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第一章生命大分子物质的制备

第一节材料的选择与处理

第二节确立测定方法

第三节细胞的破碎

第四节抽提

第五节浓缩

第六节纯化方案的设计与评价

第七节有效成分纯度和性质的分析

第八节应用实例

生命大分子物质通常是指：

动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的蛋白质（包括酶）和核酸等有机化合物的总称。

生命科学研究将进入后基因组时代。

分离纯化和测试分析蛋白质技术显得十分重要。

本章将以蛋白质和核酸为主线讨论其制备的一般过程，即材料的选择与处理、测定方法的确立、有效成分的抽提、粗品的纯化和纯品的鉴定（这部分移至后面的章节介绍）等步骤。

第一节材料的选择与处理

一、材料的选择

A.有效成分

是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。

而有效成分以外的其他物质则统称杂质。

B.有效成分在材料中存在的特点

有效成分的含量一般较少

如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。

有效成分稳定性较差

大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，易被微生物分解变质。

选用的材料不同，有效成分的含量就不同；

选用的材料即使相同，但是部位或生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。

C.材料选择应遵循的原则

有效成分含量多、稳定性好

来源丰富、保持新鲜

提取工艺简单

有综合利用价值等

二、材料的处理

选择到合适的材料后，应及时使用，或采用冰冻或干燥等方法处理。

同时还应将易于去掉的非需物质除去。

1动物脏器

（1）冰冻

应在很短时间内置-10℃冰库（可短期保存）或-70℃低温冰箱（数月不变质）贮存。

脱脂

脂肪容易氧化酸败，导致原料变质，而且还会影响纯化操作和制品得率。

一般脱脂的方法有：

A.人工剥去脏器外的脂肪组织；

B.浸泡在脂溶性的有机溶剂（如丙酮、乙醚）中脱脂；

C.采用快速加热（50℃左右）、快速冷却的方法，使熔化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去；

D.利用油脂分离器使油脂与水溶液得以分离。

（2）干燥

A.丙酮液中脱水，干燥后磨粉贮存备用；

B.在沸水中蒸煮处理，烘干后能长期保存。

2植物组织

A.叶片

用水洗净即可使用；

或在l0h内置-4～-30℃冰箱贮藏备用。

B.植物种子

需泡胀或粉碎才可使用。

材料含油脂较多时，要进行脱脂处理。

3微生物

为制备生命大分子物质的主要材料之一。

用离心法收集到的上清液，

可用于制备胞外酶和某些辅基等有效成分；

可置低温下短时间贮存。

收集到的菌体，经破细胞处理后则可从中提取其他有效成分；

或制成冻干粉，在4℃保存（数月不会变质）。

第二节确立测定方法

一、目的与要求

测定哪些材料含有目标有效成分？

哪些材料含量丰富？

提纯过程纯度是否逐渐增加？

要确立专一、准确、灵敏和简便的测定方法。

因为：

有效成分在原材料中含量较低；底物要专一性的。

二、常用的测定方法

1.光谱法

2.电化学法

3.生物活性检测法

4.免疫分析法

5.生物传感器

1光谱法

（1）吸收光谱法[①直接测定法；②比色法]

（2）荧光法

（3）浊度法

特点：

测定时所需的样品量较少，但往往能产生比较高的消光值；

且操作简单，反应迅速、灵敏；

结果也较准确，

（1）吸收光谱法

直接测定法、比色法

①直接测定法

将待测物（如核酸、蛋白质）配制成一定浓度的溶液后，移至相应波长的分光光度计中，

即可从测定的消光值换算出待测物的含量。

A.测定核酸含量

构成核酸的碱基组分是分光光度计测定核酸含量的依据。

在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度的增加或降低，会使其在波长260nm的消光值（A260）随之增加或降低，二者之间成正比关系。

通常1个A260值分别相当于

双链DNA50µg／ml

单链DNA37µg／ml

单链RNA40µg／ml

用A260／A280比值可确定DNA和RNA的纯度：

纯DNA比值为1.8

纯RNA的比值为2.0

当此比值分别小于1.8和2.0时，表明样品中已污染了蛋白质或酚类等物质。

B.测定蛋白质的含量及纯度

蛋白质（包括酶和肽）溶液的A280值主要是由构成蛋白质组分的色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）的消光值决定的，胱氨酸的贡献很小。

②比色法

将待测物（如蛋白质、核酸、糖类）与相关试剂（见表1-2）或酶的底物作用后，根据呈现的颜色或形成的产物特性，移至相应波长的分光光计中，即可从测定的消光值换算出待测物的含量。

例如：

邻苯二酚（在275nm有吸收峰）

+邻苯二酚-2,3-双加氧酶

黄色的α-羟基粘康酸半醛（在375nm有吸收峰）

通过检测375nm消光值的升高即可换算出所用酶的活力。

还可用不同消光值之间的比值鉴定某些物质的纯度

例如

纯细胞色素c还原型A550／氧化型A280比值为1.25~1.28。

假如比值过高或过低，就表明细胞色素C中污染了杂质。

（2）荧光法

特点：

荧光法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。

当分析物含量低、用吸收光谱法不能检测时，改用荧光法却能求得满意结果。

如：

NAD（菸酰胺腺嘌呤二核苷酸）（辅酶Ⅰ）

NADP（菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）（辅酶Ⅱ）

由于NADH2和NADPH2发荧光，用于偶联NADH2（或NADPH2）的氧化或NAD（或NADP）的还原反应系统进行荧光测定。

例子：

谷草转氨酶（GOT）活力测定

采用与苹果酸脱氢酶（MDH）相偶联反应进行。

天冬氨酸+α-酮戊二酸GOT草酰乙酸+谷氨酸

草酰乙酸+NADH+H+MDHL-苹果酸+NAD+

每生成1分子草酰乙酸就消耗1分子NADH，这样GOT活力就可通过测定NADH在340nm消光值的下降来求得。

（3）浊度法

极稀的悬浮液可采用此法测定，即测定悬浮液在不被吸收的波长下表观的消光值。

例如

伴刀豆球蛋白（Concanavalin,ConA）的活力测定方法之一就是采用此法（A420）。

培养液中细菌生长的浓度（A600）也可用此法测定。

2电化学法

有些反应过程会放出质子氢（H+），可用灵敏的pH计或NaOH溶液滴定等方法追踪其变化，从而计算出欲测物的含量或活力。

例如：

葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，用NaOH溶液滴定该酸的含量，便可求出葡萄糖氧化酶的活力。

3生物活性检测法

大多数生命物质，尤其是一些激素类物质，当把它们注射入动物的特定器官时，所属机体将发生相应的变化，并且二者间有一定的相关性。

根据这一性质设计的方法，即可对生命活性物质进行检测。

如：

在某个动物器官中注射某种激素，使器官细胞加速分裂，通过检测细胞的数量变化来推测激素的生物活性。

4免疫分析法

采用抗体与抗原之间发生的特异反应，并结合放射性同位素标记或酶标记，就可对有关物质进行灵敏的定性或（和）定量分析（详见第十九章）。

5生物传感器

用生物传感器中的敏感膜（具有分子识别功能的生物活性材料如酶、蛋白、抗体、生物膜和微生物等作为敏感元件）与待测溶液中的某一物质进行反应，即可通过显示器反映出有效成分的数量（详见第十七章）。

第三节细胞的破碎

细胞是生物体结构和功能的基本单位。

有效成分可以分泌于细胞外，也有存在于细胞内的。

如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外的培养液中，用适当的溶剂可直接提取。

存在于细胞内的酶又有游离酶和结合酶之分，前者游离在细胞质中，后者则与细胞器紧密结合（如氧化还原酶和有机磷水解酶等）。

欲提取存在于细胞内的物质时，必须把细胞破碎（个别的则例外如采用Mg2+溶液提取酶蛋白）。

动物脏器的细胞膜比较脆弱，极易破损，往往在组织绞碎或提取时就被破坏了。

植物和微生物的细胞壁较牢固，需要在提取前进行专门的破细胞操作。

一、机械破碎

1研磨法

剪碎的动物组织置研钵中，用研磨棒研碎。

用匀浆器处理，也能把动物细胞破碎。

大规模生产时，可用电动研磨法。

细菌和组织的细胞破碎均可用此法。

2组织捣碎器法

这是一种剧烈的破碎细胞方法。

捣碎器（8000~10000r/min）处理30~45s，植物和

动物细胞能完全破碎。

3超声波法

它是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。

4压榨法

此法是一种温和、彻底破碎细胞的方法。

用1.77×108～3.54×108Pa的压力迫使几十毫升细胞悬液通过一个小孔（<细胞直径的孔），致使其被挤破、压碎。

5冻融法

将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。

如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀、破碎。

二、溶胀和自溶

1溶胀

细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，引起细胞膜发生胀破的现象称溶胀。

2自溶

细胞结构在本身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）作用下，发生溶解的现象称自溶。

三、化学处理

脂溶性的溶剂可把细胞壁、细胞膜的结构部分溶解

四、生物酶降解

生物酶（如溶菌酶）有降解细菌细胞壁的功能。

在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。

第四节抽提

一、抽提的含义

抽提通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。

经过处理和破细胞原材料中的有效成分可用

缓冲液、稀酸、稀碱、或有机溶剂（如丙酮、乙醇）等抽提；还可用蒸馏水抽提。

一般理想的抽提溶液应具备下述条件：

对有效成分溶解度大，破坏作用小；

对杂质不溶解或溶解度很小；

来源广泛、价格低廉、操作安全等。

二、抽提有效成分的影响因子

抽提时

pH值、金属离子、溶剂的浓度、极性等因子，

可明显影响有效成分的性质和数量。

1pH值

对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。

通常：

抽提碱性蛋白质选用低pH值的溶液；

抽提酸性蛋白质选用高pH值的溶液；

或者用调至一定pH值的有机溶剂。

2溶剂的极性和离子强度

有些蛋白质或酶在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。

（1）通常降低极性的方法

在水溶液中增加蔗糖或甘油的浓度。

若用二甲基亚砜（DMSO）或二甲基甲酰胺代替蔗糖或甘油时，会使溶液的极性大大降低。

（2）离子强度等于溶液中各离子浓度（C）与离子电荷数（Z）平方乘积总和的二分之一。

在水溶液中加人中性盐如KCl、NaCl、NH4Cl和（NH4）2SO4能提高溶液的离子强度。

一般来说：

离子强度较低的中性盐溶液有促进蛋白质溶解，保护蛋白质活性的作用；

离子强度过高则会引起蛋白质发生盐析作用。

3水解酶

在抽提、纯化蛋白质或核酸时，其效果常常受到本身存在的水解酶的影响。

这些酶在与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，一旦条件适宜，就会发生反应，导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。

防止方法（目的是使这些酶丧失活性）：

①加入抑制剂（苯甲基磺酰氟化物，PMSF，见表1-3、1-4），

②调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，

4温度

一般认为蛋白质或酶制品在低温（如0℃左右）时最稳定。

但有些物质对温度的要求却与此不同。

例如：

从鸟肝分离出的丙酮酸羧化酶对低温敏感，25℃时才稳定。

有机磷农药水解酶，置-10℃时会快速失活，移至21℃时两天后开始失活，此后每天失活剩余酶的16％。

若将其存放在6℃时失活速度较缓慢，每天约丧失活力0.75％。

5搅拌

搅拌可促使欲抽提物与抽提液之间相互接触，并能增加溶解度。

但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。

6氧化

存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶（或蛋白质）失活（或变性）。

在抽提液中加入还原剂时，就可以防止巯基发生氧化作用，或者延缓某些酶活性的丧失。

在有些植物组织或微生物细胞中含有较多的酚类化合物，加入还原剂可防止褐化。

7金属离子

蛋白质的巯基能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。

这些金属离子主要来源于制备缓冲液的试剂中。

解决的办法:

①用无离子水或重蒸水配制试剂；

②在配制的试剂中加入1-3mmol／LEDTA（金属离子络合剂）。

8抽提液与抽提物的比例

在抽提时，抽提液与抽提物的比例一般以5︰1为宜。

如抽提液过多，则有利于有效成分的提取，但不利于纯化工序的进行。

否则反之。

第五节浓缩

一般抽提液的体积都比较大，应先进行浓缩处理。

常用的浓缩方法有下面几种:

沉淀法

吸附法

超过滤法

透析法

减压蒸馏法

冰冻干燥法

一、沉淀法

在抽提液中加入适量的中性盐[如（NH4）2S04]或有机溶剂，使有效成分变为沉淀（见第二章）。

经离心分离，获得有效成分。

二、吸附法

将干葡聚糖凝胶G25（或吸水棒）加入抽提液中，两者比例为1︰5。

由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左右，回收蛋白质量约80％。

三、超过滤法

把抽提液装入超过滤装置（见图1-1），在空气或氮气（5.05×105Pa）压力下，使小分子物质（包括水分）通过半透膜（如硝酸纤维素膜），大分子物质留在膜内。

四、透析法

A.把装抽提液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇（polyetheyleneglycol，PEG，分子质量>20kDa）或甘油中。

10ml抽提液可在1h内浓缩到几乎无水的程度。

这种方法的浓缩速度与透析袋的表面积以及PEG的数量有密切关系。

B.真空透析

五、减压蒸馏法

当真空度较高时溶液的沸点可控制在30℃以下。

这种方法一般适用于常温下稳定性好的物质。

六、冰冻干燥法

冰冻的抽提液在真空状态下，可以由固体直接变为气体。

用此原理进行浓缩，有效成分几乎不会破坏。

冻干机

冻干机主要由：

低温干燥箱、真空泵和冷冻机构成。

第六节纯化方案的设计与评价

纯化方案：

是指在纯化某一物质过程中，将几种分离方法（如沉淀法、离子交换层析、葡聚糖凝胶等）有机地互补联合、灵活应用的总称。

一、纯化方案的设计

依据抽提液中有效成分和杂质之间理化性质的差异性，从诸多方法中挑选出两种、两种以上乃至更多种分离方法组成一个纯化方案。

各分离方法的排布：

一般地，

先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积和后工序处理的方法；

后选用精确、费时和需样品量少的方法。

二、纯化方案的评价

对纯化方案的评价，实质上是对组成纯化方案的每一种分离方法的评价。

这种评价仅采用理论分析是远远不够的，只有经过实践检验才能正确得出。

方法：

纯化过程的每一步收集到的溶液要进行：

有效成分的含量测定；

并计算：

比活力（活力单位数／毫克蛋白）

纯化倍数（每步的比活力／粗抽提液的比活力）

收得率[（每步的总活力/粗抽提液总活力）×100％]

视纯化倍数的大小，收得率的高低，就能初步确定每种分离方法的应用价值。

一般认为：

凡是在特定实验中能增大纯化倍数和提高收得率的方法均属有应用价值的。

反之，则应用价值不大，也不宜采用。

但是，在纯化过程中，随着纯化倍数的增大，有效成分的含量却是逐渐减少，收得率也往往<100％（除非抽提液中存在酶的抑制）。

因此，实践中对纯化倍数和收得率的要求是根据材料来源的难易而变化的。

若材料来源难，就希望提高收得率；反之，则希望提高纯化倍数（见沉淀法）。

例子

以从赛氏杆菌（Serratiasp．）提取L-门冬酰胺酶为例，说明纯化方案与纯化倍数和收得率的关系（见表1-7）。

表1-7L-门冬酰胺酶的纯化

比活力=活力单位数／毫克蛋白

纯化倍数=每步的比活力／粗抽提液的比活力

收得率=每步的总活力/粗抽提液总活力×100％

步骤总蛋白/g总活力/u比活力（u/mg）纯化倍数收得率/%

1.粗抽提液30210000.71100

2.氯化锰处理7.64150172.02.872

3.冰冻融解5.58148722.73.871

4.DEAE-纤维0.113502544.563.524

素层析

5.硫酸铵盐析0.048336771.7102.017

6.羟基磷灰石0.0163133200.0286.015

柱层析

7.PAGE0.0123100255.0365.015

此处，酶含量是用活力单位表示

酶纯度用比活力表示

纯化的有效成分不同，表示其含量和相对纯度的单位亦不一样。

如纯化的物质是胰岛素，其含量将用效价表示，纯度用每毫克蛋白质所含效价单位表示。

第七节有效成分纯度和性质的分析

在实践中

常用于鉴定生物制品纯度的方法有：

电泳（见第十八章）、免疫分析（见第十九章）、薄层层析和薄膜层析（见第三章）等。

用于检测其含量和性质的方法有：

光谱法和气相层析（见第二十章）等；

用于测定有效成分分子质量的方法有：

凝胶过滤（见第六章）和电泳法等；

用于测定核酸序列的方法有：

化学直读法、酶解直读法（见第十三章）等；

用于测定蛋白质序列的方法有：

与Endman降解法相结合的薄膜层析等。

第八节应用实例

叶绿体的提取与4.5SRNA的制备

叶绿体提取缓冲液：

0.3mol／L甘露糖醇或0.3mol／L蔗糖

4mmol／LEDTA-Na2

50mmol／LTris-HCl（pH8．0）

5mmol／L巯基乙醇

0.05％牛血清白蛋白

RNA提取缓冲液：

50mmol／LTris·HCl（pH8.5）

50mmol／LKCl

4％TritonX-100

新鲜植物

置4℃存放1～2天

匀浆处理（盛4倍于植物体积的缓冲液的捣碎器中高速匀浆处理）

纱布过滤（匀浆液经纱布过滤）

离心（200g，5min）

收集上清液

继续离心（30000g，10min）

弃上清液

在沉淀中含有完整的叶绿体物质

叶绿体

放入缓冲液中，搅拌l0min

离心（得上清液）

苯酚抽提（上清液3次）

加入1／10体积的3mol／L乙酸钠和2.5倍的95％乙醇，-20℃静置过夜，

再离心得沉淀

接着用95％乙醇洗涤

干燥后即为4.5SRNA粗制品。

小结

生命大分子物质的制备:

材料的选择与处理

细胞的破碎

抽提

浓缩

纯化

鉴定（有效成分纯度和性质的分析）