生物工艺学课件 基因工程菌的稳定性问题.docx

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生物工艺学课件基因工程菌的稳定性问题

第七章基因工程菌发酵

第二节工程菌的稳定性问题

近年来，重组DNA技术（基因工程）已开始由实验室走向工业生产。

现在，由工程菌产生的珍稀药物如：

胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等都已先后供应市场，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降，但是从许多研究中发现，工程菌的保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌的稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术的成就转变为生产力的关键之一。

一、工程菌不稳定性的表现（倾向）

工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。

具体表现为下列三种形式：

质粒的丢失；重组质粒发生DNA片段脱落；表达产物不稳定。

由于某种环境因素或生理、遗传学上的原因，质粒从某些宿主细胞中丢失（消除curing），丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。

由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的混合物。

在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于不含重组质粒的比生长速率（μ-）。

宿主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。

有时质粒不稳定并非由于质粒丢失的缘故，而是重组质粒上一部分片段脱落，表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。

表达产物不稳定也是一个很重要的问题。

发现人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。

这种情况在别的工程菌培养过程中也有发现。

二、引起工程菌不稳定性的一些因素及对策

组建成的工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等三个方面。

就质粒本身的分子结构而言，引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。

某些质粒如PSC101、R1、F等的分配系统在质粒上的位置已经确定，质粒colDF13有两个DNA序列partA,partB对它的稳定起着不可缺少的作用。

枯草杆菌质粒pUB110上几个与膜结合的蛋白基因对稳定性有关。

如质粒在重组过程中影响到这些序列的完整性，则其稳定性也受影响，另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等等都会造成质粒的不稳定。

就宿主而言，除了上述质粒中有同源序列外，尚与宿主的比生长速率、宿主中重组基因（rec系统）的完整性、重组时有关基因的具体变异等都有关系。

在培养环境中高温（如42℃以上）、去垢剂（如SDS等）、某些药物（如利福平、大炭霉素）、染料（如吖啶类、菲啶类）及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等等都会引起质粒的丢失，因而常采取下列措施以防止或降低工程菌的不稳定性。

A组建合适载体

如PC194是B.subtilis中的一个常用质粒，亦较稳定，但在其HindIII切口处插入一段DNA，形成的重组质粒稳定性就差了。

在无选择压力的情况下，经20世代后，含PC194的菌体占总菌体的99.5%以上，而重组质粒则有10%-80%被丢失，这是由于插入外源DNA后破坏了该质粒的稳定区。

在离HindIII较远处，即使去换600个碱基，新形成的质粒也与原来的质粒同样稳定。

YRP是能自主复制的酵母质粒，多拷贝但不稳定，即使有选择压力时，也有90%的质粒丢失，而以2μ组成的YEP，由于具有ori附近的稳定区，因而就稳定得多。

以B.licheniformisATCC27811为供体，以自组的质粒PNQ122为载体，用HindIII切下的3.9kb片段与之重组获得的PAMY41，但丢失率较高，后来他们将重组质粒用EcoRI切去1.75kb，质粒丢失率由95.4%下降到24%（PAMY411），更换宿主后又降至3.0%，活力也从30倍提高到600倍。

B选择适当宿主

重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响。

相对而言重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。

在选择宿主时，必须确定其遗传特点，这对组建成工程菌之稳定性关系甚大。

Imanaka等研究了质粒pSC101-trp在E.coliW3110的三种不同突变型中的稳定性。

表10-16

J.D.Vehmaanpera和M.P.Korhola报导试验pUB110与重组质粒pKTH10在3种不同宿主中对培养50世代后的稳定性作了比较，表-10-17

对正常质粒PUB110而言，在三种宿主中都很稳定，而淀粉酶基因克隆菌PKTH10则有明显差异。

C施加选择压力

选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。

在利用克隆菌进行发酵生产时，经常采取施加选择压力的方法消除重组质粒的分配性不稳定，以提高菌体纯度和发酵生产率。

（1）抗生素添加法通常在重组质粒上含有抗药性基因。

在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，就可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。

相对于简单培养基而言，加入大量的抗生素会使生产成本增加。

对于一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素造成的选择压力只能维持一定的时间，添加抗生素对结构性不稳定无能为力。

（2）抗生素依赖变异法。

其方法是通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖性突变株，即只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长，而重组质粒上含有该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长，因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能起到消除重组质粒分配性不稳定的目的。

（3）营养缺陷型法其原理是通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一原因，而将该基因插入到重组质粒中，然后选择适当组成的培养基使推动重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。

例如，将指导合成色氨酸的质粒转入E.colitrp突变株，由于该宿主细胞缺少合成生长所必需的色氨酸的基因，必须在培养基中补加色氨酸后才能存活，因此在利用克隆菌进行发酵时，如果使用的培养基中不含色氨酸，就可消除失去重组质粒的菌体。

D控制基因过量表达

许多研究中发现，外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定，如果外源基因的表达受到抑制，则重组重粒不可能丢失，含有重组质粒的克隆细胞与不含重组质粒的宿主细胞的比生长速率可能相同。

可以采取两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传，到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、转译效率使外源基因高效表达。

（1）可诱导性启动子在构建表达质粒时，可以使用可诱导性的操纵子，在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阴遏（抑制）至一定时期，在些期间擀粒稳定地遗传，然后通过去阻遏（诱导）使质粒高效表达。

例如利用3-β-吲哚乙酸可以使trp启动子去阻遏。

（2）温度敏感型质粒在对质粒复制控制机制认识后，产生了一些温度敏感型质粒。

温度较低时，质粒拷贝数较少；当温度升高到一定值时，质粒大量复制，拷贝数剧增，Uhlin等获得的质粒PKN402和PKN410在30℃时的拷贝数为20~50个/E.coli细胞，在35℃时质粒大量复制。

将β-内酰胺酶基因接在上述质粒中，经热诱导后，β-内酰胺酶活力可扩增400倍。

E控制培养条件

克隆菌所处的环境条件对其质粒的稳定性和表达效率影响很大，对一个已经组建完成的克隆菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键步骤。

在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率三个方面尤为重要。

（1）培养基的组成对克隆菌来说，培养基组分可能通过各种途径影响着质粒稳定地遗传，质粒在丰富培养基PBB中比在最低限培养基MM中更加不稳定，其不稳定的类型也不相同。

培养基引起质粒RSF2124-trp结构性不稳定，而对质粒PSC101-trp来说，则是分配性不稳定。

（2）培养温度重组质粒引起宿主细胞生长温度范围的变化：

B.stearothermophilus的生长温度范围是40-70℃，而B.stearothermophilus（pLP11）的生长温度范围是40-63℃，由于重组质粒的导入，克隆菌生长温度的上限降低。

通常而言，低温往往有利于重组质粒稳定地遗传。

对前述克隆菌而言，对培养温度低于50℃时，重组质粒非常稳定，而当温度高于50℃时，重组质粒在间隙培养的对数后期和连续培养时均不稳定。

（3）菌体比生长速率

比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。

在酵母系统中，μ对质粒pJDB248稳定性影响的结果是，比生长速率大有利于重组质粒稳定地遗传。

如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的克隆菌生长得快的话，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果。

因此调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。

但这点往往难于达到，因为大多数环境条件同时提高或降低这两种菌的生长速率。

可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率。

某些菌种利用碳水化合物作为碳源与能源时，如果基质浓度很低，则生长受到限制；如果基质浓度很高，则生长受到抑制，这种情况往往是由于高浓度底物抑制了代谢途径中的某个酶。

如果重组质粒上含有编码该酶的基因和目的的基因，将重组质粒转入上述菌种后，克隆菌可能不再受高浓度碳源抑制。

即宿主细胞遵循典型的底物抑制方程，克隆菌遵循Monod方程，如图10-20所示。

当Sμ+，不利于质粒稳定地遗传，而当S>S0时，μ-<μ+，有利于质粒稳定地遗传。

在恒化培养时，基质浓度可以很容易地控制。

就分子水平而言，影响某些质粒稳定性的基因顺序已经定位；从细胞水平来看，有可能选择一些具有特定遗传背景的细胞作为宿主获得比较稳定的克隆菌。

总之，重组质粒的稳定与否关系着重组DNA技术走向商业化之路的成败。

对这一错综复杂的问题的解决，需要多方面的努力。