铁细菌的分离及生理生化研究.docx

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铁细菌的分离及生理生化研究

摘要

铁细菌，是一类自氧菌和兼性自氧菌的通称，其种类很多，现在知道的有40多种。

这类菌存在于含有铁的环境，能利用将亚铁催化氧化成高价化合物的反应来满足其生命活动的需要，并把铁和（或）锰氧化物沉积在菌体荚膜内、鞘内或细胞外分泌物上。

目前，伯杰氏细菌分类手册第九版中铁细菌有七个属，其中有三个属至今未获得纯培养，还有一些生理生化的性质研究不完全，有需要继续深入研究的价值。

从微生物的角度来看，最普遍的问题是很难在实验室条件下分离和研究铁细菌，这些铁细菌是在有氧中性的条件下用氧化铁的方式储存能量。

当使用光学显微镜观察时，在周围铁浓度较高的环境中生长的菌有着如赫色纤发菌和锈色嘉利翁氏菌这些铁细菌特有的形态学特征，但是以别的方式观察微生物细胞不容易确定其具体种属。

我国大部分给水管网为铸铁、钢等铁制管材，铁细菌引起腐蚀特征为出水浊度、色度升高，伴有红褐色沉淀物，可能引起管道的堵塞及管壁腐蚀。

铁细菌不会直接造成人体健康问题，但会引起以下问题：

由于细菌死亡而产生的难闻气味；增加水中有机物含量，促使其他细菌繁殖；腐蚀管网和管道设备，产生的的腐蚀产物阻塞管道；增加硫细菌出现的机会；降低消毒效果。

本试验主要叙述了铁细菌的分离方法：

先是进行富集培养，结合平板划线、平板滴加法，进行分离和纯化。

将分离到的铁细菌接种于Winogradsky铁细菌液体培养基（铁细菌的特异培养基），观察Winogradsky铁细菌液体培养基产生红褐色沉淀的程度，选择产生沉淀时间短且沉淀程度好的菌株，得到七株均有菌落特征的单菌株。

然后将这七株单菌株进行复筛后得两株铁细菌的单菌株，经生理生化鉴定得知SLW03为赭菌属，SLW07为球衣菌属浮游球衣菌。

关键词：

铁细菌；分离；生理生化

Abstract

Theironbacteria,isonekindfromtheoxygenfungusandtheoptionalfromtheoxygenfungusgenericterm,itstypearemany,nowknowshas40manykinds.Thistypeofbacteriaexistsintheenvironmentwhereincludestheironion.Itcanmakeuseofferrouscatalyticoxidationreactionsintohigh-valuecompoundstomeetitsneedsoftheirlives,andironand（or）manganeseoxidedepositioninthecapsuleofthecell,sheathorcellsecretionsontheoutside.

Atpresent,Berger'smanualtypesofbacteriainthenintheditionofironbacteriahaveseven,includingthreehavenotobtainedthepureraiseuntilnow.Therearesomephysiologicalandbiochemicalnatureisnotveryknown,sothat’sneedtocontinuethefartherstudytoknowthevalue.Fromamicrobiologicalperspective,themostpervasiveproblemhasbeentheinabilitytoisolateorstudyprokaryotesinthelaboratorythatarecapableofconservingenergyfromironoxidationatcircumneutralpHunderoxicconditions.Thisproblemisreinforcedbythefactthatenvironmentswithhighironconcentrationsarecharacterizedbytheremainsofafewmorphologicallydistinct“ironbacteria”,suchasthesheathsofLeptothrixochraceaandthestalksofGallionellaferruginea,butotherwiseappearlargelydevoidofmicrobialcellswhenviewedbylightmicroscopy.

Mostofourcountry’swaterdistributionnetworkforthecastiron,steelandothermetalpipes,ironbacterialcorrosioncharacteristicsofthewaterforturbidity,increasedcolor,withreddish-brownsediments,maycausethepipewallplugandcorrosion.Ironbacteriadoesnotdirectlycausehumanhealthproblems,butwillcausethefollowingproblems:

Producestheunpleasantsmellasaresultofthebacteriumdeath;Increasesinthewateringtheorganiccontent,urgesothergermsmultiply;Corrodesthepipenetworkandthepipe-lineequipment,producescorrosionproductblockingpipeline;Increasesopportunitywhichthesulfurbacteriaappears;Reducesthedisinfectioneffect.

Thisexperimentmainlyelaboratedtheironbacteriaisolationmethod:

First,carriesontheenrichmentculture,withflatline,flat-paneldroppinglaw,separationandpurification.ItwillbeisolatedfromtheironbacteriainoculatedbacteriaintheliquidmediumWinogradskyRail（Railbacteriaspecificmedium）.ThenitcanobservetheWinogradskyironbacterialiquidmediatohaveareddish-brownliquidmediumlevelofprecipitation,precipitationchooseashorttimeandagoodlevelofprecipitationstrainofrehabilitationWefoundsevenstrainswhichhavecharacterizations.Atlast,wefoundtwoofthestrainsafterthesecondisolatingandphysiologicalbiochemistry.ThestrainofSWL03isOchrobium,andthestrainofSWL07issphaerotilusnatans.

Keyword:

Ironbacteria;Isolation;Physiologicalbiochemistry;

前言

铁细菌是一群在形态上和生理上都不完全相同的细菌，但其共同特征是能使水中铁的形式转化而沉淀，造成锈色水和形成腐蚀瘤（或称管瘤）引起管道堵塞，使生活或工业供水水质降低[1]。

铁细菌一般生活于含氧少但溶有较多铁及二氧化碳的水中，能在氧化二价铁成三价铁化合物的过程中起催化作用，并大量分泌氢氧化铁成基定形结构，同时从中获得能量以满足生命需要[2]。

铁细菌粘附在管壁上形成的红褐色疤和瘤，其中间往往为黑色，而在疤的下面是一个由于硫离子（H2S）存在形成的蚀孔（清洗后往往容易泄漏）[3]。

近年来，国内外对污水处理的研究异常重视，该方面的研究愈来愈多。

例如，对于氧化铁鞘细菌如球衣菌的分离纯化。

Stoke用紫花苜蓿作富集培养，然后以特定培养基进行划线分离[4]。

Phaup用含有KNO3的特殊培养液作富集培养，然后在同一成分的琼脂平板上划线分离[5]。

国内学者也对球衣菌的分离作了一些尝试。

薛林贵等人利用平板划线法、稀释平板法及畜集培养法对活性污泥中球衣菌进行分离纯化[6]。

翁稣颖等人则采用生态模拟加富集培养法对球衣菌进行了分离纯化[7]。

李惠珍等人针对鞘细菌伴生菌多的特点，采用选择培养基加富培养，并加抗生素及对絮状物在无菌水中多次漂洗，进行划线及点植，也取得了良好的分离效果[8]。

国外普遍采用生态模拟装置先进行富集，然后再在特定的平板上进行划线分离Mulder和Deinena报道了利用一种续流装置来模拟纤发菌的自然生境，这种装置不仅可用于纤发菌属的富集和分离，也可用于该菌的纯种培养[9]。

Emerson和Ghirose也报道了利用人工模拟的铁滋流池来进行富集和分离具鞘菌株L.discophora，该装置与Mufder等人的续流装置基本相同[10]。

Rouf和Stoke则利用装有苜蓿抽取液及固体MnCO3和新鲜Fe（OH）3固体的玻璃柱，入采来的各种水样进行富集，然后挑取絮状物在含有MnSO4的培养基上进行划线分离[11]。

而国内有关纤发菌的分离纯化，研究的人很少[12]。

一、铁细菌的种类

铁细菌[13]这一术语是1888年由Winogradsky首次提出的，又称铁氧化细菌。

铁氧化细菌广泛存在于生物圈的各个角落，它对推动铁的循环起着积极的作用[14]。

铁细菌是自养菌和兼性自养菌的通称，其种类很多，现在知道的就有40多种。

在淡水中常见的铁细菌有球衣细菌（Sphaerotilus）属，鞘铁细菌属（Siderocapsa），嘉氏铁柄杆菌（Gallionella）属，赭铁细菌属等。

铁细菌的生长需要铁，但对铁浓度的要求并不高和苛刻，一般在自来水总铁量为1～6mg∙L-1的水中，铁细菌都能很好的生长，其生长需要有机物，偏爱铁与锰的有机化合物。

这类有机物被利用后，铁和锰被作为废物排出，附着于细菌的丝状体上。

铁细菌是好氧菌，在弱酸性环境中对其发育有利，碱性水中不适宜铁细菌生长，最佳生长期是7～10d[15]。

二、铁细菌的危害

铁细菌在油田工业中存在许多危害，如加速管道的腐蚀，造成输水设备和管线以及回注时地层的堵塞等，所以在油田对回注水和外排水进行处理时，铁细菌数量是一项严格控制的指标，通常需要加入杀菌剂来控制铁细菌的繁殖和数量要对铁细菌进行严格控制，就要：

（1）准确了解铁细菌的群落结构，并且根据铁细菌群落组成来针对性地选择杀菌剂和优化杀菌工艺；

（2）对铁细菌进行快速检测，以便及时了解水体中铁细菌的数量，调查铁细菌的控制效果，通过调整处理工艺，从而有效地控制铁细菌的生长和繁殖，避免或减少铁细菌的危害[16]。

三、影响铁细菌的生长因素

铁细菌的种类比较多，彼此之间的生理生化性质相差较大，有的必须在酸性条件下才能生存，有的生存于中性条件下，有的为专性自养菌，而有的则为兼性异养菌，其生长繁殖的影响因素很多。

这里简要介绍对铁细菌的生长繁殖影响较大的几个因素，如：

COD、DO、温度等。

1、COD的影响

大部分铁细菌为自养菌，因此，水体中的有机质会对铁细菌产生毒害作用。

也有一部分细菌为异氧菌，在较低的COD下能够生存。

EricA．Marchand[17]和JoannSilverstein[17]的研究发现：

在最适pH、溶解氧以及污泥浓度下，当葡萄糖的浓度为1000mg∙L-1时，异养铁细菌的生长会受到抑制。

但当向铁细菌的培养液中通人含有5％的CO2的空气时，铁的氧化速率可以提高，并且可以降低葡萄糖的抑制作用。

北京燕山石油化工公司研究院[18]的研究表明：

当COD在25～80mL范围内时，铁细菌基本保持不变；而当COD在80～500mg∙L-1时，铁细菌随时间的推移数量有所上升。

2、DO的影响

铁细菌多为好氧菌，因此DO对铁细菌的生长起着极为重要的作用。

关于这方面的研究，国内外有大量的报道。

CatherineV.Tremblay[19]使用铁细菌去除进水pH为5.7的水体中的铁，通过使用氧化还原电位（ORP）决定生物滤池中DO和残余的铁浓度的关系。

结果表明：

只要大于最低DO的值，残余的铁浓度和ORP不受溶解氧改变的影响。

当ORP处于300～470mV范围内时，可以通过这一关系预测水中残余的铁浓度。

国内，姜安玺[20]等人也认为含有铁细菌的生物滤层除铁除锰不需要高溶解氧，也不需要通过散除CO2来提高原水的pH值，相反CO2可作为微生物繁殖代谢的碳源。

简单的曝气充氧方式与生物滤池的结合可大大简化传统的处理流程。

DO为0.7mg∙L-1时，铁细菌在生物除铁过程中就能起着很重要的作用。

3、温度的影响

反应速度与微生物的活性有关，而温度可以改变微生物的活性。

P.D.Franzmann[21]等人认为铁细菌的活性与温度有着极为密切的联系，通过使用Ratkowsky方程可以估算出保持微生物活性的几个主要温度（TMIN，TOPT以及TMAX），该结果与以前文献报道的类似，但是更精确。

他们认为铁细菌的最适生长温度为30～50℃之间。

这为我们以后更清楚地了解铁细菌的生理生化性质奠定了理论基础。

四、铁细菌的应用及展望

目前，伯杰氏细菌分类手册第九版中铁细菌有七个属，其中有三个属至今未获得纯培养，还有一些生理生化的性质不是很清楚，有需要继续深入研究的价值。

我国大部分给水管道采用的管材为铸铁、钢等铁质管材。

在管网水的输配过程中，铁质管材腐蚀现象严重，造成了供水管网的二次污染，这是由于电化学反应以及微生物促进作用所致。

铁细菌的初步筛选有利于进一步了解其腐蚀机制，从而有效地控制铁细菌的生长和繁殖避免或减少铁细菌的危害。

随者人们环境保护愈识的增强，开展铁细菌除铁除锰的研究将成为一项具有重要意义的课题。

因为铁细菌对环境保护，特别是对污水处理和城市饮用水净化起着重要作用。

本着这一目的，分离铁细菌有利于更好的解决这些环保问题，分离和生理生化鉴定实验结果报告如下。

第一章铁细菌的分离

1材料与方法

1.1材料

1.1.1水样

由沈阳农业大学微生物教研室提供

1.1.2主要仪器

SW-CT-2FD医用型净化工作台苏净集团安泰公司制造

07722型电子天平上海精密科学仪器有限公司制造

LDZX-40C型立式自控电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂

DHG-9141A型电热恒温干燥箱上海精宏实验设备有限公司

超速离心机SCR20BC日本

DZF-6020型真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司

电子万能炉北京市永光明医疗仪器厂

722型光栅分光光度计山东高密彩虹分析仪器有限公司

XS-212型生物学显微镜南京江南光电（集团）股份有限公司制造

1.1.3药品及主要试剂

尿素、葡萄糖、七水硫酸镁、磷酸氢二钾、硝酸钾、蛋白胨、酵母膏、甘油、琼脂、氯化钙、氯化铁、牛肉膏、氯化钠、硝酸铵、硝酸钠、柠檬酸铁铵、硫酸铵。

（以上均为分析纯试剂，用于各种培养基的制备。

）

10%的盐酸溶液；

2%的亚铁氰化钾溶液：

2g亚铁氰化钾，100mL蒸馏水；

结晶紫溶液：

1.00g结晶紫，95%乙醇20mL，1%草酸铵水溶液80mL；

美兰溶液：

0.30g美蓝，95%乙醇30mL，0.01%氢氧化钾溶液100mL；

盐酸溶液：

浓盐酸50mL，蒸馏水50mL等比例混合溶液；

氨水溶液：

浓氨水50mL，蒸馏水50mL等比例混合溶液；

乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH≈4.5）：

136g乙酸钠（CH3COONa·3H2O）溶于800mL水中，加入冰乙酸57.6mL，稀释至1L；

2g∙L-1的邻菲啰啉溶液：

0.20g邻菲啰啉，100mL蒸馏水（由于邻菲啰啉不溶于水故配置过程需要加热）；

20g∙L-1的抗坏血酸溶液：

2.00g抗坏血酸，100mL蒸馏水；

2g∙L-1的硫酸亚铁溶液：

0.20g硫酸亚铁，100mL蒸馏水。

1.1.4培养基的制备

1.1.4.1富集培养基（g∙L-1）

尿素培养基：

尿素0.5，葡萄糖1.0，七水硫酸镁0.05，磷酸氢二钾0.1,pH自然。

硝酸钾培养基：

硝酸钾1.0，葡萄糖1.0，七水硫酸镁0.05，磷酸氢二钾0.1,pH自然。

以上培养基加一定量的蒸馏水溶解，定容后，分装试管；包扎后，于121℃高压灭菌30min备用。

1.1.4.2斜面、平板分离培养基（g∙L-1）

CGY培养基：

蛋白胨5.0，酵母膏1.0，甘油10.0，琼脂20.0，pH自然。

Stoke培养基：

葡萄糖1.0，蛋白胨1.0，七水硫酸镁0.2，氯化钙0.05，氯化铁0.01，pH7.0。

肉汤培养基：

蛋白胨10.0，牛肉膏5.0，氯化钠5.0，琼脂20，pH7.6~7.8。

以上培养基加以上培养基加一定量的蒸馏水溶解，CGY培养基定容后，加入称好的琼脂，加热至熔化，包扎后121℃高压灭菌30min，灭菌完成后趁热摆斜面凝固后方可使用；Stoke培养基和肉汤培养基定容后，移入三角瓶中，灭菌完成趁热到入已灭的培养皿中，待冷却凝固后方可使用。

1.1.4.3初筛培养基（g∙L-1）

Winogradsky铁细菌培养基：

硝酸铵0.5,硝酸钠0.5,磷酸氢二钾0.5,七水硫酸镁0.5,氯化钙0.2，柠檬酸铁铵10.0，pH自然。

以上培养基加一定量的蒸馏水溶解，定容后，分装三角瓶中，包扎后121℃高压灭菌30min备用。

1.1.4.4复筛培养基（g∙L-1）

Fe2+营养培养基：

硫酸铵0.5,硝酸钠0.5,磷酸氢二钾0.5,七水硫酸镁0.5,氯化钙0.2，柠檬酸铁铵10.0，pH7.0。

以上培养基加一定量的蒸馏水溶解，定容后，分装摇瓶中，包扎后121℃高压灭菌30min备用。

1.2方法

1.2.1灭菌

本实验试管培养基、斜面培养基、平板培养基、三角瓶和摇瓶中的培养基采用高压蒸汽灭菌法：

先打开开关预热高压灭菌锅，将包好的试管放入湿热灭菌锅中，塞好胶皮套，拧紧锅盖，放净冷气有热气冒出开锅后关闭气阀。

之后等压气上升，当上升到121℃时，控制温度，灭菌30min即可。

30min后关闭开关，待指针归零后开盖取出各种培养基。

在无菌操作室中摆放成斜面，斜面的总长度不超过试管总长的2/3为宜。

将三角瓶内的培养基在无菌操作的条件下倒入已灭的培养皿中，置于无菌室中等待接种。

1.2.2无菌操作

操作前先将培养基及接种所用的给工具放在无菌室内的超净工作台上，打开超净工作台的电源，打开超净工作台的紫外灯，而后打开无菌室的紫外灯同时打开无菌风，灭菌30min后关闭紫外灯。

经20min后（无菌风吹淋）,方可开始实验。

进入无菌室，先将超净工作台面用75%的酒精擦拭一遍，将酒精灯摆放好后，点燃酒精灯，在火焰上方进行如到平板、接种等操作，操作完毕后关闭电源，清理物品。

1.2.3铁细菌的富集和分离方法[22]

1.2.3.1富集培养

采用试管静止富集培养法：

分别吸取各种水样0.5mL，接入装有4.5mL富集培养基的试管中，28℃静止培养48h。

如发现有半透明絮状小团块漂浮于液体中，小心用接种针先挑取出少量，进行涂片镜检（2%的亚铁氰化钾溶液和10%的盐酸溶液，观察普鲁氏兰反应）。

若为普鲁氏兰阳性反应，可疑为铁细菌，即可进行分离。

1.2.3.2分离培养

将富集培养液内出现的絮状团块，用接种环挑出在Stoke培养基琼脂平板上划线分离，经28℃培养60h后，对光仔细检查，如在划线条的两侧边缘有丝状体紧贴平板向外伸出，可用低倍镜进行初步镜检（观察普鲁氏兰反应和结晶紫或美兰溶液进行简单染色），如为铁细菌，应及时挑取里中间杂菌较远的丝状体，在新的平板上进一步划线分离，重复划线分离3~4次，即可得到初步纯化的铁细菌。

1.2.3.3斜面培养及单菌落的分离

根据铁细菌在高营养浓度下易形成大量游离单个菌体的特点，把筛选的菌株转接与CGY斜面培养基中，使之形成大量单菌体，然后用无菌水制备成适当浓度的菌悬液，在Stoke培养基平板上进行涂布分离，即可获得由单个菌体形成的具特征性的铁细菌单菌落。

然后使用结晶紫或美兰溶液进行简单染色，观察铁细菌的细胞形态和细胞鞘的情况。

1.2.3.4菌株纯度鉴定

把分离纯化到的铁细菌接到液体及固体肉汤培养基平板中，在28℃培养48h后，若液体管内不出现浑浊，平板上不长出杂菌落；同时菌株在CGY及Stoke平板培养基上又可形成均一具特征的铁细菌单菌落，再结合镜检无异样细胞发现，即可证明获得的铁细菌为纯培养物。

1.2.3.5铁细菌的初筛

将分离到的铁细菌菌株接种于Winogradsky铁细菌液体培养基中，于28℃下进行培养，每隔0.5d观察培养基产生红褐色沉淀的程度，选择产生沉淀时间短且沉淀程度好的菌株进行复筛。

1.2.3.6铁细菌的复筛

将初筛出来的菌株接入新鲜的CGY斜面培养基中，先活化菌种，而后制成菌悬液以2%的接种量介入装有Fe2+营养液的玻璃瓶中，于28℃，1500r∙min-1振荡培养3d，将发酵液于4℃下，4000r∙min-1离心10min去菌体，取上清液测定铁氧化酶的活性，选取酶活最高的菌株作为近一步研究。

1.2.3.7酶液的制备

将发酵液于4℃下，4000r∙min-1离心10min，去除菌体及不溶物，上清液以硫酸铵沉淀得粗酶，溶于适量pH7.0的HEPES缓冲液中，装入透析袋内置4℃冰箱中透析至不含有NH4+和SO42-得初步纯化的酶液，用于酶学特性分析。

1.2.3.8铁氧化酶活力的测定

参照TMPD法[23]，吸取粗酶液1mL，加入FeSO4至200mg∙L-1,30℃静止反应30min，然后按邻啡啰啉法[24]进行测定。

（测定吸光度前10000r∙min-1离心10min去除沉淀物,去上清液）

相对酶活（%）=（1/氧化率最高值）×每项氧化率

氧化率（%）=（1-OD平均值/OD空白值）×100%

（OD平均值为两个平行测定值的平均值；OD空白值为未接菌组测定值。

）

2结果与分析

2.1铁细菌的分离结果

经过试管静止富集培养，结合平板划线、稀释涂布法成功地从水样中分离到7株铁细菌。

结果表明这两种不同的富集培养基对于铁细菌的分离效果有明显差异，其中以尿素培