原位杂交原理及具体操作.docx

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原位杂交原理及具体操作

原位杂交原理及具体操作

原位杂交实验原理与方法

一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。

了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。

二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，insituhybridizationhistochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。

原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。

当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。

探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。

目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I和32P。

同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。

非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。

探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。

cDNA探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。

原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。

菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。

将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。

组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。

菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。

而原位

杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交

一）探针的选择

根据不同的杂交实验要求，应选择不同的核酸探针。

在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。

但是在有些情况下，必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和RNA探针。

例

如，在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针（通过克隆人M13噬菌体DNA获得）或RNA探针，寡核苷酸探针也可。

长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位杂交，因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。

在这种情况下，寡核苷酸探针和短的PCR标记探针

（80～150bp）具有较大的优越性。

在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。

如在建立DNA文库时，手头没有筛选特定基

因的克隆探针，这时就可用寡核苷酸探针来代替。

但必须首先纯化该基因的编码蛋白，并测定

6个以上的末端氨基酸序列，通过反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探针。

如果已有其它动物的同种基因克隆，因为人类和动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性，因此可利用已鉴定的动物基因作探针来筛选人类基因克隆。

对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆探针时，可采用PCR方法扩增某段基因序列，并克隆人合适的质粒载体中，即可得到自己的探针。

这种方法十分简便，无论基因组DNA探针还是cDNA探针都可以容易地获得，而且，可以建立PCR的基因检测方法，与探针杂交方法可作对比，可谓一举两得。

（二）探针的标记方法在选择探针类型的同时，还需要选择标记方法。

探针的标记方法很多，选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。

但在选择标记方法时，还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。

一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。

放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法，如随机引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。

在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。

在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。

（三）探针的浓度总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。

另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。

依我们的经验，要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。

探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。

（四）杂交率在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针长度（复杂度）和探针浓度。

（五）杂交最适温度杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。

若反应温度低于Tm10～15℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配对减少。

若反应温度再低（Tm-30℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢键结合的更弱。

如两个同

源性在50%左右或更低些的DNA，调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。

通常有三种温度可供试验，即最适复性温度、苛刻复性温度及非苛刻复性温度。

温度的选择及温度对杂交的影响见表18-3。

最适复性温度（Optimunmrenaturationtemperature,TOR）：

Tor=Tm–25℃苛刻复性温度：

Ts=Tm–（10或15℃）非苛刻复性温度：

Tns=Tm–（30或35℃）

（六）杂交的严格性影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。

一般认为在低于杂交体?

（七）杂交反应时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。

时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。

一般杂交反应要进行20h左右。

1966年Britten和Kohn

推荐用Cot=值来计算杂交反应时间。

Cot值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时

Cot

应基本完成。

Cot=0，基本上没有杂交。

例如在液相杂交中未标记的DNA400μg/ml（按单股DNA每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot=9.6/21=100.8,杂交完成了。

对标记DNA（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。

Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm值。

由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。

（八）杂交促进剂惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。

对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。

而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。

硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。

这是一种多聚胺，平均分子量为500000。

另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。

在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。

因此，使用促进剂时有必要优化条件。

另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。

与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90000）。

小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。

酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。

而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。

此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。

总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。

（七）杂交反应时间在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。

时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。

一般杂交反应要进行20h左右。

1966年Britten和Kohne推荐用Cot=值来计算杂交反应时间。

Cot值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反应时间（t）的乘积。

实验表明Cot=100时，杂交反应基本完成。

Cot=0，基本上没有杂交。

例如在液相杂交中未标记的DNA400μg/ml（按单股DNA每微克紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot=9.6/21=100.8,杂交完成了。

对标记DNA（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。

Tm值25℃时杂交最佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体

Tm值。

由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。

（八）杂交促进剂惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。

对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。

而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高。

硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。

这是一种多聚胺，平均分子量为500000。

另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。

在某些条件下5%～10%硫酸葡聚糖效果较好，若用5%～10%PEG则可产生很高的本底。

因此，使用促进剂时有必要优化条件。

另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸，用其钠盐，浓度为2%～4%。

与硫酸葡聚糖相比，其优点是价格低廉，粘度低（MW=90000）。

小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交，它们可能是通过增加水的疏水性和降低双链和单链DNA间的能量差异而发挥作用。

酚作为杂交促进剂，只能在低DNA浓度的液相杂交中观察到，该方法曾被称为酚乳化复性技术，该法不能用于固相杂交，因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用，即使在液相杂交中的应用也是有限的。

而硫氰酸胍可通过降低双链DNA的Tm值而起作用。

此外，该分子还可以促进RNA的杂交，有裂解细胞而抑制RNase的作用。

总之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。

三、主要器材医用微波炉，恒温水浴箱、湿盒、PNP笔等。

四、试剂

（2）试剂:

•2.5ml/L的醋酸－－2.5ml/L醋酸酐:

三乙醇胺13.2ml

氯化钠5g浓盐酸4ml醋酸酐（用前加）2.5ml；

•20×SSC（pH7.0）：

氯化钠175.3g枸橼酸钠88.2g双蒸水定容至1L；

•100×Denhardt‘s:

Ficoll1g

PVP1g

BSA1g

ddH2O定容至50ml；

•杂交液：

（50ml）用量终浓度100%去离子甲酰胺25ml50%100%葡聚糖硫酸脂5mg10%100×Denhard‘s0.5ml11Mtris-HCL（PH8.0）0.5ml10Mm5MNaCl3ml0.3M

0.5MEDTA（PH8.0）0.1ml1mM10mg/ml变性鱼精DNA0.5ml100ug/ml

ddH2O定容至25ml

•0.1M甘氨酸/PBS:

甘氨酸7.5gNa2HPO430.8g

NaH2PO42.8g

NaCl8.5g

溶于800mlddH2O，定容至1000ml，高压，室温储存；

•TSM1（1000ml）：

1MTris-HCL（PH8.0）100ml

5MNaCl20ml

1MMgCl210mlddH2O定容至1000ml；•TSM2（1000ml）：

1MTris-HCL（PH8.0）100ml5MNaCl20ml1MMgCl250mlddH2O定容至1000ml；

•抗体稀释液：

100mlBSA1.0g

TrisX-1000.4ml叠氮钠0.4g

0.05MPBS（PH7.2）调至100ml；•0.05MPBS（PH7.2）：

1000mlNa2HPO415.4g

NaH2PO41.4gNaCl4.25g•去内源性酶液（40ml）：

储存液用量终浓度10%甲醛4.0ml0.3—0.5%冰醋酸10.0ml25.0%加0.05MPBS至40ml

•0.4%Triton-X100

五、操作

（一）脱蜡，水化：

1、二甲苯10min两次2、无水乙醇3min两次３、95%乙醇3min一次４、75%乙醇3min一次５、50%乙醇2min一次６、重蒸水2min一次７、PBS洗涤5min

（二）将组织芯片放入去内源性酶液中浸泡30min；PBS洗涤5min

（三）0.1M甘氨酸去游离醛基15min；0.4%tritonX-100洗10min；

（四）用蛋白酶K与37℃孵育30min，PBS振洗5min

（五）在0.1mol/L三乙醇胺——0.25%乙酸酐中孵育10min;在2×SSC中洗5min；

（六）滴加预杂交液42℃,30min；将RNA探针用预杂交液稀释（1ng/ｕL~2ng/ｕL）

（七）杂交

１、在载玻片表面覆盖上杂交小室，加20~50ｕL的杂交液到组织芯片TMA上，42℃~44℃湿盒中过夜。

２、在4×SSC中37℃洗涤15min

３、2×SSC，加入RNA酶（大致为10ｕg/ml）

37℃中洗涤30min，

４、0.5×SSC,37℃洗涤15min

（八）封闭

１、1%正常山羊血清孵育30min２、用抗体稀释液稀释碱磷酶标记的抗地高辛抗体（1：

500）37℃中孵育3h，PBS洗三次，每次5min

３、TSM1洗；

４、TSM2洗；

（九）显色：

用TSM2将NBT/BCIP按2：

1稀释进行显色；显微镜下掌握染色程度（十）终止显色：

用水终止（十一）脱水，透明，封固

１、85%乙醇脱水，2min

２、95%乙醇脱水5min

３、无水乙醇脱水15min

４、二甲苯20min

５、封片，镜检

原位杂交组织化学技术的基本方法

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2010-2-18:

13:

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一、核酸分子杂交技术

1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。

自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。

按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：

液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。

固相杂交有菌落原位杂交（colonyinsituhybridization）、斑点杂交法（Dotblot）、Southern印迹杂交（Southernblot）、Northern印迹杂交（Northernblot）和组织原位杂交（Tissueinsituhybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。

液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。

二、原位杂交组织化学技术的由来及发展原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（Insituhybridization），如上所述，属于

固相核酸分子杂交的范畴。

但它区别于固相核酸

分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。

菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。

Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。

它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。

1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。

与此同时，Buongiorno–Nardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。

Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。

由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。

Bauma（n1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。

Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。

这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。

Pezzella（1987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。

本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。

但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。

生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。

生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。

这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。

另一种叫

光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。

目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：

光敏基团、连结臂和生物素（图20-1）。

在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。

光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forsteretal1985）。

近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起－chemisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。

和其它非放射性标记物一样，

地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。

同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。

地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。

根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。

DNA探针还有单链DNA（Singlestranded,ssDNA）和双链DNA（Doublestranded,dsDNA）之分（详见十九章）。

早期应用的主要是DNA探针，继之Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了cDNA探针（complementaryDNA），其基本原理是以RNA为模板，经逆转录酶（reversetranscriptase）又称为RNA指导的DNA聚合酶催化产生的。

该酶以RNA为模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称逆转录。

CDNA是指互补于mRNA的DNA分子。

RNA探针是将特异性的cDNA片段插入含有相当的RNA聚合酶启动子的转录性载体。

这类载体包括pSP64和pSP65，它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。

Psp64和pSP65在sP6启动子的多克隆位点的方向是不同的。

通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制

RNA的转录方向，即以哪条DNA链为模反转录

RNA。

从而可以得到与mRNA同序列的同义RNA探针（Senseprobe）和与mRNA互补的反义RNA探针（antisenseprobe），又称互补RNA探针（complementaryRNAprobe,cRNA）。

通常用同义RNA探针做为反义RNA探针的阴性对照。

由于RNA探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。

有报告认为其杂交率高于DNA探针的8倍。

DNA合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成为可能，与上述探针不同的是寡核苷酸探针不是克隆性DNA探针，它是由DNA合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的。

具有制造方便，价格低廉的优点，也可进行放射性与非放射性标记，但其特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高。

原位杂交组织化学技术在近20年的发展可以说是飞跃的，其突出的特点是由分子遗传学研究提供的探针大量增加，探针生产的可靠性和速率大大发展了，更重要的是非放射性标记物的发展使原位杂交组织化学技术在不久的将来将和现今的免疫细胞化学技术一样成为实验室的常规技