蛋白免疫印迹杂交.docx
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蛋白免疫印迹杂交
蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册
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蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册
蛋白免疫印迹杂交（WesternBlotWB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。
本指南讨论WesternBlot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A蛋白样本提取制备
1细胞或组织裂解
2蛋白酶和磷酸酶抑制剂
3蛋白定量
4电泳上样样品的准备
B 电泳
1PAGE胶的制备
2蛋白分子量Marker
3阳性对照
4内参对照
5上样与电泳
C 转膜与显色（WesternBlot）
1胶中蛋白的检测
2蛋白转膜
3膜上蛋白的检测：
丽春红
4膜的封闭
5一抗的孵育
6二抗的孵育
7显色
D常见问题分析与解决方案
附录1 WB实验试剂配制方法
附录2 SDS-PAGE胶的配制
WB概述:
检测原理:
A蛋白样本提取制备
蛋白样品制备是WesternBlotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，
总体原则和注意事项：
1：
尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白
（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）
2：
保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择）
3：
提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）
4：
尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）
5：
样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
A-1细胞或组织裂解
A-1-1细胞裂解
裂解液Lysisbuffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*
目的蛋白分布定位
推荐裂解液Lysisbuffe
推荐试剂盒
全细胞
NP-40orRIPA（附录1）
全蛋白抽提试剂盒
细胞质（可溶蛋白）
Tris-HCl（附录1）
胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒
线粒体蛋白提取试剂盒
细胞质（细胞骨架等不溶蛋白）
Tris-Triton（附录1）
蛋白分级抽提试剂盒
细胞质（磷酸化蛋白）
磷酸化蛋白抽提试剂盒
细胞膜
NP-40orRIPA（附录1）
膜蛋白抽提试剂盒
蛋白分级抽提试剂盒
细胞核
RIPA（附录1）
核蛋白抽提试剂盒
线粒体
RIPA（附录1）
线粒体蛋白抽提试剂盒
亚细胞定位蛋白抽提试剂盒
细胞裂解操作方法：
1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）
2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（（1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask;0.5mlper5x106
cells/60mmdish/75cm2flask）.
3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，
4 4℃摇动30min
5 4℃离心12,000rpm，20min（根椐细胞种类不同调整离心力）
6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.
A-1-2组织裂解
1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，
2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，
3 每约5mg加入约300μl预冷的裂解液lysisbuffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1mg/ml,理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml）.
4 4℃离心12,000rpm，20min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,
A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂
推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制：
备注：
其中Sodiumorthovanadate配制活化方法如下：
所有步聚均需在通风橱中进行：
1.用双蒸水配制100mM正矾酸钠溶液.
2.用盐酸HCl调至pH9.0
3.煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发.
4.冷却至室温
5.再调pH至9.0
6.再煮沸至无色
7.重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH9.0
8.用水定容至原体积
9.分装保存于-20°C.溶液变黄则弃之不用.
A-3 蛋白定量
Bradford法Lowry法或BCA法（均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白（BSA）作为标准曲线。
如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA法。
三种方法或产品比较列表如下：
方法
原理
灵敏性
干扰因素
应用
Lowry法
Folin－酚试剂法
蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，还原酚磷钼酸产生蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系
较高约5μg/ml
对可达1-1500μg/ml
适用于脂类含量较高的样品测定，也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。
受硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇干扰
耗费时间长40～60分钟；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差
Bradford法
考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合呈蓝色，在波长595nm吸收峰，在一定的范围内与蛋白质的含量呈线性关系
高约1～5μg/ml,
微孔法测定范围为1-25μg/ml
试管法测定范围为100-1500μg/ml
易受强碱性缓冲液，TritonX-100，SDS等去污剂的影响
快速5～15分钟，颜色稳定；深浅随不同蛋白质变化;标准曲线有轻微的非线性
BCA法
BCA法基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu1+，BCA（Bicinchoninic酸）螯合Cu1+ 作为显色剂，产生兰紫色并在562nm有吸收峰单价Cu1+与蛋白呈剂量相关性，
很高0.5-20μg/ml
试管法可测范围20–2,000μg/ml
微孔法为0.5～10μg/ml
不易受一般浓度去污剂的干扰
可受螯合剂；略高浓度的还原剂的影响
较快40分钟内，较好的方法；抗干扰能力强
BCA测定方法如下:
A． 酶标板操作
1. 标准曲线的绘制：
取一块酶标板，按照下表加入试剂
孔号
0
1
2
3
4
5
6
7
蛋白标准溶液（μL）
0
1
2
4
8
12
16
20
去离子水（μL）
20
19
18
16
12
8
4
0
对应蛋白含量（μg）
0
0.5
1.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:
1）配制适量BCA工作液，充分混匀；
3. 各孔加入200μLBCA工作液；
4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。
以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
5. 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，加入BCA工作液200μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；
6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（20μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：
μg/μL）。
B． 分光光度计测定
1. 标准曲线的绘制：
各管按照下表加入试剂
孔号
0
1
2
3
4
5
6
7
蛋白标准溶液（μL）
0
5
10
20
40
60
80
100
去离子水（μL）
100
95
90
80
60
40
20
0
对应蛋白含量（μg）
0
2.5
5.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
2. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:
1）配制适量BCA工作液，充分混匀；
3. 各管加入1000μLBCA工作液；
4. 各管充分混匀，37℃放置30分钟，然后在562nm下比色测定。
以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
5. 稀释待测样品至合适浓度，样品稀释液总体积为100μL，加入BCA工作液1000μL，充分混匀，37℃放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；
6. 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量（μg），除以样品稀释液总体积（100μL），乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：
μg/μL）。
A-4电泳上样样品的准备
A-4-1变性、还原蛋白样本
一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，
蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer（loadingbuffer），并于95-100°C煮沸5分钟，对于多次跨膜蛋白，可以于70°C加热5-10分钟，标准的上样buffer称为2XLaemmlibuffer，上样时与样本！
：
！
混合后变性上样即可：
2XLaemmlibuffer
4%SDS
10%2-mercaptoehtanol
20%glycerol
0.004%bromophenolblue
0.125MTrisHCl
CheckthepHandbringittopH6.8.
SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不同分子量的蛋白分离开。
A-4-2天然和非还原样本
某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加SDS，样本也不需煮沸。
某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些cysteine基的氧化态，因此loadingbuffer和电泳液中不加入ß-mercaptoethanolandDTT
蛋白状态
凝胶状态
loadingbuffer
电泳缓冲液
还原—变性
还原和变性
有ß-mercaptoethanol或DTT和SDS
有SDS
还原—天然
还原和非变性
有ß-mercaptoethanol或DTT，无SDS
无SDS
氧化-变性
非还原和变性
无ß-mercaptoethanol或DTT，有SDS
有SDS
氧化-还原
非还原和天然
无ß-mercaptoethanol或DTT，无SDS
无SDS
注：
除说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性和还原电泳
B 电泳
B-1PAGE胶的制备
聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）.，聚合需加入过硫酸铵及DMAP或TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。
凝胶的孔径取决于总丙烯酰胺的百分含量（%T））和交联度（%C），T%=（a+b）/m*100%;和C%=a/（a+b）*100%,其中:
a=双体（bis）的重量;b=单体（arc）的重量;m=溶液的体积（ml）。
丙烯酰胺总量增加，则孔径减小，5%C构成最小的孔径，任何的%C增加或降低，孔径都增加，凝胶的百分浓度组成需两个参数，丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）.的总量百分浓度（w/v）。
不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。
蛋白分子量（kDa）
凝胶浓度（%）
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
10
25-200
8
不同浓度的凝胶的配制方法见附录2 首先配制各组分贮备液，然后分别配制浓缩胶和分离胶。
B-2蛋白分子量Marker
预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪
商业化产品：
非预染Marker （MW116,97.4,66,45,3629,24,20.1,14.2KDa）
预染Marker （MW116,97.4,66,45,3629,24,20.1,14.2KDa）
B-3阳性对照
目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别是一抗的质量和效率。
建议使用该对照。
可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本。
B-4内参对照
管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。
必须设立。
内参Beta-actin抗体 at1/5000dilution,Lysates/proteinsat20ugperlane Lane1:
HeLanuclear Lane2:
HeLawholecelllysate Lane3:
A431celllysate Lane4:
Jurkatcelllysate Lane5:
HEK293celllysate.
B-5上样与电泳
每孔上样量为20-40μg蛋白，使用专用枪头或注射针头，勿溢出加样孔，
标准电泳缓冲液：
1XTris-glycine：
25mMTrisbase
190mMglycine
0.1%SDS
调pH;8.3.
电泳时间按电流仪说明书推荐方法使用,（1小时或过夜，取决于电压大小），当染料到达胶的底部，关电源停止电泳，胶不能存放，应立刻进行下一步的转膜。
C 转膜与显色（WesternBlot）
C-1胶中蛋白的检测
电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用铜染或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的铜染法，否则采用不可逆考马斯蓝法染色。
铜染法：
电泳胶用蒸馏水洗数秒钟，加入0.3MCuCl2染色5-10分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察在兰色胶背景下蛋白出现透明条带，胶置于0.1-0.25MTris/0.25MEDTApH8.0缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。
考马斯蓝法：
用40%双蒸水,10%醋酸,50%甲醇的溶液固定胶中蛋白，考马斯蓝R-250染液（凯基产品）室温染色4小时至过夜，保持摇匀，转入67.5%双蒸水,7.5%醋酸,25%甲醇l摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。
C-2蛋白转膜
蛋白因结合SDS而带电荷，在电场下从胶中转至膜上，转膜操作根椐电转仪制造商的说明书进行转膜方式分为半干和湿转两种，半干式转膜速度快，而湿式成功率高并特别适合用于分子量大于100KD的蛋白。
湿式转膜三明治排列为：
海绵/纸/胶/膜/纸/海绵，全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡，三明治安放的方向确认正确负极方为带负电的胶里的蛋白，向正极方（膜）电迁移。
标准的电转缓冲液为1XTris-glycinebuffer不含SDS，但加入20%甲醇，如果转膜的蛋白分子量大于80KD，则推荐加入SDS使之终浓度为0。
1%。
半干式转膜中，三明治的排列为：
/纸/胶/膜/纸，用电转缓冲液浸湿后，直接置于电转仪的正负极之间。
胶于负极而膜置于正极。
半干式的电转缓冲液可不同于湿式的电转缓冲液，推荐为：
48mMTris,39mMglycine,0.04%SDS,20%甲醇，
两类膜可供选择：
硝酸纤维素膜和PVDF膜（正电荷尼龙膜），根据不同需要选择（下表），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5分钟，否则转膜时会导致条带变形。
注：
大蛋白和小蛋白的转膜
电转移缓冲液中SDS与甲醇的平衡、蛋白的大小、胶的浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效率：
大蛋白（大于100KD）
1．对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，
2 大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此；转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为0.1%的SDS，以避免出现这种情况，甲醇易便SDS从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3 降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。
4如果使用硝酸纤维素膜，甲醇是必需的，但如果是PVDF膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前PVDF需用甲醇活化。
5选择湿式，4℃转膜过夜，以取代半干式转膜。
小蛋白（小于100KD
1SDS妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加SDS。
2 保持20%的甲醇浓度
对于大于500KD的蛋白，请参考下述文献：
BoltandMahoney,High-efficiencyblottingofproteinsofdiversesizesfollowingsodiumdodecylsulfate–polyacrylamide,gelelectrophoresis.AnalyticalBiochemistry247,185–192（1997）.
更多的转膜注意事项：
Ø 避免用直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑
Ø 排列三明治时，尽量用移液器或15ml试管赶除胶与膜之间的气泡，或将三明治放在装有的培养皿中以防止气泡产生，请戴手套！
Ø 确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，否刚导致电流不能通过膜，从而转膜无效
Ø 鸡抗体易于与PVDF膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。
C-3膜上蛋白的检测：
丽春红
为检测转膜是否成功，可用丽春红染色，
2%的丽春红贮备液（20ML）：
:
2%丽春红（0.4克）溶于30%三氯乙酸（6克）和30%磺基水杨酸（6克）
丽春红染色工作液：
2%的丽春红贮备液1：
10稀释，即加9倍的ddH2O
染色方法：
将膜放入TBST洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5分钟，大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰，（膜也可以用TBST或水重新洗后再进行染色）PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。
10xTBS的配制
24.23gTrizmaHCl
80.06gNaCl
加约800ml超纯水
用纯HCl调pH至7.6
定容至1L.
TBST的配制
配制1LTBST：
:
量取100ml 10xTBS+900超纯水+1mlTween20
Tween20非常粘稠，用枪头不易吸取，请确定加入准确的量，最好用Trisbuffer.配成10%的Tween20母液后使用。
C-4膜的封闭
为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，
传统上有两种封闭液：
脱脂奶粉或BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白），使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。
某些抗体用BSA封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，，请仔细阅读说明书注明的注意事项和膜的特殊的封闭方法。
配制5%脱脂奶粉或BSA溶液：
每100mlTBST中加入5g脱脂奶粉或BSA，混匀后过滤，如不过滤会导致使膜污染上细微黑颗粒。
封闭时，4°C摇动，封闭1hour，再用TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。
C-5一抗的孵育
孵育Buffer：
按抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释一抗，如果说明书没有建议的稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数（1:
100-1:
3000），一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。
某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含封闭剂的TBST来孵育抗体，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时结果不同。
注：
如果不存在高背景的问题，某些抗体用含低浓度（0.5–0.25%）脱脂奶粉或BSA的封闭液来,稀释，可产生相对更强的信号条带。
孵育时间：
一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过18小时）不等，取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的含量丰度，建议使用较高的抗体稀释倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。
孵育温度：
尽可能低温孵育，如果在封闭液中孵育一抗过夜，应在4oC进行否则会产生污染而破坏蛋白（降别是磷酸基团）。
孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆没膜，防止结合不均匀。
C-6二抗的孵育
一抗孵育结束后，用TBST摇动洗膜数次，每次5min或更长，去除残留的一抗。
孵育Buffer和稀释倍数：
用TBST按说明书推荐的倍数稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常规的倍数稀释（1:
1000-1:
20,000）预试，二抗的浓度过高也会导致非特异性条带。
亦可以在封闭液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同时导致特异性条带的信号也减弱，可能是封闭剂阻碍了抗体与靶蛋白的结合。
孵育时间和温度：
室温、1-2hours,摇动
二抗连接物：
推荐使用二抗连接HRP，不建议连接AP碱性磷酸酶，因其不够灵敏。
C-7显色
显色分为酶促底物发光和化学发光法或荧光法
酶促底物发光法代表为DAB显色法，与其它同类方法的比较如下图所示：
而现在最常用的是化学发光法：
HRP化学发光底物Luminol（ECL法chemiluminescence）及其改良法，
对于HRP偶联的二抗，一般传统上使用ECL和ECL+，推荐使用后者
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