细胞工程学习指导11Word下载.docx
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接种室进行材料的接种。
外设缓冲间—放置拖鞋.工作服.工作帽等。
要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。
培养室植物材料的无菌培养。
外设缓冲间—放置拖鞋.工作服等。
首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。
细胞学实验室进行培养材料的组织学.细胞学.观察照相等。
要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。
生化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化基本设备配置验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。
2.灭菌方法有哪些，各有何利弊
1.高压蒸气灭菌；
2.燃烧灭菌；
3.干热灭菌：
易引起火灾；
4.射线灭菌：
适于不耐高温材料。
培养基：
湿热灭菌，即高压高温蒸汽灭菌.
玻璃器皿：
湿热灭菌或干热灭菌.
金属器皿：
干热灭菌.
接种室：
接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常用甲醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾
3.培养基基本类型
MS---无机盐浓度高，微量元素种类齐全，养分均衡。
应用最广，特别是培养再生植物。
B5---含较高硝酸盐、较低的铵盐，较高的VB1，用于细胞悬浮和原生质、葡萄、豆科植物的培养。
N6---较高硝酸盐、较低的铵盐，禾本科花药培养和柑橘类植物的花药培养。
.
Nitch---无机盐浓度高，
White----低盐培养基，用于生根培养。
4.培养基基本成分
水------水既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，它占培养基成分的95％。
原生质体培养、细胞培养以及分生组织培养一般应使用双蒸水或超纯水.如果是大批量的快速繁殖培养，则可使用一般蒸馏水或纯净水以降低生产成本，提高生产效益。
无机盐类大量元素-----培养基的使用量一般在每升几十至几千毫克。
包括C、H、O、N、P,K、Ca、Mg、S
微量元素------微量元素的用量一般低于10-5～10-7克分子浓度。
有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co
糖----是碳源和能源，多利用蔗糖，
维生素---B1是必需的，B6、烟酸等，原生质培养含有大多数基本维生素。
氨基酸---细胞原生质培养特别需要，水解酪蛋白，
激素----细胞分裂素--BA（6－苄基酰嘌呤）、KT（激动素，糠基酰嘌呤）、ZT（玉米素）、2iP（异戊烯酰嘌呤，生长素--2.4-D，IAA，NAA，赤霉素：
GA3，乙烯及乙烯抑制
琼脂、卡拉胶-----固体培养
活性炭-----防止外植体变褐
附加复合成分----椰子汁、酵母提取液
5.培养基的固化剂有哪些，作用是什么?
琼脂、Gelrite、塑料泡膜、玻璃丝、岩棉、玻璃珠、Gala胶。
作用：
束缚水分、吸收化合物
6．.常有哪些物质需过滤消毒
IAA、ZT、GA3及某些维生素、抗生素、酶、植物提取物、秋水仙素等。
7.培养方式
固体培养---培养基中加入0.6--1.0%琼脂、卡拉胶等，
液体培养---无凝固剂，分静止、震荡悬浮培养两种
悬浮培养---成批、半成批、连续培养
单细胞培养----微室、平板、看护培养
8.外植体概念及其选择
外植体（explant）是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。
外植体的来源----用于外植体分离的母体植物材料一般有三种来源：
一是生长在自然环境下的植物；
二是有目的培育、在温室控制环境条件下生长的植物；
三是无菌环境下已经离体培养的植物。
在不影响培养目的的前提下尽可能选择自然繁殖器官作外植体；
一、二年生草本植物的离体培养比多年生植物容易；
生长季节和营养生长阶段生长启动快、分化快。
木本植物的预处理---可将成年树的芽嫁接在实生苗上，或修剪促其新枝条产生，或对亲本植株进行高水平施肥，或用细胞分裂素喷洒植株，或进行扦插繁殖等多种措施，使亲本植株部分地返回年轻状态之后，再从亲本植株上采取外植体，这些措施有可能提高成年树外植体的活力
9.防止离体培养中材料变褐的方法
对培养基的防褐有三种方法：
一是在培养基中加抗坏血酸、柠檬酸或半胱氨酸；
或用抗氧化剂浸泡外植体后再接种；
或是在培养基中加入1％的活性炭吸附褐色醌类物质；
或加入多胺类物质，如精胺、亚精胺通过刺激细胞分裂，加速组织生长，减少褐化
二是减少光照强度或在黑暗条件下培养
三是将外植体不断地转移到新鲜培养基，最好的办法是外植体在瓶内转移到无褐色物质的部位。
这三种方法以第三种瓶内转移法最简便、经济（节省培养基）和有效。
10.植物材料的常规消毒步骤
1.预处理－修理。
2.消毒：
消毒液浸泡。
3.材料内部带菌处理。
11.植物材料内部带菌处理方法
1.茎尖分生组织培养。
2.培养基中加入抗生素。
12.外植体灭菌方法
一次消毒程序-------先将采集的植物材料用纱布或尼龙网扎紧瓶口置于流水条件下冲洗数小时。
接着用70％～75％的酒精漂洗植物材料数秒至半分钟，以破坏有些植物材料蜡质化表面的张力。
再用消毒剂消毒。
二次消毒程序-----即在外植体培养3d左右再行一次消毒。
灼烧法消毒------有的植物材料如胡萝卜储存根可采用，即将块根于95％酒精中浸一下，置于酒精灯上灼烧，然后去除表面层，切取无菌韧皮部接种培养。
降压法------即将植物材料与消毒液一起置于真空抽气瓶中抽气，以使消毒液渗入植物材料的表面，达到消毒的目的。
浸没法------如五针松枝条，可浸没在较低浓度的次氯酸钠（钙）消毒剂中浸泡一段时间，然后按常规消毒程序再进行一次消毒，效果也甚佳。
木本植物消毒--------在树木冬季休眠期采取休眠枝条，经灭菌后放于2-4冰箱冷藏40-50天，以破除休眠；
然后取出枝条再经灭菌，放入40-50温水中（无菌水），在温室中进行温浴2-4小时；
再浸泡在含有细胞分裂素和赤霉素的水溶液中，在30温室中及连续光照下催芽，当枝条长到6-8厘米是即可采取常规消毒方法取茎芽切段进行离体培养，
13.详述影响组培的因素
植物因素：
基因型，植物年龄，组织和器官的年龄，植物的生理状态，取材年份及生长条件，取材部位及大小。
培养基因素：
无机盐；
有机化合物；
植物激素；
天然提取物；
琼脂；
PH值；
渗透压；
活性炭。
.环境因素：
光照：
包括光强.光质.光周期。
温度。
湿度。
气体。
14..控制组培中形态建成的激素模型
生长素与细胞分裂素的比例
15..植物激素的主要生理作用
影响培养中器官建成
16.离体培养条件及其控制
组织培养通常在散射光线下进行。
有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根（光照时间影响植株再生状态）
温度：
在大多数情况下，适温有利于细胞分裂，即可以提高细胞分裂速率，而适当提高温度则有利于细胞伸长，在一定范围内降低培养温度则使细胞分裂和生长速度均减缓，而且使细胞的质量增加。
对大多数植物组织20～28℃即可满足生长所需，其中26～27℃最适合。
渗透压：
渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。
在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。
通常1～2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。
通气：
悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。
小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。
大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。
pH：
通常使用的pH值范围是5.5～6.5。
pH在4.0以下或7.0以上培养物就不能正常生长。
第二章细胞全能性与形态发生
1.细胞的全能性〔totipotency〕概念
指每个植物细胞都具有形成完整植株的能力，因为每个细胞都具有全套的遗传基因，无论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。
条件是有生命力的核和完整的膜系统。
细胞全能性的绝对性与相对性:
不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应;
即使对于植物细胞而言，细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体;
动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。
2.名词解释
分化〔differentiation〕：
细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。
脱分化〔dedifferentiation〕:
已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。
再分化〔redifferentiation〕:
脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。
愈伤组织〔callus〕:
在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。
胚状体〔embroid〕:
—对应于胚〔embryo〕，在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。
继代培养：
更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。
3、脱分化细胞的特点
细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。
在这些变化中，液泡蛋白体的出现和质体转变为原质体被认为是细胞脱分化的重要特征。
4、细胞脱分化的调控机理
细胞脱分化调控的实质即是G0期细胞回复到分裂周期的调控过程
细胞周期蛋白（cyclin）和依赖周期蛋白激酶（CDKcyclin-dependentkinase）是两类主要的调控分子。
细胞周期运行的动力主要来自CDK，其活性则主要通过cyclin调节和依赖周期蛋白抑制子（CKIcyclin-dependentkinaseinhibitor）的负调节。
植物激素是离体培养中所必需的条件，因此与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。
5、细胞脱分化与愈伤组织形成
细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂，
脱分化与愈伤组织的形成在性质上是不能等同的，脱分化是细胞生理状态的改变，而形成愈伤组织是离体培养中的一个阶段。
尽管细胞脱分化后进入细胞分裂的结果，在大多数情况下是形成愈伤组织，但绝不是说所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织，许多试验表明，有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。
愈伤组织内的细胞并不是均一未分化的，即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定差异，特别是在组织器官培养时，往往出现部分细胞不完全脱分化的现象，从而使其很容易再分化再生植株，这对培养来说无疑是十分有利的。
6、细胞分化概念及其特点
指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能，这是在时间上的分化；
同一种细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态和机能，这是在空间上的分化
从分化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应，所以，分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的各种不同的表现型。
通常把离体培养中TE（TEtrachearyelements）细胞的出现作为组织分化的标志
7、极性（polarity）
所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。
在很多情况下，细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志。
8、影响脱分化和再分化的因素
激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。
在众多植物离体培养中证明，细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用，它们的量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要调节作用。
在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样。
如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化；
反之，则有利于细胞分化。
如果两者同时处理，则可促使分化频率的提高
9.根据外植体不同可分为几类?
胚胎培养，器官培养，组织培养，细胞培养，原生质体培养。
10.根据培养方式不同可分为几类?
固体培养，液体培养，半固体培养，双层培养。
11.简述离体培养中植株的形态建成
⒈通过愈伤组织分化芽，再分化根。
⒉直接分化芽和根。
⒊直接分化根，再分化芽。
⒋外植体直接产生胚状体。
12.植物的离体器官发生方式及过程
离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程
器官发生方式---有先生芽后生根、先生根后生芽、根芽同时生长三种方式
器官发生过程------有经过愈伤组织的器官发生过程和不经过愈伤组织的器官发生两种过程。
第一种过程是从愈伤组织---生长中心----器官原基
第二种过程中一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。
另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。
这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。
13.器官发生途径中芽再生方法有哪些？
诱导腋芽。
诱导不定芽。
从茎尖或顶端分生组织中诱导。
14..愈伤组织类型及特征
结构致密型：
表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，易于再生芽
结构松散型：
多为白色，可以用于悬浮系建立。
胚性愈伤组织：
具有产生胚状体能力。
15.影响芽分化的因素
外植体：
种类及基因型，外植体供体植株及外植体本身生理生化特征，包括供体植株年龄、发育阶段、生长环境、取材位置，外植体大小，外植体极性
培养基成分：
基本培养基，生长调节物质，其它成分
环境条件：
光，温度
16.起始材料对器官分化的影响
总体上说，被子植物比裸子植物容易培养，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成功的报道最多。
通常情况下，自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力
同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异已是不争的事实。
基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。
外植体对诱导反应及其再生能力的影响体还现在生理状态上，来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养。
对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。
一、二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大，但仍以自然繁殖器官为外植体更易成功。
17.光照对器官分化的影响
光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、强度以及光质对器官分化均有影响。
连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照周期则有利于极性建立和形态发生。
培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。
光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。
光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关
18.体细胞胚或胚状体概念
离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞）
其一，体细胞胚是离体培养的产物，只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；
其二，体细胞胚起源于非合子细胞，单细胞起源，以区别于合子胚；
其三，体细胞发育程序同合子胚相似，经过了胚胎发育过程，也经过球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚，以区别与离体培养中器官发生形成个体的途径
其四，和周围细胞之间有隔离。
其五，和培养物质没有维管束联系，所以容易从培养物质上剥离。
其六，可以在不附加任何激素的培养基上萌发。
19.体细胞胚的形成途径
直接胚状体发生---细胞胚从外植体上直接产生。
间接胚状体发生-----经过愈伤组织的体细胞胚形成，或经过悬浮细胞的体细胞胚形成。
由花粉产生的单倍体胚状体。
由原生质体产生胚状体
20.体细胞胚的发育结构特点
与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点：
一是体细胞胚具有双极性（doulblepolarity）；
有分化明显的生物两端，根端和芽端。
二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现所谓的生理隔离（physiologicalisolation）现象。
与合子胚比较：
合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构；
合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，体细胞胚的子叶常不规范；
与相同植物比较体细胞胚的体积明显小于合子胚；
在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异；
并且，体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程。
合子胚在胚胎发育完全进入子叶期胚以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠，而体细胞胚则直接形成植株；
在不同的培养条件和植株种类中，形成植株的胚胎时期有所不同，一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植株。
胚状体原始细胞特征：
原生质浓厚，细胞核较大，处于细胞质中央。
胚状体异常现象
单片子叶；
多子叶；
杯状胚状体；
柱状胚状体。
21.影响体细胞胚发生的因素
激素的调控作用----2,4-D是应用最为广泛的生长素。
2,4-D的应用有规律性的变化，首先是在较高浓度下诱导胚性细胞的形成，然后在降低2,4-D的浓度下产生早期胚胎，一般在球形胚形成后，除去生长素有利于体细胞胚的继续发育。
细胞分裂素对体细胞胚发育的影响研究报道较少，但几乎所有的有关体细胞胚胎发生的培养基配方中，均有细胞分裂素的配合使用。
细胞分裂素在促进细胞分裂，维持细胞活跃生长中具有重要生理功能，而完成体细胞胚胎发育细胞分裂是基本前体，当胚胎结构建立后，细胞分裂素对于维持分生组织正常发育具有重要作用。
22.体细胞胚培养的培养基及培养条件的影响
培养基中的氮源亦会显著影响离体条件下的胚胎发生，一些氨基酸可以代替还原态氮的作用，
一些体细胞胚规模生产模式的试验还发现，球形胚形成后，如果降低培养基无机盐浓度，可以显著促进体细胞胚的进一步发育。
一些试验中还发现，体细胞胚发育后期降低蔗糖浓度，也有利于胚的继续发育和提高体细胞胚的成苗率
第三章原生质体培养及体细胞杂交
1、原生质体的概念
原生质体：
指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。
亚原生质体：
在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。
它可以具有细胞核或没有细胞核。
核质体：
由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。
也称为微小原生质体（miniprotoplast）。
胞质体：
不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。
2、原生质体研究进展植物原生质体培养研究中几个值得提出重要成就：
1880年，Hanstein首次起用原生质体（protoplast）一词。
1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。
1971年，Takebeetal.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。
1986年，Spangenbergetal.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。
据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。
其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。
3、原生质体研究的意义
植物原生质体之所以能成为植物细胞工程的理想研究材料，是因为它具有以下重要特点：
①易于从同一种植物材料的组织中获得大量的遗传上同一的游离原生质体，为植物细胞的遗传操作的微生物化奠定了基础；
②可以像动物细胞一样，被诱导与其他物种的原生质体融合，从而有效地克服了不同物种细胞之间的有性不亲和障碍，为实现远缘物种间的体细胞杂交，培育新种提供了新的手段；
③它既可以捕获外源DNA，也可以捕获较大的细胞器，如病毒颗粒、叶绿体、线粒体等，因此是植物遗传转化的理想受体；
④保持着植物细胞的全能性，在适宜的培养条件下，可以重新长出细胞壁，进行细胞分裂、分化，形成完整的小植株；
⑤植物原生质体虽然没有细胞壁，但仍然进行着植物细胞的各种生命活动，包括蛋白质和核酸的合成，光合作用，呼吸作用，通过膜向外界进行物质交换等。
4、制备原生质体的外植体、预处理及分离措施
用于分离原生质体的常用材料是无菌试管苗叶片,上胚轴和子叶,
培养细胞
预处理条件：
在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。
用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。
不同植物及材料类型预处理方法不同。
叶片脱壁方法：
酶包括纤维素酶、果胶酶处理，其浓度比例随年龄和生理而变化。
5、原生质体的收集和纯化方法
飘浮法：
常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。
沉淀法：
常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。
6、原生质体活力测定
目测法：
在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。
FDA法：
FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。
伊凡蓝法：
伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。
7、影响原生质体活力的因素
分离材料的生理状态
酶解条件：
酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压
分离条件：
离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间
操作环境的温度、分离用具的影响
8、原生质体培养基
大量元素浓度中注意NO3-和NH4+的比例；
Ca2+浓度；
有机成分中含有
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