细菌形态理化鉴定.docx
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细菌形态理化鉴定
细菌形态理化鉴定
1形态学特征
1.1菌落形态
培养到24h后观察平板上单菌落形状、大小、颜色与突起特征。
1.2细胞形态
光学显微镜观察菌体的形态、大小、运动性等。
1.3革兰氏染色
取无油迹的干净载玻片，滴上一滴无菌蒸馏水，用接种环挑取少许菌苔，于水滴边缘轻轻涂几下。
自然风干，在火焰上通过几次，固定涂片。
滴加结晶紫液，染1min，用水冲净结晶紫液。
滴加碘液冲净残水，并覆盖约lmin。
用水冲去碘液，将片上的水甩干。
滴加95%乙醇液脱色约20-30s，并立即用水冲净乙醇。
用番红液染l-2min。
用水洗净番红，风干，用显微镜油镜观察涂片。
1.4芽孢染色
取培养24h左右的菌体涂片、干燥、固定。
滴加3-5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿使沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。
加热时间从冒蒸汽时开始计时约4-5min。
倾去染液，待载玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
用蕃红水溶液复染lmin，水洗。
待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
1.5荚膜染色
按常规取菌涂片，空气中自然干燥。
用1%的结晶紫水溶液染色2min。
以20%的硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。
干后用油镜观察。
菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。
2生理生化特性实验
1、尿素酶（Urease）试验
有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。
尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。
其活性最适pH为7.0。
试验方法：
挑取18~24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于36±1℃培养10，60和120min，分别观察结果。
或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留底部作变色对照。
培养2，4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。
培养基配制方法：
蛋白胨：
1g；NaCl：
5g；KH2PO4：
2g；葡萄糖1g；琼脂：
15g；酚红：
0.012g；蒸馏水1000ml。
除酚红外，溶解上述成分，并调节PH为6.8～6.9，然后加入酚红指示剂，使培养基呈橙黄色，分装，115℃灭菌20min。
待培养基冷至50℃左右，加入预先过滤除菌的20%尿素水溶液，使其终浓度为2%。
试验方法：
挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养1～4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红色为阳性。
2、氧化酶（Oxidase）试验
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
试验方法：
在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。
阴性者无颜色改变。
应在数分钟内判定试验结果。
注意事项：
（1）盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。
（2）铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。
（3）在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。
3、过氧化氢酶的测定
过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和氧。
1．试剂：
3－10％过氧化氢（H2O2）
2．菌种培养：
将测试菌种接种于合适的培养基斜面上，适温培养18－24h。
3．试验方法：
取一干净的载波片，在上面滴1滴3－10％的H2O2，挑取1环培养18－24h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。
也可将过氧化氢溶液直接加入斜面上，观察气泡的产生。
4．注意事项：
过氧化氢酶是1种以正铁血红素作为辅基的酶，所以测试菌所生长的培养基不可含有血红素或红血球。
4、甲基红（MethylRed）试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。
迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。
甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。
故在pH5.0以下，随酸度而增强红色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。
5、V-P试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
通用培养基配制方法：
蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl/（K2PO4-一般仅用于肠杆菌各菌属鉴定）:
5g；蒸馏水：
1000mL；PH:
7.0～7.2，分装试管，毎管装约4～5cm，115℃灭菌20min。
试剂：
40%NaOH（或KOH），6%a-萘酚。
试验方法：
将试验菌接种于上述培养基，于36±1°C培养4天培养48-96小时，培养液2ml先加入1mla-萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动2～5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性.
本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。
在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。
6、含碳/氮化合物的利用
细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源，反映该菌是否产生代谢这种化合物的有关酶系，因而作为鉴定依据。
测定的基础培养基配方很多，因种而异。
现介绍1种合成的基础培养基，有些细菌还可适当补加各种维生素。
培养基可制成液体，分装试管，也可制成固体平板。
可用于测定的底物种类很多，有单糖、双糖、糖醇、脂肪酸、羟基酸及其他有机酸、醇、各种氨基酸类胺类以及碳氢化合物等。
糖的含量一般为1％，醇类酚类等的含量一般为0.1－0.2％，氨基酸的含量一般为0.5％。
因碳氢化合物不溶于水，可在液体培养基中振荡培养，或加入到45℃的固体培养基中，振荡后立即倒成平板。
有些底物不宜用高压灭菌，可用过滤法灭菌后加入已灭菌的基础培养基中，某些醇类和酚类不必灭菌。
接种和观察结果：
菌种最好做成悬液，避免带入少量碳源干扰试验结果。
平板培养用接种环点种，液体培养则用直针接种。
每一测定菌必须接种未加碳水化合物的空白基础培养基作对照。
适温培养2、5、7天后观察，凡测定菌在有碳水化合物的培养基中生长情况，明显超过空白培养基的生长量为阳性，否则为阴性。
假若两种培养基上生长情况差别不明显，开在同一培养基上连续移种3次，如差别仍不明显则以阴性论。
（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。
）
（1）菌株对碳源的利用
Mandel盐营养液[54]：
NaNO32.0g/L，K2HPO41.5g/L,CaCl21.5g/L,MgSO40.3g/L,
FeSO4·7H2O5.0mg/L,MnSO4·H2O1.6mg/L,ZnSO4·H2O1.4mg/L,CoCl20.5mg/L.Mandel盐营养液+2%琼脂+2%碳源。
碳源分别为：
葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、
蛋白胨水培养基1000mL
糖发酵培养基：
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1-2mL，另配20%糖溶液10mL
调节pH7.6，115℃灭菌30min，备用。
木糖、甘露醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、纤维素粉、甘油、甘露糖。
每支试管内装10
mL培养基，制成斜面培养基,无菌下接种，每种碳源接种二管，一支不接种做对照，31℃
培养。
连续3代移种，生长者为阳性。
（2）菌株对氮源的利用
无氮的Mandel盐营养液+2%琼脂上铺无菌滤纸+1%不同的氮源。
氮源分别为：
NH4+、NO3-、蛋白胨、酵母膏、尿素，每种氮源制三个斜面，其中一个做对照，无菌条
件下接种，31℃培养4d，观察结果。
7、葡萄糖的氧化发酵试验（O-F实验）
在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是1项重要依据。
细菌对糖类的利用有2种类型：
1种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另一种则以分子氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。
前者包括的菌种类型为多数。
氧化型产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不表现产酸。
为此，Hugh和Leifson提出一种含有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。
这一试验广泛用于细菌鉴定。
一般用葡萄糖作为糖类代表。
也可利用这一基础培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。
（1）接种：
以18－24h的幼龄菌种，穿刺接种在上述培养基中，每株菌接4管，其中2管用油封盖（凡士林：
液体石蜡＝1：
1混合后灭菌），约加0.5－1厘米厚，以隔绝空气为闭管。
另2管不封油为开管，同时还要有不接种的闭管作对照。
适温培养1、2、4、7天观察结果。
（2）结果观察：
氧化型产酸――仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱（1－2d），后来才稍变酸。
发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。
8、糖或醇类发酵试验
原理：
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。
可用指示剂及发酵管检验。
有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：
+）、产气（符号：
○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：
－），培养基仍为紫（蓝）色。
培养基配制：
一般细菌常用休和李夫森二氏培养基：
蛋白胨：
2g，K2HPO4:
0.2g，NaCl:
5g，糖（醇、糖苷）：
1%，水洗琼脂：
5～6g，蒸馏水：
1000mL，PH:
6.8～7.0，溴百里酚蓝：
1%水溶液3mL（先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液）。
先调PH后再加指示剂。
芽孢杆菌培养基配制：
（NH4）2HPO4:
1g，MgSO4:
0.2g，KCl:
0.2g，酵母膏：
0.2g，糖（醇、糖苷）：
1%水洗琼脂：
5～6g，蒸馏水：
1000mL，溴甲酚紫：
0.4%乙醇液2mL，PH:
6.8～7.0。
先调PH后再加指示剂。
将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm，115℃灭菌20min。
测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：
葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。
注意：
以上亦可用液体培养基。
接种和观察结果：
用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。
结果记录：
产酸：
+，产气：
○，不产酸长气：
-。
法2
试验方法：
以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。
接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。
一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。
注：
对于糖醇类发酵现在一般用糖、醇类细菌微量生化鉴定管在36℃18－24h即可出结果。
9、硝酸盐（Nitrate）还原试验
有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。
亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。
试验方法：
临试前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）试液各0.2ml等量混合、取混合试剂约0.1ml、加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。
用α-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。
进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。
α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。
硝酸盐还原试验培养基：
蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl5g、KNO31g、蒸馏水1000mL
调节pH7.2-7.4，121℃灭菌20min，备用。
10、靛基质（Imdole）试验（吲哚试验）
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。
吲哚的存在可用显色反应表现出来。
吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
试验方法：
将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。
吲哚试验培养基：
蛋白胨10g、NaCl5g、蒸馏水1000mL调节pH7.6，121℃灭菌20min，备用
法2：
试剂：
对二甲氨苯甲醛1g、95%乙醇95ml、浓盐酸20ml。
配置时，应先用乙醇溶液溶解对二甲氨苯甲醛，再缓慢加入盐酸即成。
此试剂不能久存，宜少量配制，并避光保存于冰箱中或阴凉处。
试验方法及结果：
将细菌纯培养物接种到蛋白胨水培养基中，37℃培养24-72h后，沿管壁缓慢加入2-3ml的试剂于培养物的液面上。
在两层液体交界面出现红色环者为阳性，阴性反映者不变色。
为了使颜色明显，在加入试剂之前，先向培养物种加入1ml乙醚，并充分振荡，使靛基质溶于乙醚中。
静置片刻，使乙醚层浮于培养物的液面。
此时，再按上述方法徐徐加入试剂5-10滴，并观察判定结果。
11、三糖铁（TSI）琼脂试验
试验方法：
以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃培养18~24h，观察结果。
本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。
葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。
12、氨基酸脱羧酶的测定
有些细菌含有氨基酸脱羧酶，使羧基释出，生成胺类和二氧化碳。
此反应在偏酸的条件下进行。
当培养基含胺类时呈碱性反应，使指示剂变色。
接种与观察结果：
用幼龄培养液作为菌种，直接接种。
接种后封油，对照管与测定管同时接种封油。
肠肝菌科的细菌于37℃培养4天观察。
当指示剂呈紫色或带红色调的紫色者为阳性，呈黄色者为阴性。
对照管应呈黄色反应。
13、硫化氢（H2S）试验
有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
试验方法：
在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1℃培养24~28h，培养基呈黑色为阳性。
阴性应继续培养至6天。
也可用醋酸铅纸条法：
将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置36±1℃培养1~6天。
纸条变黑为阳性。
硫化氢试验培养基
pH7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100mL
硫代硫酸钠0.25g
10%醋酸铅水溶液1mL
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基100mL加热溶解，待冷至60℃时加入硫代硫酸钠
0.25g，调至pH7.2，，装入三角瓶中，115℃灭菌15min，取出后待冷至55-60℃，加入10%醋酸铅水溶液（无菌的）1mL，混匀即可。
14、柠檬酸盐或丙酸盐的利用
某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为碳源，及磷酸胺作为氮源，将柠檬酸分解为二氧化碳，则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。
接种与观察结果：
取幼龄菌种接种于斜面上，适温培养3－7天，培养基呈碱性（蓝色）者为阳性反应，不变者则为阴性。
培养基：
硫酸镁0.2g磷酸二氢铵1.0g
磷酸氢二钾1.0g枸橼酸钠5.0g
氯化钠5.0g琼脂15.0g
1%溴麝香草酚蓝酒精溶液8.0ml
蒸馏水990ml
制法：
将各物（除溴麝香草酚蓝溶液外）混合于蒸馏水内，加热溶解，校正pH7.0，再加入溴麝香草酚蓝液，混匀后分装试管，121℃20min高压灭菌后摆成斜面。
培养基呈淡绿色。
培养基摆成斜面。
将培养物划线接种。
在最佳生长温度培养7d。
结果记录：
微生物利用柠檬酸何在柠檬酸琼脂上的生长导致了碱性反应，因此培养基中的溴百里芬兰指示剂由绿色变为亮蓝色；如果微生物没有利用柠檬酸且在柠檬酸琼脂上没有生长，则培养基的颜色不发生变化。
15、利用丙二酸盐试验
丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂。
能否利用丙二酸盐，也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。
许多微生物代谢有三羧酸循环，而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节，丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶，与丙二酸不被分解，所以琥珀酸脱氢酶被占据，不能释放出来催化琥珀酸脱氢反应，抑制了三羧酸循环。
接种和观察结果：
用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基，于适温培养1－2d，观察培养基变色情况。
如测定培养基生长并变蓝色，表示可利用丙二酸盐，为阳性结果。
反之，如测定培养基未变色，而空白对照培养基生长，则为阴性，即不利用丙二酸盐。
16、葡萄糖酸盐的氧化
假单胞菌属和肠道杆菌科的细菌，可氧化葡萄糖酸为2－酮基葡萄糖酸。
葡萄糖酸无还原性基团，氧化后形成酮基，则可将斐林氏试剂的呈蓝色的铜盐还原为砖红色的Cu2O沉淀。
试验方法：
用pH7.2的磷酸缓冲液配制成含1％葡萄糖酸盐（可用葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙）的溶液。
分装试管，每管2mL。
刮取适温培养18－24小时的菌苔至2mL的葡萄糖酸盐溶液中制成浓的菌悬液，置30℃过夜，然后每管加入0.5mL的斐林试剂，放在沸水浴中加热10分钟，试管中液体由蓝色变为黄绿，绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反应，如溶液不变色者为阴性。
17、硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验
试验方法：
以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培养18~24h，观察结果。
培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为靛基质阳性。
培养基未接种的下部，可作为对照。
本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。
18、β-半乳糖苷酶（ONPG）的测定
本试验应用于肠肝菌科的鉴定。
测定步骤：
（1）将测定菌接种于TSI斜面上，培养于37℃18h（或其他最适温度）
（2）挑取1大环菌苔入约0.25mL的生理盐水中制成菌悬液，每管加1滴甲苯，摇匀（有助于酶的释放），于37℃放置5分钟。
（3）在菌悬液中加入0.25mL的0.75mol/LONPG，测定管置于37℃水浴培养。
经30分、1、2、3、……24h进行观察，如有黄色者则为阳性。
19、耐盐性试验
本试验是观察渗透压对细菌生长的影响。
由于不同菌类耐盐性不同，故常以此作为鉴别特征。
一般可根据不同种类的菌株，选择其适合生长的培养基，在其中加入不同量的NaCl，接种后观察其生长与否，以判断其耐盐性。
以肉汤培养液根据鉴定需要，配成不同浓度的NaCl，如2％、3.5％、5％、7％、10％等。
培养基要求十分澄清，接种时应采用幼龄菌液，直针接种，适温培养3－7d，与未接种的对照管对比，目测生长情况。
20、卵磷脂酶的测定
菌体如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱。
接种与观察结果：
将测试菌的菌液，环接在有卵黄的试管和不加卵黄的对照管中，适温培养1、3或5天观察。
假若与对照管相比较，在卵黄胰胨液中或表面，形成白色沉淀者，则为阳性反应，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱，说明有卵磷酶的存在。
另一种方法：
以无菌操作取出卵黄，放入灭菌的三角瓶中，加相当于等量的生理盐水摇匀后，取10mL卵黄液加入到溶化的约50－55℃的200mL肉汁胨琼脂培养基中，混合均匀后倒入培养皿，制成卵黄平板，过夜后即可使用。
接种与观察结果：
将测试菌点接在卵黄平板上，每皿可分散点接4－5株菌、（芽孢杆菌以点接1－2株菌为宜）以不影响结果观察为度，如测试厌氧菌，则须在上面加盖无菌的盖玻片。
每株菌至少重复点接两皿。
适温培养1－2d观察，在菌落周围形成乳白色混浊环，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，说明该菌株有卵磷脂酶存在。
21、石蕊牛奶的反应
牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。
石蕊在中性时呈淡紫色，酸性时呈粉红色，碱性呈蓝色，还原时则自上而下地褪色变白。
细菌对牛奶的作用有一下几种：
（1）产酸――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。
（2）产碱――细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。
（3）胨化――细菌产生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶变得比较澄清。
（4）酸凝固――细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变化，当酸度很高时，可使牛奶凝固。
（5）凝乳酶凝固――有些细菌能产生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此时石蕊常呈蓝色或不变色。
（6）还原――细菌生长旺盛，使培养基氧化还原电位降低，因此石蕊还原褪色。
接种与观察结果：
接种待测菌株，适温培养3、5、7d或14d，按上述特征观察和记录牛奶产酸、产碱、凝固或胨化等反应。
培养基：
脱脂乳粉100g溶于1000ml蒸馏水中。
每100ml脱脂牛奶加入4ml浓度为25g/l（石蕊2.5g，100ml蒸馏水，放置一夜或更长时间，过滤）的石蕊牛奶。
分装试管，牛奶高度4-5cm。
113℃高压蒸汽灭菌15-20min。
22、酪素水解试验（酪蛋白水解）
牛奶平板的制备：
取5g脱脂奶粉加入50mL蒸馏水中（或用50mL脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶于50mL蒸馏水中，将两液分开灭菌。
待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。
将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接3－5株菌。
适温培养1、3、5天，记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明。
配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固。
23、酪氨酸水解
将L－酪氨酸0.5g悬浮于10mL蒸馏水中，8磅20分钟灭菌，然后于100mL无菌的营养肉汤琼脂混合，倾倒平板，待凝固后，将测试菌接种于平皿上，培养7到14d，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明。
24、苯丙氨酸脱氨试验
某些细菌（如变形杆菌）具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色。
本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定。
接种与观察结果：
将菌种接种于该培养基斜面上，适温培养3－7d（某些芽孢杆菌须培养21d）。
取10％的FeCl3水溶液4－5滴，滴加在生长菌苔的斜面上，当斜面和试剂液面处呈蓝绿色时为阳性反应，表示从苯丙氨酸形成苯丙酮酸。
25、产糊精结晶试验
某些需氧芽孢杆菌能产生淀粉酶，使淀粉水解为糊精。
该
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