1华中农业大学.docx
《1华中农业大学.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《1华中农业大学.docx（11页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
1华中农业大学
硕士学位论文
课题研究内容及进展汇报
课题名称
高活性谷氨酸脱羧酶的筛选及固定化研究
研究生姓名
姚森
年级
2005
专业
食品科学
研究方向
食品品质控制
指导教师
熊善柏
职称
教授
指导小组
熊善柏杨特武赵思明
食品大分子结构与功能研究室
华中农业大学食品科学技术学院
2006年11月制订
课题研究内容
1.高活性谷氨酸脱羧酶的筛选√
1.1不同品种糙米发芽后GABA的含量测定
1.2糙米发芽前后谷氨酸及GABA含量的测定
1.3糙米发芽后谷氨酸脱羧酶活性的测定
1.4发芽糙米中GABA含量与GAD及谷氨酸含量的相关性分析
2.谷氨酸脱羧酶的提取及同功酶鉴定
2.1发芽糙米谷氨酸脱羧酶的提取
2.2不同品种类型发芽糙米谷氨酸脱羧酶同功酶的鉴定
3.谷氨酸脱羧酶的固定化及性质研究
3.1谷氨酸脱羧酶的固定化载体及方法的选择
3.1.1固定化介质的选择
3.1.2固定化方法的选择
3.2谷氨酸脱羧酶的固定化条件的选择
3.2.1固定化的酶用量、时间、温度、pH及离子强度的选择
3.2.2固定化条件的正交试验
3.3固定化谷氨酸脱羧酶酶学性质研究
3.3.1固定化GAD的最适反应温度、最适反应pH及热稳定性
3.3.2固定化GAD的稳定性、酶失活动力学及GABA生成动力学
4.固定化酶的应用
将制作的固定化酶制成固定化酶反应柱，用于GABA的生产，测定柱转化谷氨酸的效率及柱的半衰期。
√表示已完成内容（每完成一项内容就打√）
课题研究内容调整及其原因
1补充：
（确定底物Glu对GABA含量生成的影响）
1.5低中高三类品种的糙米发芽过程中GABA、GAD酶活力及游离谷氨酸含量的变化
分别测定稻米发芽0 h、8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48h后GABA、GAD及游离谷氨酸脱羧酶的变化。
导
师
意
见
导师签字
年月日
研究内容及结果
工作时间
2006年9月1日至2007年3月19日
研究内容及结果
1.1不同品种糙米发芽后GABA的含量测定
内容：
测定188份单株水稻糙米（包括早粳稻、早籼稻、中粳稻、中籼稻和晚粳稻等品种类型，含常规籼稻、常规粳稻、恢复系籼稻、恢复系粳稻、籼糯稻、杂交稻和一些特种稻）在30℃浸泡6 h，30℃发芽24 h后GABA的含量。
1.1.1不同水稻品种发芽糙米中γ-氨基丁酸含量
不同品种（系）水稻品种发芽糙米中GABA的含量见表1。
糙米发芽后GABA的含量平均值为56.84 mg/100g，其变异系数为21.31％。
GABA生成量在65mg/100g以上的品系有46个，其中有10个品种（系）GABA的含量在78.72 mg/100g以上，生成量最大的品种58号达87.88 mg/100g，生成量最小的品种148号仅有34.62 mg/100g，不同品种之间GABA的生成量大小相差近3倍。
在测定的特种稻中，红黄色米的GABA含量较低，黑褐色米和糯米的含量则相对其他类型的GABA含量高。
表1不同水稻品种发芽糙米中GABA的含量（FW）
编号
GABA含量
（mg/100g）
编号
GABA含量
（mg/100g）
编号
GABA含量
（mg/100g）
编号
GABA含量
（mg/100g）
编号
GABA含量
（mg/100g）
1
73.46
39
67.44
77
59.51
115
36.87
153
60.67
2
59.44
40
77.35
78
56.98
116
42.21
154
42.00
3
46.24
41
67.51
79
68.67
117
51.23
155
54.82
4
40.29
42
80.57
80
69.70
118
37.63
156
55.40
5
52.33
43
42.21
81
66.76
119
48.84
157
51.34
6
37.80
44
47.75
82
64.67
120
52.87
158
34.96
7
55.82
45
51.03
83
57.80
121
54.11
159
58.35
8
37.63
46
67.03
84
57.52
122
85.22
160
64.43
9
60.57
47
54.31
85
75.37
123
82.62
161
66.41
10
53.70
48
69.01
86
51.54
124
78.72
162
47.88
11
58.62
49
64.36
87
77.35○
125
46.11
163
65.59
12
55.85
50
61.08
88
78.98○
126
55.54
164
50.69
13
62.58
51
77.97
89
78.93○
127
72.70
165
67.75
14
76.81
52
58.21
90
43.78△
128
51.30
166
63.34
15
61.35
53
76.40
91
61.90○
129
50.21
167
74.62
16
58.62
54
66.76
92
39.40△
130
36.46
168
51.85
17
40.63
55
61.97
93
63.13○□
131
57.47
169
87.61
18
53.29
56
72.50
94
78.03○□
132
67.95
170
63.27
19
44.67
57
57.39
95
73.36○□
133
65.53
171
51.37
20
39.81
58
87.88
96
54.72○□
134
67.64
172
55.85
21
66.52
59
59.23
97
53.15○□
135
56.02
173
62.86
22
63.41
60
68.12
98
45.35○□
136
46.86
174
35.95
23
58.89
61
81.66
99
40.84
137
38.86
175
45.90
24
52.46
62
60.26
100
50.34
138
49.18
176
48.57
25
51.95
63
67.03
101
49.80
139
42.48
177
45.69
26
56.77
64
51.92
102
54.52
140
40.05
178
38.65
27
46.93
65
52.74
103
64.98
141
63.23
179
49.93
28
61.01
66
56.09
104
42.62
142
77.08
180
48.02
29
59.37
67
59.10
105
57.59
143
62.00
181
35.92
30
38.86
68
53.39
106
36.60
144
45.69
182
48.36
31
45.22
69
51.64
107
35.13
145
53.08
183
55.75
32
68.77
70
60.46
108
45.69
146
56.23
184
45.08
33
57.18
71
71.34
109
54.11
147
37.49
185
44.81
34
54.79
72
55.06
110
57.05
148
34.62
186
54.24
35
60.19
73
74.41
111
46.72
149
55.95
187
46.21
36
54.45
74
65.05
112
47.13
150
45.28
188
74.28
37
58.76
75
59.10
113
55.20
151
58.35
38
79.27
76
59.71
114
37.97
152
56.43
○为黑褐色米；△为红黄色米；□为糯米。
1.1.2不同类型发芽糙米中γ-氨基丁酸含量的差异
对所选样品中的181个品种（系）进行分类，其中含粳稻糙米品种90个，发芽后GABA的生成量为55.65±11.52 mg/100，籼稻糙米品种共91个，发芽后GABA的生成量为56.73±12.04 mg/100g。
籼稻糙米比粳稻糙米发芽后GABA的平均含量高，但它们的差异不显著（T/α=-0.613/0.5407）。
在选取的181份稻米品种可分为早粳稻、早籼稻、中粳稻、中籼稻和晚粳稻5大类型。
不同类型品种的稻米发芽后GABA的平均生成量及其差异显著性见表2。
由表2可知，各个品种类型的糙米发芽生成GABA的含量有极显著的差异（F/α = 8.23/0.0001）。
不同类型的糙米发芽后GABA的生成量早稻>中稻>晚稻，其中早籼稻的平均含量高于早粳稻。
表2不同品种类型水稻米发芽糙米中GABA含量
品种类型
品种数
GABA的含量（mg/100g FW）
显著水平（0.05）
早籼稻
18
64.50±11.53
A
早粳稻
44
60.62±9.64
A
中籼稻
73
54.81±11.44
B
中粳稻
25
53.60±12.74
B
晚粳稻
21
47.70±8.39
C
同列英文字母不同表示差异显著。
1.2糙米发芽后谷氨酸脱羧酶活性的测定
内容：
对上述188分样品中选取GABA生成量较高的10个品系：
38、40、51、53、55、58、61、70、71和73号于第二年扩繁，测定糙米与发芽糙米中GABA的含量及其发芽糙米中GAD的酶活力。
将发芽糙米匀浆后加入至含0.2 mMPLP、10 mM谷氨酸的50 mM（pH 5.8）的PBS中，于37℃水浴保温1 h，测定米浆转化谷氨酸的效率。
能产生高GABA含量的稻米扩繁后的10个品种，其中糙米中GABA的含量、发芽后GABA的含量和GAD的酶活力以及发芽糙米浆转化谷氨酸的效率见表3。
由表3可知，高产GABA的品种经重作扩大繁殖后，其GABA的产量仍很高，均在80 mg/100g以上，其中38、58及73号品种发芽后GABA的含量接近90 mg/100g。
发芽糙米浆可以直接将添加的谷氨酸转化为GABA，其中40、53和58号品种的转化效率较其它品种高，其GAD酶活力也相对较高。
表3发芽糙米中GAD的酶活力及对谷氨酸的转化效率
品种编号
04年测定发芽糙米GABA含量
（mg/100g）
糙米中GABA含量
（mg/100g）
05年测定发芽糙米GABA含量
（mg/100g）
发芽后GABA的增量
（mg/100g）
发芽糙米中GAD酶活力
（U/100g）
发芽糙米浆对谷氨酸的转化效率
（μmol GABA/（g FW·h））
38
79.27
15.90
89.81
73.91
0.58
2.80
40
77.35
13.88
84.59
70.71
0.68
3.67
51
77.97
12.76
85.01
72.26
0.53
3.31
53
76.40
15.21
85.17
69.96
0.70
3.57
55
61.97
19.47
81.60
62.13
0.42
2.62
58
87.88
18.57
89.71
71.14
0.65
3.65
61
81.66
24.99
83.09
58.10
0.28
1.45
70
60.46
28.67
81.49
52.82
0.45
2.69
71
71.34
23.42
83.20
59.78
0.43
2.62
73
74.41
26.57
90.03
63.46
0.49
2.40
1.3发芽糙米中GABA增量与GAD酶活力相关性分析
内容：
分析GABA的生成与GAD酶活力的相关性。
10个品种的发芽糙米中04年测定的GABA的含量（gaba04）、05年测定的GABA含量（gaba05）、发芽后GABA的增量（gabadelt）、发芽糙米GAD酶活力（gad）、发芽糙米浆对谷氨酸的转化效率（eot）间的相关性分析见表4。
由表4可知，04年测定的10个品种发芽糙米中GABA含量与05年测定结果有显著的相关性，表明关于GABA生成的形状是可以稳定遗传的。
表410个品种的发芽糙米中04年测定的GABA的含量（gaba04）、05年测定的GABA含量（gaba05）、发芽后GABA的增量（gabadelt）、发芽糙米GAD酶活力（gad）、发芽糙米浆对谷氨酸的转化效率（eot）间的相关性分析表（R/α）
R/α
gaba04
gaba05
gabadelt
gad
eot
gaba04
1
0.6605/0.0376**
0.6426/0.0451**
0.3612/0.3045
0.2192/0.5430
gaba05
1
0.6346/0.0487**
0.4787/0.1616
0.2584/0.4711
gabadelt
1
0.7605/0.0107**
0.6752/0.0322**
gad
1
0.9254/0.0001***
eot
1
**表示显著；***表示极显著
糙米中的GABA的含量在12～30 mg/100g间，糙米经发芽后GABA的含量增长了2～5倍。
GABA的增量与GAD的酶活力和对谷氨酸的转化效率有显著的正相关性，表明糙米发芽后GABA的增量差异可能是由GAD的酶活力差异而引起的。
酶是基因表达的产物，因此可以通过遗传改良可获得高GABA产量的品种。
发芽糙米浆对谷氨酸的转化效率与提取上清中谷氨酸脱羧酶的酶活力间有极显著的相关性，表明发芽糙米浆转化谷氨酸的效率可以表征发芽糙米内谷氨酸脱羧酶的酶活力。
存在的问题及拟解决的措施
下一步工作计划
1.测定10种高GABA含量的糙米及低、中GABA含量的糙米发芽前后游离谷氨酸和总谷氨酸的含量。
2.测定低中高三类品种的糙米发芽过程中GABA、GAD酶活力及游离谷氨酸含量的变化。
导师审查意见
注：
每周需要口头向导师汇报研究情况，每一个月必须有课题研究进展的书面汇报材料。
研究内容及结果
工作时间
2006年3月20日至2007年4月28日
研究内容及结果
1.5高中低三类品种的糙米发芽过程中GABA、GAD酶活力、游离氨基酸的变化
内容：
选取高（61号，早籼）、中（38号，早粳）、低（65号，中籼）三类品种的糙米，在30℃浸泡6 h后于30℃发芽，分别于0h、8h、16h、24h、32h、40h、48h、56h、64h、72h、80h取样，测定其发芽糙米中GABA的含量（mg/100g FW）、GAD酶活力（IU/100g FW）和游离氨基酸含量的变化。
1.5.1不同水稻品种发芽糙米中γ-氨基丁酸含量
三种类型的稻米在不同发芽时间下发芽糙米中GABA的含量见图1。
糙米在发芽过程中GABA的含量不断上升，当发芽达60 h后，GABA的含量可达200～400 mg/100g。
在发芽的0～16 h间，GABA的上升速度缓慢，在24～56 h间上升速度不断增加，在发芽56 h后，GABA的增量较小。
三种类型的稻米在不同发芽时间下发芽糙米中GAD活性见图2。
61号和65号样品在发芽的前期GAD酶活性降低，在发芽24 h后，酶活力开始增加，而38号样品在发芽过程中GAD的活性变化不大，一直维持在一定的水平；在发芽达64 h后，GAD酶活力开始下降。
这与发芽过程中GABA的变化趋势是一致的。
糙米在发芽的0～16 h间主要是胚芽的萌发；在芽长至0.5～1 mm，发芽24 h后，胚根开始萌发，在发芽的24～64 h间，根会迅速生长至10～20 mm，而芽的生长缓慢；在发芽至64 h后，根和芽都生长缓慢，并出现分化。
可能在胚芽和胚根中有GAD的同功酶，在发芽的前期主要是胚芽中GAD酶的表达，而后期则有胚根中的GAD不断地激活，且在胚芽中的表达较胚根中的表达活性低；即发芽糙米中的GAD在胚芽和胚根中的表达活性及表达时间均有差异。
1.1.1不同水稻品种发芽糙米中γ-氨基丁酸含量
将图1中GABA的增量与图2中对应的GAD酶活力作相关性分析，结果表明，GABA的增量与对应的GAD呈显著的正相关性（N=30，F=5.96/α=0.0215）。
进一步表明糙米发芽过程中GABA的增加可以解释为GAD的激活，GABA增加速度的快慢可以反映GAD活性的高低，糙米发芽后GABA的增量的差异可能由GAD表达的差异而引起的。
存在的问题及拟解决的措施
下一步工作计划
1.测定低中高三类品种的糙米发芽过程中游离谷氨酸含量的变化；测定10种高GABA含量的糙米发芽前后游离谷氨酸和总谷氨酸的含量。
2.对不同品种类型发芽糙米谷氨酸脱羧酶同功酶的鉴定
导师审查意见
注：
每周需要口头向导师汇报研究情况，每一个月必须有课题研究进展的书面汇报材料。
升级会员 