VPA01000红霉素中二氯甲烷残留检验方法验证方案0112.docx
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VPA01000红霉素中二氯甲烷残留检验方法验证方案0112
红霉素中二氯甲烷和三氯甲烷残留检验方法验证报告
ValidationReportofMethyleneChlorideandChloroformResidue
TestMethodinErythromycin
验证方案编号：
VP-A-012-00
版本号：
00
目录
1.概述2
1.1产品概述2
1.1.1产品名称2
1.1.2产品化学结构式2
1.2方法建立概述2
2.检测方法3
2.1溶剂残留接受标准3
2.2方法描述3
2.2.1仪器3
2.2.2试剂3
2.2.3溶液配制3
2.2.4色谱条件3
2.2.5系统适应性4
2.2.6计算4
3验证内容5
3.1试剂及仪器5
A．检测用试剂5
B．样品5
C．仪器和设备5
3.2验证溶液配制5
3.3操作6
3.4验证项目6
3.4.1．精密度6
3.4.2．线性8
3.4.3回收率8
3.4.4定量限、检测限9
3.4.5．耐用性10
4.验证结果评定与结论11
1.概述
1.1产品概述
1.1.1产品名称
中文名：
红霉素
英文名：
ERYTHROMYCIN
1.1.2产品化学结构式
分子式：
C37H67NO13
结构式：
1.2方法建立概述
我公司生产的红霉素在生产过程中使用了二氯甲烷，该溶剂的测定方法按照VP-A-004-00进行了验证，但是由于使用了FID检测器，对二氯甲烷的灵敏度不高，因此验证结并不是很理想，特别是当二氯甲烷的浓度较低时，准确度难以保证，该方法使用电子捕获检测器（ECD）对二氯甲烷的检测重新验证。
试剂二氯甲烷中含有少量三氯甲烷，因此同时对三氯甲烷也需要检测监控。
色谱系统和条件参照美国药典（USP）467专论和欧洲药典（Ph.Eur）2.4.24专论。
2.检测方法
2.1溶剂残留接受标准
溶剂
二氯甲烷
三氯甲烷
限度
600ppm
60ppm
2.2方法描述
2.2.1仪器
万分之一分析天平Agilent6890NGCwith7694EHeadspace
2.2.2试剂
DMSO（HPLC）；二氯甲烷（AR）；三氯甲烷（AR）
2.2.3溶液配制
—样品溶液：
取样品约0.50g，精密称定，用DMSO溶解，并稀释至50ml；
—溶剂溶液：
取二氯甲烷约3.0g，三氯甲烷约0.3g，精密称定，用DMSO溶解，并稀释至100ml，精密量取1.0ml，用水稀释至100ml,精密量取1.0ml，用水稀释至10ml。
—空白溶液：
按照溶剂溶液的配制方法配制空白溶液，但是没有二氯甲烷和三氯甲烷。
—供试液：
精密量取5.0ml样品溶液+1.0ml空白溶液于20ml顶空瓶中；（三样）
—对照液A：
精密量取5.0ml样品溶液+1.0ml溶剂溶液于20ml顶空瓶中；（三样）
—对照液B：
精密量取5.0mlDMSO+1.0ml空白溶液于20ml顶空瓶中.
2.2.4色谱条件
色谱柱：
DB624，30m×0.32mm×1.8um
载气：
氮气；
流速：
35cm/s；
顶空温度：
样品瓶温105℃；定量环温110℃；传输线温110℃；
进样条件：
加热平衡45min，样品瓶加压0.5min，定量环充样0.03min，定量环平衡0.2min，进样1.0min；
炉温：
40℃保持15min，以20℃/min的速度升温至240℃，保持2min；
检测器：
ECD，温度250℃，进样口温度140℃。
操作
—进样对照液B；
—进样对照液A；
—进样供试液。
2.2.5系统适应性
对照液A三针的RSD不大于10%
2.2.6计算
其中：
AT为供试液平均峰面积；
AR为对照液平均峰面积；
MR为对照液二氯甲烷或三氯甲烷的称样量；
MT为样品的称样量。
3验证内容
3.1试剂及仪器
A．检测用试剂
试剂名称
批号
厂家
等级
DMSO
408168
美国天地公司
HPLC
二氯甲烷
20040325
国药集团化学试剂有限公司
AR
三氯甲烷
0603092
广东汕头市西陇化工厂
AR
B．样品
样品名称
红霉素
/
批号
ERY2-200707001
/
C．仪器和设备
仪器名称
型号
数量
校正有效期至
气相色谱仪
6890N
1
2009年5月17日
自动顶空进样器
7694E
1
2009年5月17日
3.2验证溶液配制
—样品溶液配制：
取样品约2.5g，精密称定,用DMSO溶解并稀释至250ml。
—对照储备液：
取二氯甲烷约3.0g，三氯甲烷约0.3g，精密称定，用DMSO溶解并稀释至100ml，精密量取1.0ml，用水稀释至100ml。
—各浓度对照液：
分别取对照储备液1.0ml，2.0ml，4.0ml，5.0ml和7.5ml于5个50ml容量瓶中，用水稀释至刻度。
配制成20%，40%，80%，100%和150%的对照液。
—空白溶液：
按照对照液的配制方法配制空白溶液，但是没有二氯甲烷和三氯甲烷。
—0%溶液：
精密量取5.0ml样品溶液+1.0ml空白溶液于20ml顶空瓶中（平行三样）；
—20%-150%样品溶液：
精密量取5.0ml样品溶液+1.0ml对应浓度对照液于20ml顶空瓶中（平行三样）；
—100%对照溶液：
精密量取5.0mlDMSO+1.0ml对应浓度对照液（100%）于20ml顶空瓶中（平行六样）。
3.3操作
按照0%、20%、40%、80%、100%、150%样品溶液、100%对照的顺序进样，记录各样的峰面积，结果见表1。
（以下记录峰面积均为扣除空白后面积）
表1
溶液
0%
20%
40%
80%
100%
150%
100%对照
二氯甲烷
55.4
373.6
719.4
1221.2
1516.1
2159.5
1615.0
1536.6
51.5
383.6
713.1
1233.9
1480.5
2099.6
1535.5
1546.5
56.0
390.6
736.0
1178.4
1450.0
2011.6
1516.2
1545.8
平均值
54.3
382.6
722.8
1211.2
1482.2
2090.2
1549.3
RSD
4.5%
2.2%
1.6%
2.4%
2.2%
3.6%
2.2%
三氯甲烷
372.0
1329.4
2634.4
4841.5
6295.3
9615.5
6536.6
6326.9
332.5
1357.7
2603.4
4905.5
6144.9
9277.7
6271.7
6359.5
363.8
1415.5
2707.4
4724.5
6039.5
8909.2
6184.3
6296.2
平均值
256.1
1367.6
2648.4
4823.8
6159.9
9267.5
6329.2
RSD
5.8%
3.2%
2.0%
1.9%
2.1%
3.8%
1.9%
操作人/日期：
3.4验证项目
3.4.1．精密度
1．系统精密度
计算40%、80%、150%样品溶液各自三针的RSD，查看系统精密度（具体数据参见表1），结果见表2。
表2
溶液浓度
40%
80%
150%
二氯甲烷RSD
1.6%
2.4%
3.6%
三氯甲烷RSD
2.0%
1.9%
3.8%
2．方法精密度
计算100%对照液6针的RSD，查看方法精密度，结果见表3。
表3
测定次数
1
2
3
4
5
6
RSD
二氯甲烷面积
1615.0
1536.6
1535.5
1546.5
1516.2
1545.8
2.2%
三氯甲烷面积
6536.6
6326.9
6271.7
6359.5
6184.3
6296.2
1.9%
结论：
该方法精密度良好，RSD均小于3.0%，能满足分析要求。
操作者/日期：
3．中间精密度
按照3.3.2配制溶液40%（三份）、80%（三份）、和150%（三份），100%对照溶液（六份），在另一天由另一QC员进行实验。
计算中间精密度，结果见表4、表5。
表4
溶液浓度
40%
RSD
80%
RSD
150%
RSD
二氯甲烷
482.5
4.5%
998.6
1.5%
1621.7
2.0%
477.4
1028.9
1583.3
444.1
1011.6
1647.2
三氯甲烷
1951.5
3.6%
4298.5
1.9%
7371.9
2.2%
1981.9
4464.9
7197.7
1850.1
4366.4
7523.3
结论：
中间精密度良好，RSD均小于5.0%，表明方法重现性较好
操作者/日期：
表5
测定次数
1
2
3
4
5
6
RSD
二氯甲烷面积
1290.0
1264.4
1216.0
1211.7
1226.2
1201.9
2.8%
三氯甲烷面积
6046.9
5560.4
5353.2
5309.2
5384.3
5366.8
5.1%
结论：
结果表明仪器精密度良好，RSD小于10.0%。
操作者/日期：
3.4.2．线性
把20%、40%、80%、100%，150%样品溶液的峰面积平均值分别减去溶液0%的平均值，以溶液中二氯甲烷和三氯甲烷的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行二元线性回归，计算方法的线性和相关系数，结果见表6。
表6
溶液浓度
0%
20%
40%
80%
100%
150%
二氯甲烷
峰面积
54.3
382.6
722.8
1211.2
1482.2
2090.2
调整面积
/
328.3
668.5
1156.8
1427.9
2035.9
三氯甲烷
峰面积
256.1
1367.6
2648.4
4823.8
6159.9
9267.5
调整面积
/
1059.5
2351.3
4368.4
5683.4
8553.1
二氯甲烷线性公式：
y=43.215x＋112.26r2=0.9976
三氯甲烷线性公式：
y=1957.5x－52.095r2=0.9996
要求：
r2≥0.98
结论：
线性关系良好,线性范围分别为:
二氯甲烷119~891ppm，三氯甲烷12~87ppm。
操作者/日期：
3.4.3回收率
把样品溶液20%、40%、80%、100%150%的峰面积平均值分别减去溶液0%的平均值，再除以对照100%的平均值，分别乘以5、2.5、1.25、1.0、0.667。
以考察各个浓度下方法的回收率。
回收率应在80%-120%之间，结果见表7。
表7
溶液浓度
0%
20%
40%
80%
100%
150%
二氯
甲烷
峰面积
54.3
382.6
722.8
1211.2
1482.2
2090.2
调整峰面积
/
328.3
668.5
1156.8
1427.9
2035.9
回收率
/
106%
108%
93%
92%
88%
三氯
甲烷
峰面积
256.1
1367.6
2648.4
4823.8
6159.9
9267.5
调整峰面积
/
1059.5
2351.3
4368.4
5683.4
8553.1
回收率
/
84%
93%
86%
90%
90%
结论：
二氯甲烷及三氯甲烷回收率均在80%~120%之间，符合回收率要求。
二氯甲烷平均回收率为97%，说明用该方法进行测定，准确度高；三氯甲烷平均回收率为89%，略偏低，但仍能满足分析要求。
操作者/日期：
3.4.4定量限、检测限
把对照100%用DMSO不断稀释，计算待测信号的信噪比，以确定待测溶剂的检测限和定量限，以及他们在样品中的含量限度，结果见表8。
表8
检测限
定量限
S/N
浓度（ug/ml）
样品中残留量
S/N
浓度（ug/ml）
样品中残留量
二氯
甲烷
2.9
0.3
6ppm
11.9
1
20ppm
三氯
甲烷
3.8
0.01
0.3ppm
11.7
0.03
1ppm
结论：
由上述实验可以看出，使用ECD检测器进行检测，灵敏度高，响应值大。
二氯甲烷检测限为6ppm，定量限为20ppm；三氯甲烷检测限为0.3ppm，定量限为1ppm。
操作者/日期：
3.4.5．耐用性
用对照100%溶液来考察方法的耐用性，仅进行单因素条件试验，不进行正交试验（即只改变某一个条件，其它条件不变），以二氯甲烷及三氯甲烷的峰面积为考查对象，计算RSD，结果见表9。
方面包括如下：
1）顶空瓶平衡时间考查40min、45min、50min；
2）色谱柱初始温度考查42℃、40℃、38℃
3）载气流速35cm/s、38cm/s、32cm/s
表9
1
2
3
二氯甲烷
三氯甲烷
RT
Area
RSD
RT
Area
RSD
45
40
35
4.681
1104.4
1.0%
8.576
3997.3
1.2%
45
38
35
4.872
1082.6
9.092
3902.3
45
42
35
4.460
1097.6
8.021
3942.4
40
40
35
4.657
1285.5
2.9%
8.535
4542.2
2.9%
45
40
35
4.656
1266.4
8.532
4494.6
50
40
35
4.658
1214.1
8.537
4295.3
45
40
38
4.313
1207.1
6.5%
7.888
4421.1
8.1%
45
40
35
4.681
1104.4
8.576
3997.3
45
40
32
5.131
1064.8
9.413
3772.2
结论：
通过上述试验可以看出，顶空平衡时间及色谱柱初始温度的微小改变对结果基本上无影响，其RSD均小于3.0%；流速的改变对结果影响较大，RSD大于5.0%。
操作者/日期：
4.验证结果评定与结论
质量研究组长
签名：
日期：
质量科副科长
签名：
日期：
质量科QA主任
签名：
日期：
附件1验证方案修改申请及批准书
验证方案修改申请及批准书
验证方案
名称
验证方案
编号
修改内容
签名：
日期：
修改原因
及依据
签名：
日期：
验证小组意见
验证小组组长：
日期：
决定
QA主任：
日期：
附件2验证过程中偏差记录
验证方案名称：
验证方案编号：
偏差描述：
操作人：
日期：
偏差原因：
操作人：
日期：
建议措施：
验证小组组长：
日期：
处理决定：
QA主任：
日期：
验证过程中偏差记录
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