苯甲酸钠与溶菌酶的作用机制的研究.docx

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苯甲酸钠与溶菌酶的作用机制的研究

3结论9

苯甲酸钠与溶菌酶的作用机制的研究

摘要：

在模拟人体生理条件下，采用荧光光谱法研究苯甲酸钠与溶菌酶之间的相互作用，计算了其集合常数、结合位点数，并探讨了苯甲酸钠对溶菌酶构象的影响。

研究苯甲酸钠对溶菌酶内源性荧光产生的强烈的猝灭过程为静态猝灭。

苯甲酸钠也溶菌酶形成1：

1复合物，在308K温度下的结合常数K是1.54×105，结合距离r=0.126nm。

研究结果表明，苯甲酸钠与溶菌酶的相互作用有重要影响。

溶菌酶与苯甲酸钠的同步荧光光谱也表明，溶菌酶的构象在作用前后基本不变。

关键词：

苯甲酸钠；溶菌酶；荧光光谱法；同步荧光光谱法

引言

溶菌酶（Lysozyme,LYSO）是一种存在于生物体内的小分子碱性蛋白，也是生物体内必不可少的非特异性体液免疫因子[1]，能与许多内、外源物质结合，因而常被用作研究药物小分子与蛋白相互作用的模型蛋白。

目前有关溶菌酶的研究较多[2-3]，而其与苯甲酸钠的相互作用的研究尚未见报道。

苯甲酸钠（Sodiumbenzoate）又称:

安息香酸钠。

产品规格：

工业级、食品级。

分子式:

C7H5NaO2。

分子量:

144。

其分子结构见图1。

图1

性状:

白色颗粒或结晶性粉末。

无气味，有甜涩味。

苯甲酸在常温下难溶于水，在空气（特别是热空气）中微挥发，有吸湿性，大约常温下0.34g/100mL；但溶于热水；也溶于乙醇、氯仿和非挥发性油。

在使用中多选用苯甲酸钠；苯甲酸和苯甲酸钠的性状和防腐性能都差不多。

苯甲酸钠大多为白色颗粒，无臭或微带安息香气味，味微甜，有收敛性；易溶于水（常温）53.0g/100mL左右，PH在8左右；苯甲酸钠也是酸性防腐剂，在碱性介质中无杀菌、抑菌作用。

苯甲酸钠亲油性较大，易穿透细胞膜进入细胞体内，干扰细胞膜的通透性，抑制细胞膜对氨基酸的吸收；进入细胞体内电离酸化细胞内的碱储，并抑制细胞的呼吸酶系的活性，阻止乙酰辅酶A缩合反应，从而起到食品防腐的目的。

苯甲酸钠对人的长期毒性尚不很明确，特别是婴儿是否有把苯甲酸钠转化为马尿酸的转化酶系未知[4]，因此研究苯甲酸钠的毒性具有现实意义[5]。

　　本文采用荧光光谱法、同步荧光法、紫外光谱法对苯甲酸钠与溶菌酶的相互作用进行了研究，对于理解苯甲酸钠作防腐剂的作用机理有重要的理论和现实意义。

1实验部分

1.1仪器与试剂

F-4600荧光仪（日本日立）、PHS-3B数字酸度计（上海精科）、U-3900紫外分光光度计（日本日立）、FA2004B电子天平（上海越平科技仪器有限公司）。

苯甲酸钠（天津市北辰方正试剂厂）、溶菌酶（Sigma公司）、三羟基氨基甲烷（Tris）（湖南湘中化学试剂有限公司）、实验用水为二次蒸馏水。

1.2实验方法

1.2.1荧光光谱的测定移取200μL8×10-5mol·L-1溶菌酶于10mL量筒，再分别移取2mLPH=7.4的Tris-HCL、0.1mol·L-1NaCl溶液于该量筒中，然后用蒸馏水将该混合液稀释至10mL。

用可调式移液器移取2mL上述溶液于石英池中，再用可调式移液器移取苯甲酸钠溶液进行荧光滴定，混合均匀后，以280nm为激发波长，在荧光光度计上记录300～500nm波长范围内的发射光谱，狭缝宽度均为2.5nm。

1.2.2同步荧光光谱法的测定固定溶菌酶的浓度，逐渐滴加苯甲酸钠溶液，分别在Δλ=15nm和Δλ=60nm下扫描荧光激发光谱，得到溶菌酶中酪氨酸和色氨酸残基的同步荧光光谱。

2结果与讨论

2.1荧光光谱及荧光猝灭机制

2.1.1荧光光谱

在308K时，苯甲酸钠与溶菌酶相互作用的荧光光谱图见图2。

随着苯甲酸钠的浓度的增加，溶菌酶的内源荧光强度有规律地降低，但发射峰形基本不变，说明苯甲酸钠对溶菌酶的荧光有显著地猝灭作用。

本文所用荧光强度为考虑稀释效应后的值。

图2308K时苯甲酸钠对溶菌酶荧光光谱影响

2.1.2猝灭类型

药物对蛋白质荧光的猝灭主要分为动态猝灭和静态猝灭两类[6]。

动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程，其作用过程遵循Stern-Volmer方程[7]：

I0F/IF=1+KSV[Q]=1+kqτ[Q]

（1）

式中，I0F和IF分别为溶菌酶和苯甲酸钠作用前后的荧光强度，[Q]为苯甲酸钠的浓度，KSV为Stern-Volmer动态猝灭常数，kq为双分子猝灭过程速率常数，

τ为无猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命，生物大分子荧光寿命约为10-8s[8]。

有猝灭曲线的斜率即可求得猝灭常数，药物的猝灭常数及线性相关系数r列于表1。

各类猝灭对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2.0×1010L·mol-1.•s-1[9],显然药物对Lys猝灭过程的速率常数远大于扩散控制的kq,可见猝灭过程不是由动态碰撞引起的，而是由于形成了不发荧光的化合物引起的静态猝灭。

由表1可知，体系的KSV随温度的升高而降低，且苯甲酸钠对溶菌酶的动态猝灭速率常数Kq远大于苯甲酸钠对生物大分子的最大猝灭常数2×1010L·mol-1.•s-1，因此可推测苯甲酸钠对溶菌酶的荧光猝灭为静态猝灭。

以I0F/IF为纵坐标对苯甲酸钠的浓度[Q]作图，可得线性方程及相关系数，结果见表1。

表1苯甲酸钠与溶菌酶作用的Stern-Volmer方程与猝灭常数

T/K

Stern-Volmer

KSV/（105L·mol-1）

Kq/（1012L·mol-1.•s-1）

r

298

I0F/IF=0.9689+3.59×105[Q]

3.59

3.59

0.9961

303

I0F/IF=0.9938+2.35×105[Q]

2.35

2.35

0.9919

308

I0F/IF=0.9816+1.54×105[Q]

1.54

1.54

0.9798

2.2结合位点数n与结合常数K的确定

在静态猝灭作用中，荧光强度与猝灭剂的关系可由公式

（2）表示[10-11]：

[（I0F-IF）/IF]=

K+n

[Q]

（2）

　以

[（I0F-IF）/IF]对

[Q]作图，结果见图3。

[（I0F-IF）/IF]

35℃

30℃

25℃

C（苯甲酸钠）

图3不同温度下苯甲酸钠对溶菌酶的双对数图

由图3的直线斜率和截距可分别求出苯甲酸钠与溶菌酶的结合位点数n和结合常数K，结果见表2。

表2结果表明，苯甲酸钠与溶菌酶存在1个结合位点，药物与溶菌酶形成1:

1复合物。

表2苯甲酸钠与溶菌酶的结合常数与热力学参数

T/K

K/（104L·mol-1）

n

ΔH/（kJ·mol-1）

ΔG/（kJ·mol-1）

ΔS/（kJ·mol-1·K-1）

298

1.7×106

1.1212

-438

-35.54

-135.1

303

9.2×104

0.9356

-438

-28.79

-135.1

308

1.13×104

0.8205

-438

-23.9

-134.4

2.3苯甲酸钠与溶菌酶色氨酸残基间结合距离的计算

根据FÖster偶极—偶极非辐射能量转移机理，结合溶菌酶的荧光光谱与甲酸钠紫外吸收光谱的重叠图[12-13]（见图4）,可得苯甲酸钠的吸收光谱与溶菌酶的荧光光谱的重叠积分值为3.07×10-41；非辐射转移效率E为0.403；临界能量转移距离R0为0.112nm。

由于r<7nm，而且0.5R0

ΑF

ab

nm

图5308K时苯甲酸钠的吸收光谱（a）与溶菌酶荧光光谱（b）的重叠光谱图

2.4热力学参数与作用力类型的确定

药物分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要要疏水作用力、氢键、范德华力和静电引力等[14]个。

不同分子与蛋白质结合力的类型部同。

当温度变化不大时，反映的焓变ΔH可看作常数，热力学参数之间的关系如下[15]:

In（K2/K1）=ΔH（1/T1-1/T2）/R（3）

ΔG=-RTlnK（4）

ΔS=（ΔH-ΔG）/T（5）

苯甲酸钠与溶菌酶作用过程的熵变效应小于零，构型混乱度减小，吉布斯自由能亦小于零，说明苯甲酸钠与溶菌酶发生了化学反映，且反应是自发进行。

根据反应前后的热力学焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小，可判断药物与蛋白质之间额主要作用力类型：

即ΔH>0,ΔS>0为疏水作用力；ΔH<0，ΔS<0为氢键和范德华力；ΔH≈0，ΔS>0为静电引力[16]。

由表2知，反应ΔH<0,升高温度不利于苯甲酸钠与溶菌酶复合物的生成，这与表1的K308

由ΔH<0，ΔS<0，可判断苯甲酸钠与溶菌酶的相互作用力主要是氢键和范德华力。

2.5苯甲酸钠与溶菌酶间的结合部位

固定溶菌酶的浓度，逐渐增加苯甲酸钠的浓度，分别固定Δλ=15nm和Δλ=60nm，可得溶菌酶中酪氨酸和色氨酸残基的同步荧光光谱[17-18],结果见图5。

由于Δλ=15nm和Δλ=60n所得同步荧光光谱分别表示溶菌酶中酪氨酸和色氨酸残基的光谱特征[19],且酪氨酸和色氨酸残基的最大发射波长与环境的极性有关，因此根据最大荧光发射波长的改变可以判断溶菌酶构象的变化。

按照实验方法，得到在苯甲酸钠存在下Lys的同步荧光光谱图（图5、6）。

由图5、6可知，随苯甲酸钠浓度的增加，酪氨酸和色氨酸残基发射的荧光都被猝灭，相比之下色氨酸残基荧光强度降低比酪氨酸残基更显著，说明苯甲酸钠—溶菌酶的结合位点更接近于色氨酸残基。

图5Δλ=15m

图6Δλ=60nm

3结论

本文在模拟人体生理条件下，采用荧光光谱和同步荧光光谱，研究了不同温度下苯甲酸钠与溶菌酶相互作用的光谱行为。

结果表明，苯甲酸钠对溶菌酶的内源荧光存在显著猝灭作用，且猝灭机制为静态猝灭，其结合位点数为1，作用力类型以范德华力和氢键为主。

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Sodiumbenzoateandlysozymemechanismofactionandstructure-activityrelationshipresearch

Discipline:

ChemistryName:

YueWenlongMatriculationNumber:

08406337Supervisor:

WangZhijun

Abstract:

Underthesimulationhumanbodyphysiologycondition,usesbetweenthefluorescencespectrographicmethodsresearchsodiumbenzoateandthebacteriolysinmutualfunction,hascalculateditssetconstant,theunionpositionpoints,andhasdiscussedtheboardsodiumformiatesodiumformatetothebacteriolysinconformationinfluence.Theresearchsodiumbenzoatetheintensequenchingprocesswhichproducestothebacteriolysinendocardialfluorescenceforstaticquenching.Thesodiumbenzoatealsobacteriolysinforms1:

1compound,in308KundertemperatureunionconstantKis1.54×105,theunionisawayfromris0.126nm.Thefindingsindicatedthat,thesodiumbenzoateandthebacteriolysinmutualfunctionhastheimportantinfluence.Thebacteriolysinandthesodiumbenzoatesynchronizationfluorescencespectrumalsoindicated,bacteriolysinconformationaroundfunctionbasicinvariable.

Keywords:

Sodiumbenzoate;Bacteriolysin;Fluorescencespectrographicmethods;Synchronizedfluorescencespectrographicm

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本论文是在老师的指导下和同学们的帮助下修改完成的。

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在此，祝他们永远健康快乐。