细胞生物学实验指导蚌埠医学院清洗配置细胞原代培养.docx
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细胞生物学实验指导蚌埠医学院清洗配置细胞原代培养
实验九培养器皿的清洗和消毒
【实验目的】
掌握细胞培养所需器械、器皿的清洗和消毒方法；
掌握细胞培养常用器材的包装要领和要求；
掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作；
了解化学消毒法的使用方法。
【实验原理】
清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质，哪怕残留0．1单位，也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
【器材与试剂】
1.玻璃器皿：
移液管、离心管、培养瓶、玻璃瓶、培养皿、大橡皮塞、培养瓶盖。
2.实验器械：
眼科剪、眼科镊。
3.仪器：
超净工作台、干燥箱、高压蒸汽消毒锅，过滤器，过滤泵。
4.试剂：
75%酒精、0.2%新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸。
5.材料：
无臭氧型紫外灯，微孔滤膜（直径25）：
孔径为0．22μm，微孔滤膜（直径90）：
孔径为0．22μm，过滤器（直径25）
【实验步骤】
一、清洗
1．玻璃器皿的清洗
玻璃器皿清洗后不仅要求透明、无污迹，而且不能残留任何物质。
某些化学物质仅残留百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。
因此清洗质量的好坏直接影响到细胞培养成功与否，必须严格按照清洗的程序进行，以保证达到清洗的目的。
一般玻璃器皿清洗的程序包括：
浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。
（1）浸泡
初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或溶解。
新的玻璃器皿使用前应先用自来水简单刷洗，然后用5%稀盐酸溶液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。
用过的玻璃器皿往往粘有大量蛋白质，干燥后不易刷洗掉，故用后立即浸入清水中刷洗。
（2）刷洗
将浸泡后的玻璃器皿放到洗涤剂（不用含沙粒的洗衣粉）水中，用软毛刷反复刷洗，注意不留死角，洗后晾干备浸酸。
（3）浸酸
刷洗不掉的微量杂质经过浓硫酸和重铬酸钾清洁液的强氧化作用后，可被除掉，而且对玻璃器皿无腐蚀作用，去污能力很强，是清洗过程中关键的一环。
清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成。
浸泡时，器皿要充满清洁液，勿留气泡。
浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。
清洁液一般可配制三种强度，配方如下：
[强液]
重铬酸钾63g
浓硫酸1000ml
蒸馏水200ml
[次强液]
重铬酸钾120g
浓硫酸200ml
蒸馏水1000ml
[弱液]
重铬酸钾100g
浓硫酸100ml
蒸馏水1000ml
配制清洁液时，应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，注意保护好面部和身体裸露部分。
配制过程中，可使重铬酸钾溶于水中（有时不能完全溶解，可加热溶解重铬酸钾）。
待重铬酸钾溶液冷却后，慢慢加入浓硫酸（工业用酸即可）。
注意！
只能将浓硫酸缓慢加入水溶液中，若注入过急产热量大，易发生危险，切忌反向操作，以免浓硫酸溅出伤人。
配制容器应用陶瓷或耐酸塑料制品。
配成后的清洁液呈棕红色，经长时间使用后，因有机溶剂和水分增多渐变成绿色，表明已失效，应重新配制。
旧清洁液仍有腐蚀作用，严禁乱倒，宜深埋土中。
（4）冲洗
刷洗和浸酸后都必须用水充分冲洗，使之不留任何残迹。
冲洗宜用洗涤装置，亦可用手工操作，每瓶都得用水灌满，倒掉，重复十五次以上，最后再用蒸馏水漂洗2～3次，晾干备用。
2．橡胶制品的清洗
新购置的橡胶制品带有大量滑石粉应先用自来水冲洗干净后，再作常规清洗处理。
常规处理方法是：
每次使用后的橡胶制品都要置入水中浸泡，以便集中处理和避免附着物干涸，然后用2%NaOH液煮沸10～20分钟，以除掉培养中的蛋白质。
自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水各冲洗2～3次，晾干备用。
用过的胶塞的清洗方法基本同清洗玻璃器皿，但胶塞刷洗的重点部位是胶塞使用面，逐个刷洗。
3．塑料制品的清洗
塑料制品的特点是：
质地软、不耐热。
目前常用的塑料制品是经过消毒灭菌密封包装的商品，用时打开包装即可，是一次性使用物品。
必要时，用后经过清洗和无菌处理后，也可反复使用2～3次，但不宜过多。
清洗程序为使用后应即刻浸入水中严防附着物干涸，不宜用毛刷刷洗，以防划痕出现，如残留有附着物可用脱脂棉轻轻擦拭，用流水冲洗干净，晾干，再用2%NaOH液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，然后用5%盐酸溶液浸泡30分钟，随后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水漂洗5～6次，晾干后备用。
4．金属器具的清洗
组织细胞培养所用金属器具主要是一些手术刀、剪、镊子、针等，这些器具使用后应立即用酒精擦洗干净，晾干后备用。
二、包装
包装的目的是防止器皿器具消毒灭菌后再次遭受污染，所以这些培养用品在消毒处理前要经严格的包装。
清洗后的器皿可先放入鼓风干燥箱中烘干（塑料和橡胶制品不能放入干燥箱），或置于通风无尘处自然晾干，然后包装起来，再做消毒处理。
包装后的器皿应便于消毒和储存。
包装材料常用牛皮纸、棉布和棉线等，包装后的培养用品装入铝饭盒或不锈钢饭盒及金属制的消毒筒内。
三、器皿器具及环境的消毒
对组织细胞培养实验最危险的是发生包括细菌、真菌和病毒等微生物的污染，它们都能直接影响实验结果。
污染主要是由于操作者的疏忽而引起的，如操作台表面或周围空气不洁、培养器皿器具和培养液消毒灭菌不彻底或存放过久等。
有时一两个培养物发生污染，可能累及整个实验室，不得不防。
因而，组织细胞培养的每个环节都应采取严格的消毒措施，以防止发生污染。
消毒灭菌方法因物品材质及环境的不同而异。
消毒方法分为三类：
即物理消毒法、化学消毒法和抗生素抑菌法。
1．物理消毒法
（1）高温湿热消毒：
即高压蒸汽消毒，实验室一般采用高压灭菌锅消毒，是最有效的方法之一。
适合于玻璃器皿、金属器具、橡胶制品、布质类以及耐热的无机离子平衡液等的消毒。
其方法是先将消毒锅洗净，放入适量的水（水面必须盖过电热管，以防电热管干裂）。
然后将所需消毒的物品放入消毒锅，消毒物品不能装的太满，以保证消毒器内气体的流通，消毒瓶装液体时，橡皮塞与瓶口之间要加一根通气线，防止瓶内气体受压将瓶塞蹦出。
加上消毒锅盖，拧紧螺栓防止漏气。
在加热升压之前，先要打开排气阀门，排出残留在锅内的冷空气，因此，导气管一定要插到锅底并不能堵塞。
关闭排气阀门，继而开始升压，当达到所需的压力时，通过调节火力大小，使压力稳定在所需数值后开始计算时间。
灭菌后不要立即打开气阀放气以免水气喷出。
要让其自然降温降压至0磅，才能打开气阀。
消毒过程中，消毒者不能离开岗位，要经常检查压力是否恒定，如有偏离应及时调整。
一般消毒锅都装有安全阀门，还是以不超安全限为好，以免影响消毒物品化学性质和发生其他意外。
各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：
培养用液、橡胶制品8磅30分钟
布类、玻璃器皿、金属器具等15磅20分钟
（2）干热消毒：
实验室一般采用干燥箱进行，适用于玻璃器皿的干燥消毒，由于干热传导慢，因此需要升温到160℃和保持90～120分钟，才能杀死细菌芽孢，达到消毒目的。
消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。
（3）过滤消毒：
大多数培养用液，如人工合成培养液、血清、酶溶液等，在高温下会发生变性，失去其生物学功能，必须采用过滤法除菌。
实验室一般主要采用Zeiss滤器。
Zeiss滤器为不锈钢结构，中间可夹一层滤膜，由纤维素制成的微孔滤膜，质地均匀，有0.60um、0.45um和0.22um等几种规格，常用孔径0.22um滤膜过滤一般培养用液而除菌。
注意：
过滤器必须经过湿热消毒，操作过程中，必须将过滤器放在超净工作台上进行，以免发生污染。
（4）紫外线消毒：
紫外线消毒法很方便，效果好，是实验室常用的消毒法，适用于消毒空气、操作台表面和一些不能使用其它方法进行消毒的培养器具（如少量的塑料培养皿、培养板等）培养室的紫外线灯应距地面2.5米，使得每平方厘米有0.06微瓦能量的照射，才能发生有效的消毒作用。
消毒时物品要相互分开，避免遮挡紫外线的照射。
注意：
由于紫外线照射时会产生臭氧以及对细胞、培养液、包括人体都有一定的损伤作用，因此不要一边照射一边操作，以免受伤。
照射30分钟，可达灭菌效果。
（5）熏蒸消毒：
当遇到细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可以用高锰酸钾5—7.5克，加甲醛（40%）10—15毫升，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24小时。
（6）煮沸消毒：
它的优点是简便迅速，缺点是湿度大，消毒后物品不适于长时间保存，这种方法适宜于临时需要消毒的耐热物品，如金属器具和注射器等在水中煮沸20～30分钟，趁热倒去水分即可使用。
但金属器具煮沸后宜马上使用，以防器具生锈。
2．化学消毒法
化学消毒剂，包括新洁尔灭、来苏儿、过氧乙酸和酒精等。
主要适用于那些无法用其它方法消毒的物品，如操作者的皮肤、操作台面及无菌室内的桌椅、墙壁和空气等（可于紫外线配合消毒，互相取长补短）。
实验室最常用的化学消毒剂是0.2%新洁尔灭和70%的酒精，这些消毒剂对皮肤和细胞毒性小，尤其对那些瓶皿开口部位的消毒，效果很好。
过氧乙酸是新近推出的一种消毒剂，消毒能力极强，在0.5%浓度，10分钟即可将芽孢杀灭，可以用作各种物品的表面消毒，使用时需用水稀释后用喷洒和擦拭的方法消毒。
3．抗生素消毒法
抗生素消毒作用主要是抑制液体内的细菌繁殖，因此适用于细胞培养用液的消毒，延长培养用液的有效期。
抗生素种类很多，实验室常用的是青、链霉素混合液也称“双抗”液，其抑菌效果很好。
【注意事项】
1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。
因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。
清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。
千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。
Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。
如没有洗净会影响下一次使用的效果。
2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。
当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。
器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。
金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。
3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。
4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压（如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等）。
5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜（有时可在上面加一层定性滤纸），包好，经高压灭菌后才能使用。
滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。
过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。
压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。
装滤膜时位置要准确。
另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。
6．使用化学消毒法时，配制75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。
来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。
空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。
因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。
【观察与结果】
1．填表9-1各种瓶皿的清洗，并根据教师安排进行清洗。
表9-1各种瓶皿的清洗
瓶皿种类
清洗步骤
注意事项
新玻璃器皿
旧玻璃器皿
胶塞
塑料制品
离心管、加样器吸头
2．填表9-2消毒和灭菌处理方法，并根据教师安排进行消毒。
表9-2消毒和灭菌处理方法
消毒和灭菌方式
消毒和灭菌步骤
注意事项
紫外线消毒
干热灭菌
湿热灭菌
滤过除菌
【思考题】
1．哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
2．紫外线消毒的适用范围和目的是什么?
实验十细胞培养试剂用液的配制与消毒
【实验目的】
熟练掌握各种细胞培养用液的配制方法；
掌握常见试剂的配制及除菌法的操作。
【实验原理】
物质浓度的计算：
以单位体积溶液里所含溶质B的物质的量来表示溶液组成的物理量，叫做溶质B的物质的量浓度
表达式：
物质的量浓度=溶质的物质的量/溶液的体积
cB=nB/V
单位：
mol·L-1或mol·（m3）-1或mmol·L-1等
步骤
实验仪器
一定物质的量浓度溶液配置
概念本身
可测量
溶质质量
计算
称量
托盘天平/药匙
溶解
容量瓶/玻棒
转移
洗涤
容量瓶/玻棒
溶液体积
定容
胶头滴管
摇匀
装瓶贴签
试剂瓶\标签
【器材与试剂】
1.器材：
扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）、纯净水系统、容量瓶、量筒、烧杯等。
2.试剂：
干粉型培养基、RPMI1640、D-Hanks液、胰蛋白酶，青霉素、链霉素、小牛血清、双蒸水、三蒸水等。
【实验步骤】
一、D-Hanks液配制（也可用于其它，如：
Hanks液、PBS的配制）
先配D-Hanks原液
NaCl8.0g
Na2HPO4·2H2O0.06g
KCl0.4g
KH2PO40.06g
蒸馏水100ml
配制时，按配方顺序逐一用水彻底溶解，必须在前一药品完全溶解之后，才能加入下一种药品，原液暂时不用可置4℃冰箱保存。
再配D-Hanks使用液
D-Hanks原液10ml
蒸馏水90ml
加5%NaHCO3，调整PH值至7.2。
将配好的D-Hanks使用液，分装，包扎瓶口，经8磅30分钟或10磅15分钟灭菌后，置4℃冰箱备用。
使用前加双抗于D-Hanks使用液中浓度为1%。
二、0.25%胰蛋白酶液配制
胰蛋白酶0.25g
D-Hanks使用液100ml
先用少量D-Hanks液把胰蛋白酶粉末调成糊状，再加D-Hanks液溶解，用5%NaHCO3调pH至7.6～7.8，用D-Hanks液定容至100ml。
过滤除菌，分装小瓶，置冰箱中-18℃冰冻保存。
三、RPMI1640培养基配制
将干粉型RPMI1640培养基溶于总量1/3的三蒸水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，搅拌使其溶解。
根据产品说明的要求和实验补加和谷氨酰胺和NaHCO3，过滤除菌，分装后置4℃冰箱保存备用。
使用前调pH至7.0，加双抗于培养液中浓度为1%。
使用时加小牛血清。
四、小牛血清的处理
市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体。
将小牛血清放入56℃水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
五、双抗溶液配制
1.青霉素1瓶（80万单位）加4ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。
2.链霉素1瓶（100万单位）加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。
取1和2溶液各0.5ml混合，加入9ml灭菌的D-Hanks液，则成含青、链霉素各1万单位/ml，分装后置4℃冰箱保存备用。
【注意事项】
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。
4、配制首先要保证每种成分都是合格的。
（1）水的质量很关键，最少是三蒸，电阻率在0.1-1.0×10-6Ω•cm以上。
（2）血清等其它营养成分注意看是否在保质期。
5、配制时各成分最好是分开来配，用之前混好，一周之内用完。
（1）最基本的成分配好过滤分装放置4度。
（2）血清用之前再按比例加入。
（3）抗生素也分装保存，用之前加入。
（4）如果配方要求加谷氨酰胺，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
【思考题】
1.如何根据培养物品的质地和培养环境，选择不同的消毒方法？
2.在细胞培养操作过程中，你如何加强无菌操作的观念避免污染？
3.组织块培养时，翻转培养瓶的时间不易过长，为什么？
4.统计分析实验结果并说明本次实验成功或失败的原因。
实验十一细胞的原代培养
【实验目的】
1．掌握动物细胞原代培养的原理及其方法。
2．熟悉消化法培养和组织块培养法的基本操作步骤。
3．掌握原代培养中取材、消化及细胞无菌培养等基本实验操作技术。
【实验原理】
原代培养（primaryculture）是指直接从机体取出组织或细胞后所进行的首次培养。
由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。
利用此方法还可直接服务于临床实践，例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。
原代培养可分为消化法和组织块培养法，这里统一作介绍。
一、培养细胞生长的条件
1细胞的营养需要
a.基本营养物质：
氨基酸、维生素
b.促生长因子等物质
c.此外激素也可有助于细胞生长
培养液（medium）：
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。
血清（FBS，FCS，CS，HS）、合成培养基，如:
DMEM、RPMI1640和HamF12等。
2细胞的生存环境
a.温度:
适宜的温度与取材的动物种类有关
b.气相及pH:
5%CO2；pH:
7.2-7.4。
3无污染及无毒：
无毒是培养细胞的必须条件，细菌，病毒，支原体等。
二、培养细胞的生长方式
1、贴附生长：
必须贴附于支持物表面才能生长。
见于各种实体瘤细胞
2、悬浮生长：
于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。
各种造血系统肿瘤细胞
【器材与试剂】
1．器材：
CO2培养箱、超净工作台、恒温水浴箱、普通离心机、倒置相差显微镜、高压蒸汽消毒锅、除菌滤器、真空泵、解剖剪、解剖镊、培养瓶、培养皿、吸管、小烧杯、离心管、血球计数板、吸管橡皮头、酒精灯、试管架、废液缸、棉球。
2．材料：
胎鼠或新生鼠。
3．试剂：
1640培养液（含20％小牛血清）、0.25％胰蛋白酶液、D-Hanks液、小牛血清、0.4%的台盼蓝染液、双抗（青霉素和链霉素）、75％酒精、2％碘酒。
【实验步骤】
一、消化法培养的基本操作
1．操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，手和临时带进无菌室的物品、工具等均用新洁尔灭浸泡消毒2分钟。
2．将胎鼠或新生鼠处死，然后用75%酒精浸泡消毒数秒，迅速带进入无菌室。
3．将胎鼠或新生鼠置超净工作台上，使其背部朝上，用碘酒棉球擦洗背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。
4．在腰部的后缘，用解剖镊提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤，用镊子将剪开的皮肤拉向两侧。
用解剖剪剪开背部的肌肉，此时，即可见蚕豆状的肾脏，用镊子取出肾脏，放于无菌的已加入D-Hanks液的培养皿中。
5．用D-Hanks液洗涤肾脏，将肾外膜剪破，去肾外膜及脂肪，剪去肾盂部分，用D-Hanks液洗涤肾脏，将洗过的肾脏转移至另一无菌培养皿中，用眼科剪将肾脏剪成1mm3的小块，组织块的大小要尽量一致。
再用D-Hanks液漂洗二次，直到液体澄清。
6．将清洗过的D-Hanks液吸掉，按组织块的体积的5-6倍量加入0.25%的胰蛋白酶溶液，将其吸入无菌的离心管中，置于37℃水浴消化。
消化时间在30分钟左右。
每隔5分钟摇动一次，以便组织块分散开，以利继续消化，直至组织块变的松散，颜色略发白为止。
7．从水浴中取出离心管，将组织块连同胰蛋白酶液倒入一无菌培养皿中，加入一定量的含20%小牛血清的培养基，用吸管反复吹打，直到大部分组织块均分散成细胞悬液为止。
8．然后用吸管小心吸取悬液入离心管（注意不要吸入组织块），1000rpm离心5分钟。
弃去上清液，在离心管中加入一定量的培养液，打匀后吸取少量的细胞悬液进行稀释（根据细胞悬液的浓度决定）、计数。
9．取一副血球计数板，进行细胞计数。
悬液滴入计数室后，静止2～3分钟，待细胞在计数室中下沉后，再在低倍镜下观察计数。
（数计数板四角的大方格内的细胞总数压在格子线上的细胞，根据“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数。
然后按下式计算：
每毫升细胞悬液中的细胞数为：
4大格中的细胞总数/4×104
10．将细胞悬液用培养液稀释至5×105/ml的细胞浓度，每个培养瓶装4ml培养液，盖好橡皮塞，放入37℃CO2培养箱中培养，直至细胞铺满。
二、组织块法培养的基本操作
（前5步操作同消化法培养）
6．用镊子将组织块移入培养瓶中，并均匀地分布在培养瓶内壁表面，翻转培养瓶，并在培养瓶内加入3毫升培养液，盖上培养瓶盖，放入37℃CO2培养箱中培养。
7．4小时后，再翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中继续静止培养，直至细胞铺满。
【注意事项】
1．操作前，提前将操作间和超净工作台内紫外灯打开，消毒杀菌30分钟。
2．进操作间前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。
试剂等瓶口也要擦试。
3.自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
4.．点燃酒精灯，操作在火焰附近进行。
耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
5.手不能在开盖的消毒物品上方活动，双手不能交叉取物。
6.操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
7.不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
8.瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
9．吸溶液的吸管等不能混用。
10．在超净工作台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发或被污染。
11.凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入
【观察与结果】
1.组织块法培养细胞的观察培养24h后，倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来；48h后，可见大量的细胞放射状排列与组织块周围，这些细胞细胞核较大，细胞质内含物少，透明度高，彼此间排列紧密。
靠近组织块的细胞胞体较小，较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态介于圆形与多角形之间。
2.胰蛋白酶消化法培养细胞的观察在倒置显微镜下，可见刚接种于培养瓶中的细胞胞体均成圆形，悬浮于培养液中。
24h后，大多数细胞已贴附于培养瓶底部，胞体伸展，重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多角形上皮性细胞特征。
48h后，细胞开始增殖，细胞数量明显增多，在接种的细胞或细胞团的周围可见有新生的细胞，这些细胞胞体轮廓通常较浅，因内含物少而较为透明。
96h以后，新生的细
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