口腔生物学：第三章 口腔疾病分子生物学A.pptx

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2012-10-11,【口腔生物学】5年制,第三章口腔疾病分子生物学Molecularbiologyoforaldiseases,Malaria（疟疾）isamosquito-borneinfectiousdiseaseofhumansandotheranimalscausedbyparasiticprotozoans.TheWorldHealthOrganizationreportstherewere198millioncasesofmalariaworldwidein2013.Thisresultedinanestimated584,000to855,000deaths,themajority（90%）ofwhichoccurredinAfrica.WHO发布的全球疟疾报告2014指出，全球疟疾死亡率在2000年和2013年之间下降了47%。

根据WHO统计，全球约32亿人出于罹患疟疾的危险中，2013年约有1.98亿疟疾病例和58.4万死亡病例，90%疟疾死亡发生在非洲，其中绝大多数为五岁以下儿童，超过43万人，相当于每一分钟就有一名非洲儿童死于疟疾。

青蒿素Artemisinine,Artemisinin,alsoknownasqinghaosu（Chinese:

青蒿素）,anditssemi-syntheticderivativesareagroupofdrugsthatpossessthemostrapidactionofallcurrentdrugsagainstPlasmodiumfalciparummalaria.ItwasdiscoveredbyTuYouyou,aChinesescientist,whowasawardedhalfofthe2015NobelPrizeinMedicineforherdiscovery.Treatmentscontaininganartemisininderivative（artemisinin-combinationtherapies,ACTs）arenowstandardtreatmentworldwideforP.falciparummalaria.ArtemisininisisolatedfromtheplantArtemisiaannua,sweetwormwood,anherbemployedinChinesetraditionalmedicine.,http:

/www.pnas.org/content/early/2014/10/02/1408759111.full.pdf+html,第三章口腔疾病分子生物学Molecularbiologyoforaldiseases,参考书目,内容,第一节分子生物学基础一、概述二、基因三、基因表达四、基因表达的调节,第二节分子生物学研究的主要方法一、分子克隆的材料与方法二、分子克隆的主要步骤三、特异核酸的检测,第三节牙发生的分子机制一、釉质形成的分子机制二、牙本质形成的分子机制,第四节分子生物学在口腔致病菌研究中的应用一、变形链球菌属致龋毒力因子二、核酸杂交法检测牙周病相关细菌三、基于16SrRNA基因分析的口腔微生物分类与鉴定,第五节口腔病分子生物学基础一、遗传疾病的分类二、单基因遗传病研究中的几个概念三、基因多态性与突变,第六节口腔肿瘤分子生物学一、细胞增值与细胞凋亡二、口腔肿瘤发生的分子机制三、口腔肿瘤转移的分子机制四、口腔肿瘤相关基因的筛选与功能研究策略,了解,掌握,熟悉,分子生物学研究的主要方法与原理TheMethodsandPrinciples,牙发生中的分子机制以及口腔常见致病菌的毒力因子及检测方法MolecularMechanismsoftoothdevelopme,理解,分子改变所导致遗传病的原理Howcangenemutationsaffecthealthanddevelopment?

基因的基本结构、功能及表达的调节Thegenestructure,functionandexpression,第一节分子生物学基础,概述基因的基本结构和功能基因表达基因表达的调节,分子生物学是研究生物分子的特征、相互关系及其对生命活动影响的学科，分子生物学在医学中的应用有助于从根本上理解生物的生理及病理机制与过程。

基因的基本结构和功能TheStructureandfunctionsofthenucleicacidsMolecule（Gene）,核酸nucleicacids,JohannesFriedrichMiescherSwissphysicianandbiologist1844-1895Hewasthefirstresearchertoisolateandidentifynucleicacid.,DiscovererofthestructureofDNA,Theywereawardedthe1962NobelPrizeforPhysiologyorMedicine,fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmateria.,JamesDeweyWatson1928,American,MauriceHughFrederickWilkins1916,NewZealandX-raydiffraction,FrancisHarryComptonCrick1916,British,核糖核酸,脱氧核糖核酸,腺嘌呤,胸腺嘧啶,胞嘧啶,鸟嘌呤,腺嘌呤,尿嘧啶,胞嘧啶,鸟嘌呤,核酸nucleicacids,ThestructureoftheDNAdoublehelix,嘧啶,嘌呤,22wide,12wide,胞嘧啶鸟嘌呤,胸腺嘧啶腺嘌呤,基因（gene）基因是一段DNA序列，其转录产物是编码一条多肽或蛋白质的RNA或具有独立功能的RNA，基因决定遗传性状。

基因在基因组上呈直线排列并世代相传。

基因组（genome）基因组是指细胞或生物体的整套DNA，基因组包含整套基因的编码序列，同时还包括基因内的非编码序列及基因间序列。

这些序列也同样含遗传指令。

基因,基因组,1,2,3,4,5,6,7,DNA,新生mRNA,成熟mRNA,转录,拼接-转录后修饰,翻译,蛋白质,复制DNAReplication,dATP/dGTP/dCTP/dTTPMg2+引物（primer：

DNAorRNA）DNA模板（Template）DNA多聚酶,基因表达Geneexpression,基因表达Geneexpression,转录翻译,转录Transcription,DNA,RNA,有意义链Sencestrand,启动子Promotor,TATA框,增强子,沉默子CAAT框GC框,Antiencestrand反义链终止子,MessengerRNA（mRNA）RibosomalRNA（rRNA）TransferRNA（tRNA）,Longnon-codingRNAsmallnuclearRNA（snoRNA）microRNA（miRNA）SmallinterferingRNA（siRNA）Piwi-interactingRNA（piRNA）,RNA,克雷格梅洛是美国马萨诸塞大学医学院分子医学教授。

2006年因与斯坦福医学院病理学和遗传学教授安德鲁法厄发现RNA干扰现象而共同获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。

1982年获得美国布朗大学学士学位，1990年在哈佛大学获得博士学位。

1994年加入马萨诸塞州大学医学院任分子医学教授,CraigC.Mello,转录后修饰Post-transcriptionalmodification,mRNA,转录后修饰Post-transcriptionalmodification,mRNA,5capaddition,Splicing,Polyadenylation,rRNA,tRNAmRNA,翻译Translation,mRNA,Protein（蛋白质）,遗传密码,Start：

AUG,Stop：

UAAUAGUGA,一个基因一种酶（EXTL2-糖基化转移酶）,一个基因一条多肽链,血红蛋白血红蛋白链,两条链和两条链组成四聚体的血红蛋白:

链,一个基因多条多肽链（TP63基因）,外显子1外显子2外显子3外显子4,外显子5,外显子,5,5NF1基因的有义链NF1基因的反义链3,3,OMG,EVI2B,EVI2A,外显子外显子,红色：

外显子蓝色：

内含子OMG、EVI2A、EVI2B三个基因在基因组上定位于NF1基因第36个外显子和第37个外显子之间的内含子中。

重叠基因,基因表达的调节Regulationofgeneexpression,DNAInteractionswithproteins,AllthefunctionsofDNAdependoninteractionswithproteins.Theseproteininteractionscanbenon-specific,ortheproteincanbindspecificallytoasingleDNAsequence.EnzymescanalsobindtoDNAandofthese,thepolymerasesthatcopytheDNAbasesequenceintranscriptionandDNAreplicationareparticularlyimportant.,基因表达的调节,乳糖操纵子模型,基因表达的调节Regulationofgeneexpression,萤火虫荧光素酶报告基因,萤火虫荧光素酶报告基因系统,对照组,实验组,基因表达的调节,实验数据,第二节分子生物学研究的主要方法与原理TheMethodsandPrinciples,核酸蛋白质,核酸技术,核酸制备与扩增,基因组DNA的提取与纯化RNA制备和cDNA的合成核酸扩增（PCR技术）,核酸检测,核酸杂交,基因克隆,分离目的基因切割目的基因和载体目的基因和载体的连接重组DNA转化宿主细胞阳性克隆的筛选,电泳分析法分光光度分析法SouthernNorthern基因芯片,常用的分子生物学技术,PCR技术发明者,1985年，美国科学家KaryMullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。

从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，KaryMullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。

聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction（PCR）,PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

引物的延伸：

DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction（PCR）,模板DNA的变性模板DNA与引物的退火（复性）引物的延伸,PCR产物,琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物,Marker,PCR产物,PCR反应要素：

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。

理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

PCR引物设计应遵循以下原则：

引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

引物扩增跨度：

以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

引物中有或能加上合适的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

引物的特异性：

引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

计算机软件辅助设计,特异性强引物与模板DNA特异正确的结合、碱基配对原则、聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，特异性扩增靶基因区片段。

灵敏度高PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克水平。

简便、快速只需将引物、酶、dNTP、模板和缓冲液混合后放入PCR仪中即可。

一般在24小时完成扩增反应。

扩增产物一般用电泳分析即可。

对标本的纯度要求低不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

PCR优点,PCR技术在临床上的应用,在遗传病诊断上的应用：

直接检出基因突变位点筛查与遗传病有关的点突变在现代医学检验中的应用：

病原体的定性及定量检测（如病毒感染）在肿瘤基因诊断中的应用：

通过检测与癌变有关的基因标志物来判定组织学的良、恶性程度，癌的进展以及肿瘤的耐药性在基因表达水平检测中的应用：

定量PCR可用于检测与疾病相关蛋白基因表达水平。

临床上检测肿瘤抗原的基因表达水平能对肿瘤做出早期诊断及治疗效果评价等,实时荧光定量PCR（Real-timePCR）,技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出实现了PCR从定性到定量的飞跃而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、自动化程度高等特点定量基因表达水平（mRNA、Protein）疾病诊断,基因克隆：

基因经无性繁殖获得许多相同拷贝的过程。

通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。

基因克隆技术：

一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质状态的转移和重新组合。

因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。

步骤：

1.分离目的基因切割目的基因和载体目的基因和载体的连接重组DNA转化宿主细胞（E.Coli）阳性克隆的筛选DNA测序分析,基因克隆技术,限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease）DNA连接酶（DNAligase）质粒（plasmid,vector）,6.DNA测序,RT-PCR（反转录）,1.目的基因,2.切割目的基因和载体,3.目的基因和载体的连接,4.转化（E.Coli）,5.阳性克隆,基因克隆技术,PCR,6.DNA测序,Transfection,（GreenFluorescentProtein）,克隆/体外表达目地基因（GFP）,核酸杂交技术Southernblot：

检测DNANorthernblot：

检测RNA,Southernblot：

检测DNA,Northernblot：

检测RNA,RNA,蛋白质技术,蛋白质的提取分离与纯化及定量（Proteinisolation）蛋白印记法（Westernblot）酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmnosorbent,ELISA）免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）免疫共沉淀反应（co-immunoprecipitation）细胞免疫荧光染色方法（ImmunolFluorescenceAssay,IFA）,蛋白印记法（Westernblot）,一种分析和鉴定特定蛋白质的技术。

即将混杂的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜上，再用标记的抗体或二抗与之反应，以显示膜上特定的蛋白条带。

Thewesternblot（sometimescalledtheproteinimmunoblot）isawidelyacceptedanalyticaltechniqueusedtodetectspecificproteinsinthegivensampleoftissuehomogenateorextract.Itusesgelelectrophoresistoseparatenativeproteinsby3-Dstructureordenaturedproteinsbythelengthofthepolypeptide.Theproteinsarethentransferredtoamembrane（typicallynitrocelluloseorPVDF）,wheretheyarestainedwithantibodiesspecifictothetargetprotein.,Westernblotprotocol,一种分析和鉴定特定蛋白质的技术。

即将混杂的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜上，再用标记的抗体或二抗与之反应，以显示膜上特定的蛋白条带。

蛋白样品制备和上样,电泳,转膜,封闭一抗,二抗,底物（ECL）,酶联免疫吸附试验（ELISA）,基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。

此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。

滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。

因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。

此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

Biotin：

生物素Streptavadin：

链霉亲和素HRP：

HORSERADISHPEROXIDASE辣根过氧化物酶,免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）,应用免疫学（抗原抗体特异性结合）及组织化学原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术ImmunohistochemistryorIHCreferstotheprocessofdetectingantigens（e.g.,proteins）incellsofatissuesectionbyexploitingtheprincipleofantibodiesbindingspecificallytoantigensinbiologicaltissues.IHCtakesitsnamefromtherootsimmuno,inreferencetoantibodiesusedintheprocedure,andhisto,meaningtissue（comparetoimmunocytochemistry）.,免疫荧光方法先将已知抗体标上荧光素，当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，在荧光显微镜下可观察到某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。

由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。

免疫酶标方法基本原理是先以酶标记的抗体与组织作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，在显微镜下对各种抗原成分进行定位研究。

本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：

定位准确，对比度好，染色标本可长期保存。

免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）,免疫酶标方法,免疫荧光方法,免疫共沉淀反应（co-immnoprecipitation）,免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

原理：

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

Immunoprecipitation（IP）isthetechniqueofprecipitatingaproteinantigenoutofsolutionusinganantibodythatspecificallybindstothatparticularprotein.Thisprocesscanbeusedtoisolateandconcentrateaparticularproteinfromasamplecontainingmanythousandsofdifferentproteins.Immunoprecipitationrequiresthattheantibodybecoupledtoasolidsubstrateatsomepointintheprocedure.,免疫共沉淀反应（co-immnopricipitation）,Westernblot,结果：

PPF,K8RecQL,MSH2,抗体：

anti-K8,细胞免疫荧光染色方法ImmunolFluorescenceAssay（IFA）,免疫染色的实验原理类似于WesternBlotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在细胞内原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。

Immunofluorescenceisatechniqueusedforlightmicroscopywithafluorescencemicroscopeandisusedprimarilyonbiologicals