第34章 DNA 的复制和修复.docx

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第34章DNA的复制和修复

第三十四章DNA的复制和修复

第一节DNA的复制

（一）

Ithasnotescapedournoticethatthespecificpairingwehavepostulatedimmediatelysuggestsapossiblecopyingmechanismforthegeneticmaterial.

（一）DNA的半保留复制

DNA半保留复制的实验证据：

1958年Meselson和Stahl的实验

（二）DNA复制的起点和方式

（三）DNA聚合反应有关的酶

1956年Kornberg发现的DNA聚合酶I（100kg大肠杆菌可以分离0.5g纯化的酶），由一条肽链组成，有5′→3′聚合酶活力，5′→3′外切酶活力，和3′→5′外切酶活力。

用蛋白酶水解得到的Klenow片段有3′→5′外切酶活力和5′→3′聚合酶活力。

DNA聚合酶催化的反应

DNApolymeraseIhasthreeenzymaticactivitiesinasinglepolypeptidechain,whichcanbecleavedintotwofunctionalpartsbymildproteasetreatment.

DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA的相互作用

DNA聚合酶I的校对作用

DNA聚合酶I的5′y3′外切酶可以从单链切口的5′末端切除核苷酸，5′y3′聚合酶可以用脱氧核苷酸填补缺口。

DNA聚合酶Ⅲ的结构

DNA聚合酶Ⅲ的â亚基二聚体与DNA结合的空间关系（顶部观）

DNA聚合酶Ⅲ的â亚基二聚体与DNA结合的空间关系（立体图）

DNA聚合酶Ⅱ有不少于7个亚基，可能参与DNA的修复，1999年发现的DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ可以复制有较多损伤的DNA。

DNA连接酶的作用机制。

细菌的DNA连接酶以NAD为能源，动物细胞和噬菌体的连接酶以ATP为能源。

T4的DNA连接酶可以连接平末端。

（四）DNA的半不连续复制

从寻找失踪的酶到同位素脉冲标记发现冈崎片断

第一节DNA的复制

（二）

（五）DNA复制的拓扑性质

拓扑异构酶Ⅰ可以消除负超螺旋，对正超螺旋无作用。

拓扑异构酶Ⅱ可以在消耗ATP的条件下连续的引入负超螺旋，在无ATP消耗的条件下，可以松弛负超螺旋。

真核生物的拓扑异构酶Ⅰ可以消除负超螺旋，也可以消除正超螺旋。

真核生物的拓扑异构酶Ⅱ（分为α和β两种）可以消除负超螺旋和正超螺旋，但不能引入负超螺旋。

拓扑异构酶Ⅰ主要和转录有关。

拓扑异构酶Ⅱ主要与复制有关。

拓扑异构酶Ⅱ引入负超螺旋可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力。

双螺旋的解开需要解螺旋酶参与。

DnaB是一种解螺旋酶，沿模板链的5′y3′方向移动，由ATP供能，可能参与复制。

解螺旋酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ沿模板链的5′y3′方向移动，rep蛋白沿3′y5′方向移动，这几种解螺旋酶可能与修复作用有关。

SSB可以稳定单链，与单链的结合有协同效应。

（六）DNA复制的过程

复制的起始

大肠杆菌DNA复制的步骤

大肠杆菌DNA复制时冈崎片段的合成步骤

复制的延伸

复制的终止

（七）真核生物DNA的复制

DNAreplicationineukaryoticcellsuseessentiallythesameprinciplesbutbeingmorecomplexinthedetails.

ThebestunderstoodeukaryoticreplicationsystemisthatofSV40andyeast.

FormationoftheRNAprimersandtheinitialincorporationofdeoxynucleotidesarebelievedtobecatalyzedbyDNApolymeraseα（whichhasnoproofreadingactivity）.

LaterchainextensionisbelievedtobecatalyzedbyDNApolymeraseä,whichhasproofreadingactivityandisclampedontotheDNAtemplatesviathePCNAtrimerrings.

Specificsequences（~150bp）thatcanfunctionasreplicationoriginshaveonlybeenidentifiedinyeast（iscalledautonomouslyreplicatingsequences,orARS）andSV40virus.

TherateofDNAsynthesisineukaryoticcellsisaboutonetenthofthatoftheE.colicells.

Replicationintheeukaryoticgenomesbeginatmanyreplicationorigins.

9purifiedproteinsareneededtoreplicateSV40virusDNAinvitro.

Tantigen：

amultifunctionalsite-specificDNAbindingproteinencodedbySV40DNA,bindstotheorigin（asDnaA）andmeltstheduplexDNA（asDnaB）;

RPA：

encodedbythehostmammaliancellsandbindstothemeltedsingle-strandedDNA（asSSB）.

Polα/primase：

synthesizestheRNAprimersandastretchofDNAsequences,hasnoproofreadingactivity.

Polä–replacesPolα/primasetofurtherextendtheRNA-DNAstrand,hasproofreadingactivity.

PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）：

atrimericring-shapedproteinthatclampsPoläontotheDNAemplate.

RFC（replicationfactorC）：

aclamploaderforPCNA.

Topoisomerases：

Relievesthetorsionalstraininducedbythegrowingreplicationfork.

Ligases：

joinstheOkazakifragments（whichismuchshorterthanthoseinE.colicells）,aswellastheleadingstrand.

几种真核细胞的DNA聚合酶的性质如表中所示，体外或者是体内的实验均证明，DNA聚合酶α和δ可以被抑制剂2＇3＇-双脱氧胸苷和蚜肠霉素抑制，这些结果可以说明它们是DNA的复制酶。

DNA聚合酶α主要是用来起始链的合成，而DNA聚合酶δ则是用来延伸新生成的链的。

另外两种DNA聚合酶ε和β，则主要是用来参与修复反应的。

而DNA聚合酶γ则是负责线粒体DNA的复制的。

原核和真核生物复制体系的比较

ModelofinvitroreplicationofSV40DNAbyeukaryoticenzymes:

1.Tantigen（Tag）bindsandunwindsreplicationorigin;

2.RPA（orRFA）bindstosingle-strandedDNA;

3.Polα-primasesynthesizestheprimers（RNA+DNA）.

4.RFCloadsPCNAtothetemplate.

5.PCNAdisplacesPolα-primaseandfunctionsasaDNAclamp;

6.PoläreplacesPol–primaseandfurtherextendstheDNAstrands.

酵母的自主复制区

多个ARS（autonomouslyreplicationgsequence）发挥复制起点的功能。

酵母染色体Ⅳ的着丝粒附近为ARS1序列，ARS1分为A,B,C三个功能区,A,B起主要作用，C起次要作用。

A区为15bp,其中11个保守，称ACS（ARSconsensussequence）。

有复制起始子的功能。

B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区。

B3是ABF1（ARS-bindingfactor1）结合区。

ORC（originrecognizingcomplex）：

由6个亚基组成相当于DnaA和λ的O蛋白，与A/B1结合后结合于游离的DNA。

Cdc6:

相当于DnaC,及λ的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。

这对于在Origin上起始复制是必须的。

Mcm:

DnaB螺旋酶。

即licensingfactor.

ABF1：

（转录因子）结合于B3.

酵母DNA复制的起始

PCNA（增殖细胞核抗原）三聚体的结构与原核生物DNA聚合酶Ⅲ的β亚基二聚体相似。

真核生物DNA复制的模式

以下图示（a）为滞后链末端的引物被切除后会形成缺口，图示（b）为端粒酶可以加长DNA的末端。

第二节DNA的损伤修复

（一）错配修复

大肠杆菌的Dam甲基化酶可以使DNA的GATC序列中A的N6甲基化，新合成的链在短期内未能甲基化，如果有错配碱基对，则需切除新合成链的错配区，MutS二聚体识别并结合到错配碱基部位，mutL二聚体与MutS结合，使DNA形成突环，复合体随ATP水解而移动，直至遇到GATC序列，随后核酸内切酶MutH结合到MutSL上，将未甲基化链GATC位点G的5´端切开，若切开处位于错配碱基的3´侧，则由核酸外切酶Ⅰ或核酸外切酶X沿3´→5´方向切除核酸链。

若切开处位于错配碱基的5´侧，则由核酸外切酶Ⅶ或RecJ沿5´→3´方向切除核酸链，新的DNA链由DNA聚合酶Ⅲ和连接酶合成并连接。

在切除链的过程中，解螺旋酶Ⅱ和SSB帮助链的解开。

人类的hMSH2和hMLH1基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌的MutS和MutL相对应，错配修复的过程与大肠杆菌相似。

（二）直接修复

胸腺嘧啶二聚体的形成

从单细胞生物到鸟类都存在光复活酶，但高等哺乳动物却没有光复活酶，其胸腺嘧啶二聚体需要通过切除才能修复。

（三）切除修复

（四）重组修复

（五）应急反应（SOS）和易错修复

重组蛋白A，在有单链DNA和ATP存在时被激活，并促进LexA的蛋白水解酶活性，因而可被称作辅蛋白酶。

LexA的分解使umuDC基因表达DNA聚合酶V，dinB基因表达DNA聚合酶Ⅳ，uvrA,B,O分别表达切除酶的亚基，此外，促进一些其他基因的表达，使有差错的基因可以复制，并在随后被修复。

图中LexA是多种基因的抑制剂。

第三节DNA的突变

（一）突变的类型

碱基对的置换：

两种嘌呤或两种嘧啶之间的互换称作转换；嘌呤与嘧啶之间的互换称作颠换。

引起氨基酸改变称作错义突变；氨基酸密码子变为终止密码子称作无义突变；不引起氨基酸改变称作中性突变。

移码突变：

一个或多个非三整数倍核苷酸的插入引起阅读框的改变，通常使基因产物完全失活，出现终止码会使翻译提前终止。

（二）诱变剂的作用

1．碱基类似物

如5-溴尿嘧啶，酮式与腺嘌呤配对，稀醇式与鸟嘌呤配对，结果使A-T变为G-C，相反则可将G-C变为A-T。

2-巯基嘌呤是腺嘌呤的类似物，通常与胸腺嘧啶配对，以罕见的亚氨基状态存在时，可以与胞嘧啶配对，使A-T变为G-C，相反则可将G-C变为A-T。

2．碱基的修饰剂

3．嵌入染料

如丫啶类，原黄素，溴化乙锭等可插入碱基对之间，引起核苷酸的插入或缺失。

4．紫外线和电离辐射

紫外线可以使相邻嘧啶之间形成环丁烷结构的二聚体；电离辐射产生的自由基可以使核苷酸链断裂。

自由基可以破坏糖环，打断多核苷酸链。

自由基可以破坏糖环，打断多核苷酸链。

形成错配碱基对的机制

（三）诱变剂和致癌剂的检测

某些调节正常细胞分裂的基因，突变后会使细胞生长失控成为肿瘤，这样的基因突变前称作原癌基因，

突变后称作癌基因。

抑癌基因可以抑制细胞的恶性生长，突变后会使癌症的发病率增加。

Ames实验是检验致癌剂的常用方法，将鼠伤寒沙门氏杆菌组氨酸营养缺陷型菌株接种到含待测物的无组氨酸培养基平皿中，若待测物含有诱变剂，可发生恢复突变，长出的菌落多少可以反映诱变剂的强弱。

大肠杆菌的SOS反应可以使溶原态的λ噬菌体激活，使宿主菌裂解产生噬菌斑，引起细菌SOS反应的化合物对高等动物都是致癌的，用这一方法检测致癌剂，可以大大简化检测方法。