微生物计数USP61中文版.docx
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微生物计数USP61中文版
微生物计数USP61中文版
微生物计数检测需氧菌总计数USP<61>
USP<61>中文版美国药典微生物限量
61）微生物限度检测（MICROBIALLIMITTESTS）
此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。
如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。
在样品检测过程中须进行无菌操作。
若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在30—35?
的培养箱内培养24至48小时;“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。
准备实验（PreparatoryTesting）
本章涉及实验结果的有效性取决于:
提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。
因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基:
金黄色（奥里斯）葡萄球菌（Staphylococcusaureus）,大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）,铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）,和沙门氏菌（Salmonella）。
方法如下:
将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培养物，加1ml（微生物）培养液到磷酸（盐）缓冲液（pH7.2），液体大豆酪蛋白消化物培养基（FluidSoybean-CaseinDigestMedium），或者液体乳糖培养基（FluidLactoseMedium）。
相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序:
（1）增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变;或者
（2）中和一定数量的干扰因子;或者
（3）结合
（1）、
（2）得出适当条件，使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用:
大豆卵磷脂（soylecithin,0.5%）或者聚山梨醇酯20（polysorbate20,4.0%）。
然后重复前面的实验，用液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20（FluidCaseinDigest-Soy
lecithin-Polysorbate20Medium）论证待测样品里的防腐剂或其他抑菌因子被中和。
若产品中含有抑菌物质且产品是可溶性的，则采用“无菌实验（SterilityTests<71>）”里的“薄膜过滤法（MembraneFiltrationMethod）”进行（微生物限度）检测会更适宜（suitable）。
在抑菌物质得以适当中和、稀释液体积大幅度增加后仍不能排除抑制因子，以及不适宜用“薄膜过滤法”的情况下，可能会因为产品本身的杀菌作用导致细菌无法生长。
当产品不能
检测出接种菌种的情况下，应用光谱法确定产品的抑菌/杀菌成分。
缓冲液和培养基（BufferSolutionandMedia）
按照下列配方配制培养基，或者使用规范厂商生产的培养基干粉进行培养基配制，所使用的干粉培养基应该与在此列出的培养基成分比例相似。
在按列出的配方进行培养基配制时，用水溶解固体物质，必要时可以加热以得到完全溶解的均匀溶液。
在使用前用盐酸或氢氧化钠将培养基的pH值调节到要求范围，调节pH值应在25?
2条件下进行。
若培养基配方有琼脂，应使用湿度不超过15%的琼脂。
溶解水为纯化水（PurifiedWater）。
PH7.2磷酸（盐）缓冲液储备液—称34g磷酸二氢钾于1000mL容量瓶，加水500mL溶解。
用氢氧化钠TS调节pH至7.2?
0.1（约175mL），然后加水至容量瓶刻度，混匀。
分装溶液后灭菌。
冰箱保存。
培养基
除另有指出，培养基应在高压灭菌器中加热灭菌。
（见<1211>“灭菌”章节中的“蒸汽灭菌”）。
保存时间（exposuretime）取决于培养基的灭菌体积。
1、液体酪蛋白消化物-大豆卵磷脂-聚山梨醇酯20培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------20g
大豆卵磷脂---------------------------5g聚山梨醇酯20-----------------------40mL水---------------------------------------960mL将胰腺酪蛋白消化物和大豆卵磷脂溶解于960mL水中，48~50?
水浴加热约30分钟得均匀溶液。
加40mL聚山梨醇酯20，混匀，按需要分装。
2、大豆酪蛋白消化物琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------15.0g大豆粉木瓜蛋白酶消化物---------5.0g（PapaicDigestofSoybeanMeal）
氯化钠---------------------------------5.0g琼脂------------------------------------15.0g水---------------------------------------1000mL灭菌后pH值:
7.3?
0.2
3、液体大豆酪蛋白消化物培养基
按照<71>无菌试验里的方法进行配制。
SoybeanCaseinDigestMediumunderSterilityTests<71>.
酪蛋白胰酶消化物------------------17.0g
大豆粉木瓜蛋白酶消化物---------3.0g
氯化钠---------------------------------5.0g磷酸氢二钾---------------------------2.5g葡萄糖（C6H12O6H2O）--------2.5g
纯化水---------------------------------1000mL
4、甘露醇-盐琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
动物组织胃蛋白酶消化物---------5.0g
牛肉膏---------------------------------1.0gD-甘露醇------------------------------10.0g氯化钠---------------------------------75.0g琼脂------------------------------------15.0g酚红------------------------------------0.025g水---------------------------------------1000mL混匀，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值:
7.4?
0.2
5、Baird-Parker琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
牛肉膏---------------------------------5.0g酵母膏---------------------------------1.0g氯化锂---------------------------------5.0g琼脂------------------------------------20.0g氨基乙酸（糖胶）------------------12.0g
丙酮酸钠------------------------------10.0g水---------------------------------------950mL搅拌加热，煮沸1分钟。
灭菌，冷却至45~50?
，然后加入10mL灭菌后的亚碲酸钾（1:
100）和50mL乳状蛋黄。
轻柔混匀，。
。
。
。
。
。
6、Vogel-Johnson琼脂培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
酵母膏---------------------------------5.0g甘露醇---------------------------------10.0g磷酸氢二钾---------------------------5.0g（DibasicPotassiumPhosphate）
氯化锂---------------------------------5.0g氨基乙酸（糖胶）------------------10.0g
琼脂------------------------------------16.0g酚红------------------------------------25.0mg水---------------------------------------1000mL溶解后煮沸1分钟。
灭菌，冷却至45~50?
，然后加20mL灭菌后的亚碲酸钾（1:
100）。
灭菌后pH值:
7.2?
0.2
7、溴棕三甲铵琼脂培养基
白明胶胰酶消化物------------------20.0g
氯化镁---------------------------------1.4g硫酸钾---------------------------------10.0g琼脂------------------------------------13.6g溴棕三甲铵---------------------------0.3gCetylTrimethylammoniumBromide（Cetrimide）
丙三醇---------------------------------10.0mL水---------------------------------------1000mL
将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值:
7.2?
0.2
8、假单胞菌琼脂培养基检测荧光生二氢荧光素
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
动物组织胃蛋白酶消化物---------10.0g
无水磷酸氢二钾---------------------1.5g
硫酸镁（MgSO4?
7H2O）-------1.5g
丙三醇---------------------------------10.0mL琼脂------------------------------------15.0g水---------------------------------------1000mL将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH
值:
7.2?
0.2
9、假单胞菌琼脂培养基检测绿脓菌溶素
白明胶胰酶消化物------------------20.0g
无水氯化镁---------------------------1.4g无水硫酸钾---------------------------10.0g琼脂------------------------------------15.0g丙三醇---------------------------------10.0mL水---------------------------------------1000mL将所有固体溶质加入水中，再加入丙三醇，搅拌加热，煮沸1分钟得均匀溶液。
灭菌后pH值:
7.2?
0.2
10、液体乳糖培养基
牛肉膏---------------------------------3.0g白明胶胰酶消化物------------------5.0g
乳糖------------------------------------5.0g水---------------------------------------1000mL灭菌后需尽快冷却。
灭菌后pH值:
6.9?
0.2
11、液体亚硒酸-双硫丙氨酸（胱氨酸）培养基
酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
乳糖------------------------------------4.0g磷酸钠---------------------------------10.0g亚硒酸钠------------------------------4.0gL-胱氨酸------------------------------10.0mg水---------------------------------------1000mL终pH:
7.0?
0.2混匀后加热得均匀溶液。
在流动蒸汽中加热15分钟，不可灭菌。
12、液体连四硫酸盐培养基（四硫磺酸钠亮绿TTB）
酪蛋白胰酶消化物------------------2.5g
动物组织胃蛋白酶消化物---------2.5g
牛胆盐BileSalts---------------------1.0g碳酸钙---------------------------------10.0g硫代硫酸钠---------------------------30.0g
水---------------------------------------1000mL煮沸溶液使固体物质溶解。
使用当天加入5g碘化钾和6g碘到20mL水中配制成的溶液，然后加10mL亮绿（1:
1000），混匀。
加入亮绿后的溶液不可加热。
13、亮绿琼脂培养基
酵母膏---------------------------------3.0g动物组织胃蛋白酶消化物---------5.0g
酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
乳糖------------------------------------10.0g氯化钠---------------------------------5.0g蔗糖------------------------------------10.0g酚红------------------------------------80mg琼脂------------------------------------20.0g亮绿------------------------------------12.5g水---------------------------------------1000Ml煮沸溶液1分钟使固体物质溶解。
使用前灭菌，用融化后的培养基倒平皿，冷却凝固后使用。
灭菌后pH值:
6.9?
0.2。
14、戊醛糖-赖氨酸-脱氧胞啶琼脂培养基
戊醛糖---------------------------------3.5gL-赖氨酸------------------------------5.0g乳糖------------------------------------7.5g蔗糖------------------------------------7.5g氯化纳---------------------------------5.0g酵母膏---------------------------------3.0g酚红------------------------------------80mg琼脂------------------------------------13.5g脱氧胞啶钠---------------------------2.5g（SodiumDesoxycholate）
硫代硫酸钠---------------------------6.8g柠檬酸铁铵---------------------------800mg水---------------------------------------1000mL终pH:
7.4?
0.2。
搅拌加热使固体溶解，加热需恰好到沸点，不可过度加热或灭菌。
溶解后立即转移到50?
水浴，在培养基凝固前倒平皿。
15、亚硫酸铋琼脂培养基
牛肉膏---------------------------------5.0g酪蛋白胰酶消化物------------------5.0g
动物组织胃蛋白酶消化物---------5.0g
葡萄糖---------------------------------5.0g磷酸钠---------------------------------4.0g硫酸亚铁------------------------------300mg亚硫酸铋------------------------------8.0g琼脂------------------------------------20.0g亮绿------------------------------------25mg水---------------------------------------1000mL终pH:
7.6?
0.2。
搅拌加热使固体溶解，加热需恰好到沸点，不可过度加热或灭菌。
溶解后立即转移到50?
水浴，在培养基凝固前倒平皿。
16、三糖-铁-琼脂培养基（TSI）
酪蛋白胰酶消化物------------------10.0g
动物组织胰酶消化物---------------10.0g
乳糖------------------------------------10.0g蔗糖------------------------------------10.0g葡萄糖---------------------------------1.0g硫酸铵亚铁---------------------------200mg（FerrousAmmoniumSulfate）
氯化纳----------------------------------5.0g硫代硫酸钠----------------------------200mg琼脂-------------------------------------13.0g酚红-------------------------------------25mg水----------------------------------------1000mL灭菌后pH:
7.3?
0.2。
17、麦康凯（MacConkey）琼脂培养基
白明胶胰酶消化物------------------17.0g
酪蛋白胰酶消化物------------------1.5g
动物组织胃酶消化物---------------1.5g
乳糖------------------------------------10.0g牛胆盐混合物------------------------1.5g
氯化钠---------------------------------5.0g琼脂------------------------------------13.5g中性红---------------------------------30mg结晶紫---------------------------------1.0mg水---------------------------------------1000mL煮沸溶液1分钟使固体物质溶解。
灭菌后pH:
7.1?
0.2。
18、Levine曙红亚甲基蓝琼脂培养基
白明胶胰酶消化物------------------10.0g
磷酸氢二钾---------------------------2.0g琼脂------------------------------------15.0g乳糖------------------------------------10.0gEosinY---------------------------------400mg亚甲基蓝------------------------------65g水---------------------------------------1000mL加白明胶胰酶消化物、磷酸氢二钾和琼脂于水，加热溶解后冷却。
使用前融化，按如下量比加入其他液态成分，混匀:
每100mL琼脂溶液加入——5mL乳糖溶液（1:
5）、2mLEosinY溶液（1:
50）、2mL亚甲基蓝溶液（1:
300）。
配制后的溶液应澄清。
灭菌后pH:
7.1?
0.2。
19、Sabouraud葡萄糖琼脂培养基
葡萄糖---------------------------------40g同比配制的动物组织胃酶消化物和酪蛋白胰酶消化物---------------10g琼脂------------------------------------15g水---------------------------------------1000mL混合，煮沸得均匀溶液。
灭菌后pH:
5.6?
0.2。
20、马铃薯葡萄糖琼脂培养基
取300g剥皮的马铃薯，放入500mL蒸馏水中煮溶，过滤，加蒸馏水至1000Ml，然后加
入以下物质:
琼脂------------------------------------15g葡萄糖---------------------------------20g加热溶解后灭菌。
灭菌后pH:
5.6?
0.2。
使用前倒平皿。
待培养基冷却到45?
时加入酒石
:
10）调节pH3.5?
0.1，调节pH后不得再加热。
取样（Sampling）每个检测项酸溶液（1
目需要10mL或10g样品。
操作步骤（Procedure）
准备检测样品，用与样品物理性质相适宜的方法进行样品处理，处理程序不得改变样品最初的微生物数量和种类。
以获得可用于检测操作的溶液或悬液。
对于在一定范围内可溶解但溶解不完全的固体样品，可减少样品量，并加以注明。
然后可采用“好氧微生物总数检查法（TotalAerobicMicrobialCount）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（TestforStaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（TestforSalmonellaSpeciesandEscherichiacoli.）”进行检测。
对于液体样品，溶液或者悬液，或者酒精含量少于30%的水醇溶液，以及易溶且完全溶解于90mLpH7.2的磷酸（盐）缓冲液或已指明的其他溶媒的固体样品，可采用“好氧微生物总数检查法（TotalAerobicMicrobialCount）”、“金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查法（TestforStaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosa）”和“沙门氏菌属和大肠埃希氏菌检查法（TestforSalmonellaSpeciesandEscherichiacoli.）”进行检测。
对于不溶于水的流体，药膏，乳酪，以及蜡状物，可用最小量限的、已灭菌的乳化剂（如一种ploysorbates），通过机械搅拌、
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