基因工程讲义.docx
《基因工程讲义.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程讲义.docx（94页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
基因工程讲义
基因工程讲义
第一章绪 论…………………………………………………3
一、基因工程的诞生…………………………………………………3
二、基因工程的成就…………………………………………………5
三、基因工程安全性的问题…………………………………………6
四、基因工程研究的内容……………………………………………8
第二章基因克隆所需的工具酶……………………………12
一、限制性内切酶（restrictionenzyme）………………………………12
二、DNA连接酶……………………………………………………20
三、DNA聚合酶……………………………………………………24
四、逆转录酶………………………………………………………27
第三章基因的克隆载体 ……………………………………28
一、质粒载体………………………………………………………28
二、大肠杆菌质粒载体……………………………………………30
三、λ噬菌体载体……………………………………………………33
四、粘粒载体（柯斯质粒载体）……………………………………35
第四章目的基因的分离克隆 ………………………………38
第一节化学法合成目的基因…………………………………………38
第二节 PCR技术在基因克隆中的应用………………………………38
一、PCR基本技术…………………………………………………38
二、PCR技术在基因克隆方面的应用………………………………42
第三节基因文库技术分离目的基因…………………………………45
一、 基因文库的类别…………………………………………………46
二、核基因组文库构建………………………………………………48
三、利用PCR技术构建cDNA文库…………………………………49
四、应用差别杂交或扣除杂交法构建cDNA文库……………………49
五、人工染色体文库…………………………………………………50
第五章重组体的构建、转化及鉴定…………………………54
一、质粒DNA的分离纯化…………………………………………54
二、目的基因与载体的连接…………………………………………54
三、重组体向宿主细胞的导入………………………………………54
四、含重组质粒的细菌菌落的鉴定……………………………………56
第六章克隆基因的表达………………………………………59
第一节 外源基因在原核细胞中的表达………………………………60
一、原核生物基因表达的特点………………………………………60
二、基因表达的调控序列……………………………………………61
三、几种类型的原核表达载体………………………………………62
四、提高克隆基因表达效率的途径…………………………………63
第二节 外源基因在真核细胞中的表达………………………………68
一、真核细胞基因克隆载体…………………………………………68
第三节外源基因导入真核细胞的方法…………………………………72
第七章重组体的筛选与鉴定…………………………………76
一、遗传检测法……………………………………………………76
二、物理检测法……………………………………………………78
三、核酸杂交筛选法…………………………………………………79
四、免疫化学检测法…………………………………………………80
五、DNA—蛋白质筛选法……………………………………………81
《基因工程》课程教学大纲
适用专业生物科学，生物技术
预修课程普通生物学、遗传学、生物化学、分子生物学
一、编写说明
（一）本课程的性质、地位和作用
自本世纪70年代基因工程诞生以来，在不到30年的时间内，已取得许多激动人心的成就，并继续向前迅猛发展，成为当今生物科学研究领域中最具生命力、最引人注目的前沿学科之一。
基因工程学的出现，给社会发展带来了深刻的影响。
许多国家都已把基因工程列为优先发展的高科技项目。
本课程主要介绍基因操作的主要技术原理，基因操作的工具酶，克隆载体，目的基因的分离方法，重组体的构建及导入，克隆基因的表达与检测，基因工程研究进展，存在问题及新策略等内容，使学生具备基因工程方面的基本知识和掌握基因工程基本的操作技术。
（二）本大纲制订的依据
基因工程是生物学科中的高级课程，主要针对高年级本科生和研究生开设。
学生在此之前需要掌握普通生物学、遗传学、生物化学、分子生物学等方面的专业知识，以及分析化学、有机化学、无机化学、大学物理等方面的基本知识。
（三）大纲内容选编原则和要求
（四）实践环节
（六）考核方法与要求
⒈平时成绩：
0%
⒉实验成绩：
0%
⒊试卷成绩：
100%，
⒋综合考核成绩
（七）教材与主要参考书
教材：
自编讲义
主要参考书：
1.基因工程，邱泽生，首都师范大学出版社，1992
2.基因工程原理（上下册），吴乃虎，科学出版社，2001
3.植物基因工程，王关林，方宏筠，科学出版社，1999
4.基因工程学原理，马建岗，西安交通大学出版社，2001
第一章绪 论
在研究生物演化的过程中，遗传和变异是两个重要的概念。
遗传性赋予生物种的稳定，保证生物种的延续不断。
变异性赋于生物种的进化，保证生物种对各种环境的适应。
在生物演变的长河中，自然发生的变异是非常缓慢的，随着生物科学的发展，人类开始学会干预生物的变异，经典遗传学的出现，使人们在几年至几十年内便可实现在自然界中需要千百万年才能出现的变异．从而改变了某些物种，有利于人类。
从本世纪70年代初，基因工程学诞生，在短短不过30年的时间内已经取得了许多激动人心的成果。
它的最大特点，就是以重组DNA的技术，开辟了在短时间内改造生物遗传性的新天地。
它填补了生物种属间不可逾越的鸿沟，克服了常规育种的盲目性，使人类有可能按照需要定向培育生物新品种、新类型乃至创造自然界从未有过的新生物。
目前，基因工程正以新的势头迅猛发展，成为当今生物科学研究领域中最有生命力、最引人注目的前沿科学之一。
一、基因工程的诞生
（一）基因工程的诞生
基因工程诞生于1973年，它是数十年来无数科学家辛勤劳动的成果、智慧的结晶。
从40年代开始，科学家们从理论和技术两方面为基因工程的产生奠定了坚实的基础。
概括起来，从40年代到70年代初的基因工程诞生，在现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用：
1．理论上的三大发现
（1）40年代发现了生物的遗传物质是DNA。
l934年，Avery在美国的一次学术会上首次报道了著名的肺炎球菌的转化实验结果。
超越时代的科学成就，往往不容易很快被人接受，Avery的论文没有得到公认。
事隔十年，这一成果才得以公开发表。
事实上，Avery不仅证明DNA是生物的遗传物质，而且也证明了DNA可以把一个细菌的性状转给另一个细菌，理论意义十分重大。
正如诺贝尔奖金获得者Lede-rbevg指出的，Avery的工作是现代生物科学的革命开端，也可以说是基因工程的先导。
（2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。
1953年，Walson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型。
对生命科学的发展，足以和达尔文学说、盂德尔定律相提并论。
（3）60年代确定了遗传信息的传递方式。
确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸。
到了1966年，破译了64个密码子，编排了一本密码字典，叙述了中心法则。
从此，千百年来神秘的遗传现象，在分子水平上得到了揭示。
2．技术上的三大发明
（1）限制性核酸内切酶的发现
从40年代到60年代，虽然从理论上已经确立了基因工程的可能性，科学家们也为基因工程设计了一幅美好的蓝图。
但是，科学家们面对着庞大的双链DNA（dsDNA），尤其是真核生物，其DNA分子是相当巨大的，仍然是束手无策，不能把它切成单个的基因片段。
尽管那时酶学知识已得到相当的发展，但没有任何一种酶能对DNA进行有效的切割。
直到1970年，Smith和wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶HindIII，使DNA分子的切割成为可能。
1972年Boyer实验室又发现了名叫EcoRI的核酸内切酶，这种酶每遇到GAATTC序列，就会将双链DNA分子切开形成DNA片段。
以后，又相继发现了大量类似于EeoRI这样的限制性核酸内切酶，这就使研究者可以获得所需的DNA特殊片段，为基因工程提供了技术基础。
（2） 对基因工程技术的突破的另一发现是DNA连接酶的发现
1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。
这种酶能够参与DNA缺口的修复。
1970年，美国的Khorana实验室发现了一种叫T4DNA连接酶，具有更高的连接活性。
（3）基因工程载体的发现
科学家有了对DNA切割与连接的工具（酶），还不能完成DNA体外重组的工作。
因为大多数DNA片段不具备自我复制的能力。
所以，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，必须将DNA片段连接到一种特定的、具有自我复制的DNA分子上。
这种DNA分子就是基因工程载体（Vector）。
基因工程的载体研究先于限制性核酸内切酶。
从1946年起，Lederberg开始研究细菌的性因子～F因子，经过50和60年代，相继发现其它质粒，如抗药性因子（R因子），大肠杆菌素因子（CoE）。
到1973年，Cohen将质粒作为基因工程的载体使用。
具备了以上的理论与技术基础，基因工程诞生的条件已经成熟。
两位科学的“助产士’——Berg和Cohen把基因工程接到了人间。
．
1972年，美国斯坦福大学的P．Berg领导的研究小组，在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。
他们使用限制性内切酶EcoRI，在体外对猿猴病毒SV40的DNA和λ噬菌体的DNA分别进行酶切，然后再用T4DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来，结果获得了包含有SV40和λDNA重组的杂种DNA分子。
（基因工程的雏形）
1973年，斯坦福大学的S．Cohen等人，也成功地进行了另一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。
他们将大肠杆菌（E．Coli）的抗四环素（TCr）质粒PSCl01和抗新霉索（Ner）及抗磺胺（Sr）的质粒R6一3，在体外用限制性内切酶EcoRI切割，连接成新的重组质粒，然后转化到大肠杆菌中。
结果在含四环素和新霉素的平板中，选出了抗四环素和抗新霉素的重组菌落这是基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子。
基因工程从此诞生，这一年被定为基因工程诞生的元年。
二、基因工程的成就
基因工程是一门创造性的科学，有着惊人的发展潜力和广阔的应用前景。
基因工程诞生30年来，已经带来了一批突破性的成果，有些已在人们的生产和生活中作出了重大贡献。
基因工程从1977年起出现了飞跃的发展。
在这一年中，遗传工程取得了一项震撼人心的重要成果。
例如：
（1）Itakara等使化学合成的激素抑制素基因与大肠杆菌β一半乳糖（苷）酶基因和PBR322质粒重组到一起，然后转化到大肠杆菌中，结果产生出含激素抑制素的嵌合型蛋白质，经溴化氰处理后，有活性的激素抑制素便释放出来。
这是真核生物的人造基因首次在原核生物中表达，这一成果的取得大大增强了人们对遗传工程的兴趣和信心。
他们用价值几美元的9升培养液生产出50毫克的生物活性物质，相当于50万头羊脑的提取量，意义非常重大。
（2）1978年，Goedd．1等使化学合成的人胰岛素基因在大肠杆菌中表达，他们将人胰岛索两条肽链的基因引入到大肠轩菌，培养后大肠杆菌产生了人胰岛素的A链和B链，经二硫键连接后形成人胰岛索分子。
有人估计，全世界约有六千万名糖尿病患者，用猪和牛的胰脏提取的胰岛素已经不能满足他们的需要。
因此，人胰岛素基因在大肠杆菌中表达成功，使胰岛素的人工大量合成成为可能，为广大的糖尿病患者带来了福音。
（3）1979年，Gooddel等使人生长激素基因在大肠杆菌中表达成功。
人生长激素由191个氨基酸组成，能促进几童生长，治疗侏儒症。
医用人生长激素是从人尸体的脑下垂体分离获得的，来源极为有限。
遗传工程菌能产生人生长激素，为这种激素开辟了广阔的来源。
（4）1980年，Nagata等使干扰素基因在大肠杆菌中表达成功。
干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的作用。
用遗传工程菌大量生产干扰素，获得成功，使大规模临床试验成为可能。
此外，日本的科技人员使大豆的遗传基因插入大肠杆菌的质粒中，人工合成大豆蛋白获得成功。
美国Abbott公司用基因工程方法使大肠杆菌产生出人体尿激酶。
（5）1981年，从遗传工程菌获得的新产物有动物口蹄疫疫苗，乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原以及牛生长激素等。
上述产物的获得，对人乙型肝炎的诊断和防治，饲养动物的口蹄疫防治以及提高牛肉牛奶的产量具有重要意义。
我国乙型肝炎病毒（HBV）基因工程研究工作自1983年开始。
上海生化所，中国预防医学科学院病毒所，中国医学科学院基础所，军事医学科学院以及上海生物制品所等许多单位相继开展了HBV的分子克隆和DNA全序列测定、基因定位等理论工作。
军事医学科学院还用E．coli生产HBcAg作为肝炎的诊断试剂出售。
但一般来说，表达的水平都不太高。
可以预料，用基因工程疫苗治疗乙肝的日子已为期不远。
三、基因工程安全性的问题
从基因工程诞生之日起，受到人类的极大关注。
其理论和实践的意义都非常重大，但和任何新生事物一样，其成长过程中也遇到了强大的阻力。
基因工程刚诞生的头几年，人们对它有不少争论。
举几个简单的例子：
1．人们担心“基因逃逸”问题，由于微生物之间通过转导、转化、接合进行基因转移。
“有害”基因是否会逃逸到人体或环境中。
科学家们经常使用大肠杆菌作为宿主菌。
重组质粒转入大肠杆菌中表达，人们担心大肠杆菌会通过研究者的消化道带出实验室。
经过连续两年对研究人员的粪便检查，均未发现大肠杆菌和质粒。
2．前段时间英国“多莉”的死亡。
希特勒。
美国科幻电影。
3．对转基因食品的安全性的问题。
随着全球人口增多，粮食紧张的问题日益严重。
许多生物学家致力于高产、高质的农作物。
提高农作物产量的方法主要有2方面：
一方面发现高产农作物（不大可能）；另一方面减少农作物生长中的损失（旱、涝、病毒、虫，腐烂等）。
目前，植物基因工程方面使用技术就是从其他物种上分离有效的基因，然后转移到农作物上（例如：
现在已有的，抗虫棉，水稻，土豆，西红柿，大豆，玉米等）。
现在产生的问题是，安全性问题。
特别是人们将大量的食用转基因食品，其安全性问题应该引起高度重视和科学地评价，确保人民健康，才能使基因工程顺利发展。
转基因植物食品的安全性主要包括2方面：
（1） 转基因植物食品有无毒性物质及有无过敏性蛋白。
① 目的基因编码已知的过敏蛋白；
（2）食品安全性中的另一个重要问题是标记基因的安全性评价。
nptⅡ（新霉素磷酸转移酶基因）、hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）、gent（乙酰转移酶基因）及抗除莠剂的基因在转基因植物中得到高表达，人们食用大量转基因食品是否可能对抗生素产生抗药性。
4．基因工程与生态环境平衡
转基因作物栽到大田后，会不会和野生亲缘植物自然杂交，导致野生亲缘植物获得抗性，从而影响环境。
而导致产生新的杂草类型。
如除草剂对已俘获了抗除草剂基因的杂草不再具备除草性能；抗虫基因的俘获也许会导致害虫种类交替进化；这些都迫使人们使用更危险的化学药物。
可见转基因植物的大规模种植可能会群落带来极大的不利。
群落的影响不但难以预料，甚至可能产生更严重的后果；俘获了毒蛋白基因会由于食草动物难以伤害它而加剧繁衍蔓延，稀有植物品种也许会由于竞争，同种植物的遗传多样性便会减少，昆虫群落也会受到影响。
从以上例子可以看出，基因工程是个双刃剑，于是许多社会人士、政府官员、甚至科学家发出呼吁，要求制定法规，限制基因工程的研究。
近年来关于转基因植物的安全性问题引起世界性的争论，众说风云，更激起各国的重视投入大量人力、物力进行科学地研究，美国国立卫生研究院（NIH）成立了一个专门委员会处理这些诉颂事宜，并于1975年制定了“通用重组DNA分子研究准则”，尽管已经对基因工程的安全防护作了许多规定，仍有不少科学家联名要求取消危险的实验。
对基因工程争论的焦点是害怕基因工程创造的杂种生物会从实验室逸出，在自然界造成难以控制的危害。
有害的杂种细菌或病毒与化学物质不同，它们会在自然界不断增殖，造成的危害更大。
研究结果表明，从本质上讲转基因植物与常规育种是一样的。
两者都是在原有的基础上对现有品种的某些性状进行修饰，或增加新性状，或者消除不良性状，最后培育出优质高产稳产和抗病、抗逆的新品种，它们的区别只是技术和方法问题。
基因工程只是利用现代分子生物学进行单基因或多个基因的转化，增强了育种的目的性和可操作性I缩短了育种周期，应该说是更科学和更安全。
例如在常规育种时，父母本的不良基因、甚至是有害基因都传递给下一代。
基因工程育种只是把好的基因、有用的基因传递给下一代，使下一代不断优化。
关于目的基因的结构与功能应该进行严格科学地研究和选择，堵截有害基因的使用就可以避免上述安全性的疑虑。
四、基因工程研究的内容
1．定义
基因工程产生以来，还没有一个统一的公认定义。
一般认为基因工程是指：
把体外核酸分子（无论采取什么方法从细胞中取得）组合到任何病毒、细菌质粒或其它载体系统（分子），形成遗传物质的新组合，并使之进入到原来没有这类分子的宿主体内，而能持续稳定地繁殖。
或者说，它是对DNA大分子上的遗传单元（基因）进行体外操作，把不同来源的基因按照设计的蓝图，重新构成新的基因组（即重组体），再把它引入细胞中，构成具有新的遗传特性的生物。
从上面定义可以看出基因工程的一个重要特征，就是强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。
这种DNA分子的新组合是按照工程学的方法进行设计和操作的。
这就赋于基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种间的限制，扩大和带来了定向创造新生物的可能性，这是基因工程的最大特点。
基因工程问世以来，各种相关的名称相继问世。
在文献中常见的有遗传工程（Geneticemgineering）、基因工程（Geneengineering），基因操作（Genemanipulation）、重组DNA技术（RecombianantDNAtechnique）、分子克隆（Molecularcloning）、基因克隆（Genecloning）等，这些术语所代表的具体内容彼此具有相关性，在许多场合下被混同使用，难以严格区分。
不过它们之间还是存在一定的区别的。
例如，遗传工程比基因工程有更广泛的内容，凡是人工改造生物遗传性的技术如物理化学诱变、细胞融合、花粉培育、常规育种、有性杂交等，还包括基因工程在内。
因此，遗传工程包括基因工程，遗传工程不等于基因工程。
又如重组DNA技术，它是基因工程的核心内容，但严格地说，基因工程除上述的定义所阐明的内容以外，还应包括体外DNA突变，体内基因操作以及基因的化学合成等。
总之，凡是在基因水平上操作而改变生物遗传性的技术都属于基因工程。
而重组DNA技术不等于就代表基因工程。
至于生物工程，它是更大范围内改造生物并生产生物产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，除遗传工程、基因工程外，还有酶学工程，细胞工程、发酵工程、农业工程等。
克隆（Clone）一词有必要加以解释。
当它作为名词使用时，是指从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代，或具有相同遗传性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。
当克隆作动词使用时，是指从同一祖先生产这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。
因此，基因工程也可称为基因克隆或DNA分子克隆。
2．基因工程研究的内容包括以下几个主要内容或步骤
（1）从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。
（2）在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。
（3）将重组DNA分子引入到受体细胞（亦称宿主细胞或寄主细胞）。
（4）带有重组体的细胞扩增，获得大量的细胞繁殖群体（菌落）。
（5）从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。
（6）将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析；
（7）将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
表1 重组DNA技术发展史的某些重要事件
年份 重 要 事 件
1869 F．Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA
1944 0．T．Avery等人在肺炎链球菌转化实验中发现遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质
1953 J．D．Watson和F．H．C．Crick在R．Franklin和M．Wilkins的x一射线工作的基础上提出了关于DNA分子结构的双螺旋模型
1957 A．Kornberg在大肠杆菌中发现DNA聚合酶I。
这是可在试管中合成DNA的头一种核酸酶。
现在这种酶已被用来制备标记的DNA探针
1958 M．Meselson和F．w．Stahl证实DNA的复制涉及到双螺旋分子两条互补链的分离过程，提出了DNA半保留复制模型
1961 M．w．Nirenberg等人应用合成的信使RNA分子[poly（u）]破译出了第一批遗传密码F．Jacob和J．Monod提出了调节基因表达的操纵子模型
1965 S.W.Holley完成了第一个酵母丙氨酸tRNA的核苷酸全序列测定
1966 M．w．Nirenberg，S.Ochoa和H．G．Khorana共同破译了全部的遗传密码
1967 发现了可将DNA链连接起来的DNA连接酶
1970 H．O．Smith，K．w．Wilcox，T．J．Kelley分离到第一种核酸内切限制酶，
1973 以H．Boyer，P．Berg等人为代表的一批美国科学家发展了关于重组DNA技术。
并于1972年得到了第一个重组的DNA分子，1973完成头一个细菌基因的克隆
1975 F．Sanger以及A．Maxam和w．Gilbert发明了快速的DNA序列测定技术。
1977年第一个全长5387bp的噬菌体ФX174基因组测定完成
1978 首次实现了通过大肠杆菌生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素
1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以获得专利
1981 R．D．Palmiter和R．L．Brinster成功获得第一个转基因小鼠；A．c．Spradling和G·M·Rubin培育出转基因果蝇
1982 第一个由基因工程菌生产的药物一胰岛素，在美国和英国获准使用
1983 头一个表达其它种植物基因（一个基因）的转基因植物培育成功
1985 头一批转基因的家畜（兔、猪和羊）诞生
1986 基因工程生物首次在控制的情况下实验性地释放到环境中
1988 J·D·watson出任“人类基因组计划”首席科学家，协调举世瞩目的人类基因组测序工作的进行
1994 基因工程西红柿在美国上市
1995 自然杂志汇集发表了人基因组全物理图，以及3号、16号和22号人染色体的高密度物理图
1996
升级会员 