分混悬震荡，使菌体彻底悬浮。

（4）裂解：

加入250μlBufferP2，上下温和翻转6-8次，使细菌完全裂解，室温放置时间不能超过5min。

（5）中和：

加入350μlBufferP3，立即温和地上下翻转6-8次，出现均匀白色絮状沉淀，冰上放置5min,13000rpm离心10min。

（6）柱平衡：

向插入套管的吸附柱柱内加入100μlBufferPE,13000rpm离心30s,弃去套管中的废液。

（7）将中和后离心的质粒粗提物上清小心吸出并转移至平衡过的吸附柱内，13000rpm离心1min，弃上清。

（8）清洗：

向离心柱内加入600μl漂洗液WB（已加乙醇），13000rpm离心1min，弃上清。

（9）再清洗：

再次向吸附柱内加入600μl漂洗液WB，13000rpm离心1min，弃上清。

将吸附柱放回套管，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

（10）收吸附柱：

取出吸附柱，放入一个干净的1.5ml离心管内。

（11）洗脱DNA:

在吸附膜的中间部位加入70μlEB（已70℃加热）,70℃烘箱放置5-10min，13000rpm，离心1min。

（12）再次洗脱DNA：

在吸附膜的中间部位加入70μlEB（已70℃加热）,13000rpm，离心1min，将最终获得的质粒DNA溶液置于-20℃备用。

1.3.11琼脂糖凝胶电泳

过程同1.3.3和1.3.8

1.3.12LR反应

，以构建表达载体目的，4.7μl反应体系，配比如下，25℃,水浴1-3h。

转化普通大肠杆菌Trans-5阿尔法感受态细胞

入门载体

3μl

LR重组酶

0.5μl

载体

1.2μl

1.3.13Trans-5阿尔法感受态大肠杆菌转化

过程同1.3.6

1.3.14菌液PCR反应

过程同1.3.7

1.3.15琼脂糖凝胶电泳

过程同1.3.3、1.3.8、1.3.11

1.3.161.3.9保菌

过程同1.3.9

1.3.17质粒提取

过程同1.3.10

1.3.18农杆菌转化

（1）从-80℃冰箱取出农杆菌感受态，在冰上融化后加入10μl质粒。

（2）混匀后冰浴30min。

（3）液氮中速冻90s

（4）水浴锅37℃保温2min后，在超净工作台上加入500μlLB培养液，28℃、180rpm摇菌培养2-4h。

（5）在超净工作台上，取适量的菌液涂在含有卡那霉素的选择培养基上，28℃倒置黑暗培养，2-3天后可以看到转化出的农杆菌单菌落。

1.3.19瞬时转化拟南芥

（1）挑农杆菌单菌落于LB培养基中，28℃摇菌。

（2）OD600=1—1.5

（3）离心3000rpm15min

（4）弃上清，用重悬液悬起OD600=0.6—0.8

（5）避光1—3h

（6）侵染前加入0.03%silwet—77，混匀。

（7）将拟南芥花浸泡入菌液中8s。

（8）拿出甩干，保鲜膜包好，避光或弱光培养12h。

（9）正常培养，10天之后再次侵染。

（10）收种子，在含有抗性培养基上进行筛选。

2.结果与分析

2.1pWBVec8+Ga-b载体的酶切

根据pWBVec8+Ga-b载体图谱可知，pWBVec8+Ga-b载体含有Xba

专一酶切位点，酶切获取13.2kbDNA片段，进行电泳检测并回收（图1）。

图1载体pWBVec8+Ga-b的酶切回收。

A，载体pWBVec8+Ga-b示意图；B，载体pWBVec8+Ga-b的酶切回收后电泳检测。

2.2载体去磷酸化

Xba

对pWBVec8+Ga-b载体酶切后会产生5，突出粘性末端，为了防止载体自连现象的发生，利用热敏磷酸化酶进行去磷酸化处理。

去磷酸化后利用乙醇沉淀法进行纯化。

2.3载体补平

Xba

酶切后产生5，突出粘性末端，对DNA片段的连接需要碱基完全互补配对，对于同源性低的两片段连接率就低甚至不发生连接，为了方便连接需要对目的DNA片段在Klenow酶的作用下以dNTP为原料根据碱基互补配对原则进行补平，最终形成平末端。

2.4Cas9质粒的酶切

Cas9质粒中有一下元件依次为，35S启动子、NLS核定位信号序列、flag标签序列、基因编码序列和终止序列，并且在35S启动子和最后的终止子两侧分别存在EcoR

和Hind

双酶切位点。

利用EcoR

和Hind

双酶切后5.5kbDNA片段即是含有上述元件的片段，我们采用EcoR

和Hind

双酶切回收该片段（图2）。

图2Cas9质粒的酶切电泳检测图

2.5含有Cas9元件片段的补平

为了方便载体的连接，在Klenow酶的作用下以dNTP为原料根据碱基互补配对原则对上一步回收的酶切产物进行补平，最终形成平末端。

2.6Cas9元件片段与载体的连接

插入片段Cas9与目的载体pWBVec8+Ga-b进行连接，将连接后的载体转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞，均匀涂布到含有壮观霉素的LB固体培养基平板上，挑取单克隆摇菌并提取质粒即为目标载体，并标记为pWBVec8+Ga-b-CRISPR。

2.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR质粒检测

经分析目标载体pWBVec8+Ga-b-CRISPR含有两处Xba

的酶切位点，如果进行Xba

酶切又可以得到5.5K的片段和13.2K的片段。

经过检测我们得到正确的重新的到插入片段Cas9和目的载体pWBVec8+Ga-b。

后根据目标载体pWBVec8+Ga-b-CRISPR的结构特点进行Xba

单酶切，电泳检测以验证所构建的载体是否正确（图3）。

图3pWBVec8+Ga-b-CRISPR质粒检测。

A，载体pWBVec8+Ga-b-CRISPR示意图；B，载体pWBVec8+Ga-b-CRISPR的酶切后电泳检测。

2.8入门载体的构建

首先对oSU6启动子利用PCR技术进行扩增并电泳检测（图4A），选择pDONR207作为供体利用Gateway技术进行构建。

将得到的入门载体转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，均匀涂布到含有庆大霉素的LB固体培养基平板上，挑取单克隆摇菌，利用载体上重组位点两侧的序列设计引物（pDONR-F/pDONR-R）进行菌液PCR检测，正确的克隆应该能得到约700bp的条带，检测正确的克隆提取质粒备用（图4B）。

图4入门载体的构建。

A,oSU6启动子PCR扩增电泳检测图；B,入门载体电泳检测图；

3.讨论

本实验对CRISPR/Cas9系统进行了定向改造一方面提高了转化效率，另一方面为以后对基因组进行人工改造提供简单便捷的途径。

在实验过程中我们不仅采用传统的酶切、连接构建载体，也提出利用Gateway技术进行构建载体。

Gateway技术是基于噬菌体的位点特异重组反应，在目的片段添加重组位点，将PCR产物与含重组位点的供体载体混合进行BP反应获得入门载体（entryclone），入门载体可以和不同用途的目标载体进行LR反应获得相应的表达载体，无需相应的核酸内切酶和DNA连接酶。

如果已经成功的构建一个入门载体，就可以反复的使用它，将特异的目标基因重组到定向改造过的表达载体上。

当目的基因在表达载体间简捷快速穿行时，保证了重组DNA片段正确的阅读框和方向，因而不影响不同的表达克隆的测序结果。

这在使用每一种新的表达系统时，更多节省了时间。

实验验中对比得知，传统的酶切-连接技术要求严格，容易出错，酶切位点不易找到，成功率不高，而Gateway技术这种方法不仅简单而且成本较低，成功率高，适合实验室普遍推广应用。

本实验将表达sgRNA和Cas9元件整合到同一载体中，以提高转化效率。

同时也利用改造后的定点突变技术对含有OsU6启动子和sgRNA的入门载体进行改造，引入位点特异的20bp的序列，方便sgRNA元件序列的替换。

定点突变技术采用聚合酶链式反应（PCR）等方法向基因组或是质粒中引入具有表征方向的变化，包括碱基的添加、删除、点突变等，定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段，其中，体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段[5]。

对于本实验研究的CRISPR/Cas9系统而言，再某些程度上优于其他基因组编辑技术，但是也存在自身的不足，例如，在不同的生物中也表现出不同程度的脱靶效应是目前研究领域需要解决的一大难题。

据相关实验研究表明：

Spacer序列的碱基组成、长度、错配位点的位置、数目和分布特点以及Cas9核酸酶和sgRNA的浓度等数个因素均有可能影响CRISPR/Cas系统的特异性[6-9]。

现阶段主要通过尽可能的选择特异性较高的Spacer序列的位置、对Cas9基因进行密码子优化以及选择合适的sgRNA（包括计算机建模和控制sgRNA的表达量）来降低脱靶效应。

最近，CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术发展极为迅速，已经在动物建模、作物育种、基因治疗、药物开发和工业生物工程等不同的领域中得到了广泛的应用[10]。

目前，CRISPR/Cas9系统已经成功的在拟南芥[11]、烟草[12]、水稻[13]、小麦[14]、玉米[15]、等生物中实现了定点基因组编辑。

针对世界上的耕地面积和可利用资源的存在状况，培养高产优质的农作物就显得至关重要。

因此，采用最新的生物技术来进行修饰植物内源基因以此来提高作物的产量并改良作物的品质创造新的途径[16]。

CRISPR/Cas9系统中也存在很多有待解决的问题：

1、怎样才能攻破PAM序列的限制2、如何设立对Cas9脱靶效应的全面评价体系3、如何构造在不同的物种中通用的Cas9与sgRNA导入与表达系统4、如何更高效的激活同源重组修复等[10]。

然而基于CRISPR/Cas9系统的快速发展以及随着相关基础科学研究的深入，CRISPR/Cas9系统将在基因组水平的基因的改造、表观遗传的调控以及在转录调控等不同的层次上得到更为宽广的发展与应用。

本实验就为不同物种构建不同转基因表达载体从而发生定点突变提供高效，经济，简单的提供可能。

参考文献

[1]谢科，饶力群．基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景[J].中国生物工程杂志,2013，33（6）:

99-104.

[2]Gaj,T.Gersbach,C.A.,andBarbas,C.F.,III（2013）.ZFN,TALEN,andCRISPR/Cas-basedmethodsforgenomeengineering.TrendsBiotechnol.31,397–405.

[3]MojicaFJ,Diez-VillasenorC,SoriaE,etal.Biological