大豆胰蛋白酶抑制剂对人宫颈癌Hela细胞增殖的影响参考模板.docx

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大豆胰蛋白酶抑制剂对人宫颈癌Hela细胞增殖的影响参考模板

大豆胰蛋白酶抑制剂对人宫颈癌Hela细胞增殖的影响

【摘要】目的探讨大豆胰蛋白酶抑制剂（Soybeantrypsininhibitor,SBTI）对人宫颈癌细胞（hela）体外增殖的影响。

方法选用hela细胞进行体外培养，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测SBTI对细胞增殖的影响。

结果在药物浓度为0.50～10.00　g/L浓度时，随着药物浓度的增加，随着作用时间的增加，SBTI对细胞增殖的抑制率明显增强；在光镜下可以看到细胞凋亡的特征形态。

结论SBTI对hela细胞的增殖有明显的抑制作用，呈现量效，时效关系。

【关键词】大豆胰蛋白酶抑制剂人宫颈癌细胞细胞增殖

　　Abstract:

ObjectiveTostudytheinfluenceofsoybeantrypsininhibitor（Trypsininhibitor.SBTI）onthehumanhelacells'（Ishikawa）proliferationinvitro.MethodsHelacellswereculturedinvitroandeffectsofSBTIoncellproliferationweremeasuredbyusingmethylthiazolyltetrazolium（MTT）assay.ResultsFor0.20～1.00g/LSBTIconcentration,withtheincreasingconcentrationofthedrugandwiththedurationofthesameconcentration,theinhibitiontocellproliferationwassignificantlystrengthened.Thecharacteristicsoftheapoptosiscanbeobservedunderthelightmicroscope.ConclusionsSBTImarkedlyinhibitedhelacells'proliferationondose-effectandtime-effectrelationship.

Keywords:

soybeantrypsininhibitor;thehumanhelacells;cellmultiplication

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。

患者年龄分布呈双峰状，35～39岁和60～64岁，平均年龄52.5岁。

宫颈癌不仅发病率居于首位，近年来发病年龄有提前的趋势，探寻一种经济有效的、非手术的、能够免除平常化疗药物副作用的方法可谓当务之急。

大豆胰蛋白酶抑制剂是从大豆中提取的，是指能够抑制胰蛋白酶作用的一类物质。

国内外已经有文献报道大豆胰蛋白酶抑制剂具有多种药理活性，其中包括抗炎，抗病毒，抗肿瘤等。

现在人们在对结肠癌，前列腺癌，乳腺癌的研究已经证明大豆胰蛋白酶抑制剂有明显的抗肿瘤作用［1-3］。

大豆胰蛋白酶抑制剂已经受到人们的关注，成为研究的热点。

但是国内外关于大豆胰蛋白酶抑制剂对宫颈癌的研究报道较少。

本实验以细胞培养为基础，对大豆胰蛋白酶抑制剂的抗肿瘤作用进行了初步研究，通过证明大豆胰蛋白酶抑制剂对宫颈癌细胞增殖的抑制作用，以期对临床用药和开发提供科学依据，积累实验资料，现报告如下。

　　1材料和方法

　　1.1实验材料

　　1.1.1药品和试剂

　　大豆胰蛋白酶抑制剂为北京中医药大学细胞与生化实验室提取（浓度为98%）；RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青血清；胰蛋白酶和EDTA均购于Ameresco公司。

四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma公司；HERAD—6345型二氧化碳培养箱（德国赫利氏公司）；IⅩ71倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）;FCANF129004酶标仪（澳大利亚TECAN公司）。

　　1.1.2细胞株

　　人宫颈癌细胞株（Hela）由北京病毒学研究所惠赠。

　　1.1.3培养液

　　RPMI1640全培养液（RPMI1640+10％胎牛血清+青链霉素100U/mL及100μg/mL）。

　　1.2实验方法

　　1.2.1肿瘤细胞培养

Hela细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI1640全培养液，在设定为37.0℃、5%CO2培养箱中培养。

细胞可贴壁生长，待细胞生长贴满底壁的80%左右时传代。

传代时移去旧的培养液，用PBS洗涤2次，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液消化，培养液重悬细胞于新培养液中，每瓶传代为2或3瓶。

取对数生长期细胞用于实验。

　　1.2.2MTT法测定细胞生长

将用上述方法培养得到的细胞消化，l000rpm离心10min，计数，以2×105个/L密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，在37.0℃、5%CO2培养箱培养24h后，加入浓度分别为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00g/L的SBTI（溶解在含10%胎牛血清的1640全培养液中）100μL。

每一浓度各设6个平行孔，并分别设空白孔（即只加入药液和培养液，不加细胞）以调零。

继续培养24、36、48h后，每孔加入20μLMTT（5g/L），再培养4h，弃上清，每孔加入150μLDMSO，振荡器上震荡10min，应用酶标仪于490nm处测吸光值（A），按照公式：

抑制率％=（对照组A－实验组A）/对照A×100％，求抑制率。

实验在相同条件下均重复进行3次。

　　1.2.3光镜下形态学观察

hela细胞接种于50mL培养瓶中，培养24h后，加入0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00g/L的SBTI，培养24h后，光学显微镜下观察细胞形态学变化，并拍摄照片。

　　1.2.4统计学处理

数据利用SPSS13.0统计软件处理，求抑制率，采用重复测量的方差分析。

并绘制出SBTI对Hela细胞抑制作用的量效和时效依赖关系曲线。

　　2结果

　　2.1SBTI对Hela细胞增殖的抑制作用

　　SBTI能够明显的抑制Hela细胞的增殖，并且呈现明显的量效和时效依赖关系。

在不同的作用时间分别是24、36、48h，随着药物浓度（为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00g/L）的依次增加，抑制率依次增加，最高可达83.24％，87.83％，96.01％,除了0.50g/L与1.00g/L组之间差异没有显著性（P>0.05）外，其他各组差异均有显著性（P

﹤0.01）；在不同的作用浓度（如上的6个浓度），随着作用时间（24，36，48h）的依次增加，抑制率也依次增加，除了0.50g/L和1.00g/L组的24h与36h比较差异没有显著性（P>0.05）外，其他的均有有显著性差异（P﹤0.01），抑制率最高可达49.2%，59.77%,77.52%,80.92%,96.01%。

见表1、图1。

表1不同浓度大豆胰蛋白酶抑制剂在不同作用时间对Hela细胞的抑制率（略）注：

*实验组与对照组比较P﹤0.01。

#与前一组比较P﹤0.01,△与上一组比较P﹤0.01但是0.50g/L与1.00g/L两组间在24h时差异没有显著性P>0.05,0.50g/L组的24h与36h比较差异没有显著性P>0.05，1.00g/L组的24h与36h比较差异没有显著性P>0.05　　2.2SBTI对Hela细胞形态上的影响

　　正常培养时，Hela细胞在传代后陪培养3～4h即可贴壁，呈现长椭圆形，10h后贴壁结实，呈现多角形而且细胞大小不一，可见巨大细胞，胞质也多少不一，核大小不等，可有双核。

24h后细胞呈现活跃的增殖。

48～72h后细胞生长贴满一底壁，此期间细胞称为对数生长期，见图2，图3。

96h后则由于细胞之间互相的抑制而不再增殖。

在对数生长期的细胞，加药不同浓度后培养24h，可见1.00g/L浓度的细胞不再增殖，细胞间距变大，而且贴壁不紧固，见图4，10.00g/L浓度的细胞，细胞大部分变圆，边缘跷起，且已脱离底壁，少量细胞聚集成一个一个的小细胞团，见图5。

　　3讨论

胰蛋白酶抑制剂（trypsininhibitor，TI）是指能够抑制胰蛋白酶作用的一类物质。

天然的胰蛋白酶抑制剂来源广泛，动物植物以及人体内均含有TI，如可从黄豆、南瓜籽、牛肺或牛胰以及人尿中提取等。

大豆胰蛋白酶抑制剂（soybeantrypsininhibitor,SBTI）是从大豆中提取的［4］，无毒副作用［5］，具有广泛的生物学活性和作用，有着良好的科学研究和临床治疗前景。

肿瘤的发生有其遗传物质基础,主要表现为多基因突变所致的细胞失控性生长,细胞增殖失控和凋亡受阻是其发生、发展的主要原因,有效的抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的新的手段之一。

大豆胰蛋白酶抑制剂具有抗肿瘤作用。

Zhang［6］等研究了单纯型的大豆胰蛋白酶抑制剂BBI对人类乳腺癌细胞（MCF7）、人类头颈肿瘤细胞（SCC61和SQ20B）、人类宫颈癌细胞（Hela,Hela-R1,Hela-R3）、非肿瘤生成性人类上皮细胞（MCF10）、非肿瘤生成性人类甲状腺上皮细胞（Htori-3）及小鼠成纤维细胞（C3H10T1/2）的影响,结果显示单纯型的大豆胰蛋白酶抑制剂BBI和结合型的大豆胰蛋白酶抑制剂BBIC能够显著降低MCF7和SCC61细胞系的存活率。

有实验证明大豆胰蛋白酶抑制剂具有明显的抑制肿瘤细胞降解基质膜的作用，从而能够抑制肿瘤细胞离开原来的生长部位，突破细胞外基质（ECM）的屏障和侵犯周围毗邻的正常组织［7］。

大豆胰蛋白酶抑制剂的还可以通过抑制肿瘤细胞的纤溶酶原激活系统起作用。

这一系统包括:

尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinasetypeplasminogenactivator,uPA）及其受体（uPAR）和uPA抑制剂。

大豆胰蛋白酶抑制剂与目前研究较为成熟的尿胰蛋白酶抑制剂（Bikunin）有着类似的作用，即与uPA结合形成一个复合体,并竞争地与uPAR结合,封闭uPAR的激活部位,使uPA酶活性不被激活,从而防止肿瘤细胞的转移和浸润。

Kobayashi等［8］研究发现,肿瘤可分泌大量uPA,分泌后随即与肿瘤细胞表面的uPAR高度结合,活化的uPA再催化细胞表面的纤溶酶产生蛋白溶解级联反应,导致基底膜和细胞外基质被破坏。

Kobayashi等［9］通过Northernblot、Westernblot、酶联免疫吸附法等证实,SBTI以一种时间及剂量依赖形式,在基因及蛋白水平抑制卵巢癌细胞系HOC－Ⅰ和HRA的uPA表达。

另外，大豆胰蛋白酶抑制剂调节信号传导途径而抑制肿瘤细胞的生长。

大豆胰蛋白酶抑制剂通过直接抑制CD44的二聚化抑制肿瘤转移。

白细胞分化抗原CD44是一种多功能跨膜糖蛋白,它促进肿瘤细胞粘附、迁移,参与新生血管形成等一系列关键步骤。

Kobayashi等［10］对人类软骨肉瘤细胞系HCS22/8研究显示,肿瘤细胞间是通过CD44相互识别透明质酸,其相互作用是通过CD44蛋白二聚化完成。

SBTI通过直接抑制CD44二聚化介导激活的促细胞分裂原活化蛋白激酶系统,从而抑制uPAmRNA及其蛋白的表达及肿瘤的侵袭。

本实验用大豆胰蛋白酶抑制剂处理人宫颈癌细胞Hela细胞后,Hela细胞的生长受到明显抑制,随着药物浓度为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00g/L依次增加，作用时间为24、36、48h的依次延长，其抑制率也明显增加。

并且出现凋亡的特征性改变：

细胞大部分变圆，边缘跷起，且已脱离底壁，少量细胞聚集成一个一个的小细胞团，并随着药物浓度的增加，细胞均漂起，聚集成一个一个的大细胞团。

这些结果表明大豆胰蛋白酶抑制剂能抑制Hela细胞增殖，与文献报道相似这可能是诱导Hela细胞发生凋亡有关。

有关于大豆胰蛋白酶抑制剂抑制Hela细胞的机理方面我们将在以后做进一步的研究。

总之，大豆胰蛋白酶抑制剂，作为一种新型又无毒副作用的抗癌药，很有值得研究的价值，尤其我国是一个大豆资源丰富的国家，对其机制的深入研究，将对临床肿瘤治疗步入一个新的阶段有着重要的意义。

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