蛋白质及酶工程试验.docx
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蛋白质及酶工程试验
蛋白质及酶工程试验
实验目录实验一尼龙固定化木瓜蛋白酶
实验二β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定实验四酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究实验五植物体内可溶性蛋白质含量的测定实验六酵母蔗糖酶的结晶实验七酵母蔗糖酶的化学修饰实验八酶法澄清苹果汁加工工艺优化实验九原果胶酶的提取与活性测定实验十层析柱装填及柱效测定
实验十一温度对酶活力的影响－－最适温度的测定
实验一尼龙固定化木瓜蛋白酶
一、原理
通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。
酶的固定化方法有：
吸附法、包埋法、共价键结合法、交联法等。
固定化酶的特性主要表现在：
①稳定，不易破损，可以反复使用多次；②酶不与产品混合，制品较易纯化；③有了固定化酶，工业生产便可实现大批量、连续化、自动化。
本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。
尼龙长链中的酰胺键经HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙（载体）-戊二醛（交联剂）-酶，即尼龙固定化酶。
（化学式见课件）
二、实验材料、仪器和试剂
CHO—（CH2）3—CHO
1、材料
尼龙布（86或66），140目，剪成3cm某3cm
2、仪器
（1）恒温水浴锅
（2）紫外分光光度计（3）冰箱3、试剂
（1）18.6êCl2溶液
（2）甲醇溶液（3）3.65mol/LHCl溶液（4）0.2mol/L硼酸缓冲液（pH值8.5）
（5）5%戊二醛溶液：
用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5
（6）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.8）（7）1mg/mL木瓜蛋白酶溶液
（8）0.5mol/LNaCl溶液（9）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）（10）激活剂：
用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。
（11）0.5%酪蛋白溶液：
用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制。
（12）10%三氯乙酸（TCA）溶液。
三、操作步骤
1、固定化酶的制备
（1）每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6êCl2溶液和18.6%水的甲醇溶液中，在室温下保温10左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘。
取出后用水冲去污物，用吸水纸吸干。
（2）将尼龙布用3.65mol/LHCI溶液在室温下水解45min，用水洗至PH值中性。
（3）将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。
（4）取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.8）反复洗涤，洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液（0.5～1mg/mL）在4℃下固定3.5h（酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL）。
（5）从酶液中取出尼龙布（保留残余酶液作测定用），用0.5mol/LNaCl溶液（用0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.2）配制），洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
2、酶活力测定
（1）溶液酶活力测定：
取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，于37℃下预热
10min，加入37℃预热的0.5%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液2.0mL终止酶反应。
对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其他与测定管相同，以4000r/min的转速离心5min或过滤，取其上清液于波长280nm处测定消光值。
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为1个酶单位（U）（以下同）。
（2）残留酶活力测定：
方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：
取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
四、结果计算
固定化酶总活力
活力回收=---------------某100%
溶液酶总活力固定化酶总活力数
相对活力=-----------------------某100%溶液酶总活力数-残留酶活力数五、注意事项
（1）尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。
（2）固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。
（3）酶活性测定的反应时间一定要准确。
实验二β一半乳糖苷酶菌体细胞的固定化
采用物理或化学的方法固定化微生物细胞，是利用酶或酶系的一条捷径。
对于固定化细胞，以微生物细胞在固定化后的生长状态可分为：
固定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞三类。
固定化死细胞是在固定化前或固定化后对微生物细胞进行加热、冷冻、干燥、表面活性剂、化学试剂等处理，使细胞处于死亡状态；固定化活细胞是在固定化后细胞仍存活但并不增殖；固定化增殖细胞是固定化后细胞不仅存活，而且在使用过程中还能增殖。
这三类固定化细胞中最令人感兴趣的是固定化增殖细胞。
因为多数微生物代谢的产物与其生长相关。
完整细胞的固定化对于细胞内酶的利用有明显的优点，它保持了酶在细胞内环境中的稳定性，成本低，可以利用细胞内的复合酶系进行反应。
当反应需要辅助因子时，固定化细胞的优点更加突出，因为活细胞能再生辅助因子。
微生物细胞的固定化方法与固定化酶的方法类似，有吸附法、包埋法和不用载体法。
固定化细胞的活力及其它性质与游离细胞有所不同。
细胞经固定化后，一般细胞的稳定性增加。
固定化细胞的最适反应温度、最适pH值、最大反应速度大多与游离细胞相同；饱和常数与游离细胞相比有的不变，有的变化很大，这可能是由于载体与底物间静电相互作用以及存在扩散效应的缘故。
一、实验目的
学习细胞固定化的原理，通过用海藻酸钠包埋法固定含β一半乳糖苷酶的芽孢杆菌，掌握菌体细胞包埋固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中的应用。
二、实验原理
固定化的方法是把细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，滴进氯化钙溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球。
细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
三、实验步骤及方法
1、试剂
（1）芽孢杆菌细胞：
将对数生长期的芽孢杆菌离心（3200r/min，20min），收集
细胞。
（2）海藻酸钠溶液：
用蒸馏水配制2％的海藻酸钠溶液，灭菌后备用。
（3）2％氯化钙溶液。
（4）2mmol／LONPG溶液。
（5）0.1mol／LpH7.O磷酸缓冲液。
（6）lmol／LNa2C03。
2、细胞悬浮液的制备
称取产β一半乳糖苷酶的芽孢杆菌湿菌体3g，加无菌水6mL，搅拌均匀制成悬浮液。
3、细胞的固定化
（1）取芽孢杆菌菌体悬浮液3mL，悬浮在10mL海藻酸钠溶液中混合均匀。
（2）用灭过菌的注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴人到50mL氯化钙溶液中，浸泡30~120min。
（3）滤出凝胶珠用无菌水洗涤，得到固定化细胞，称重。
4、酶活力测定
（1）细胞悬浮液酶活力测定：
将菌体悬浮液3mL稀释10－20倍，取试管2支，每管加入2mmol／L底物邻硝基苯β一半乳糖苷（ONPG）溶液1mL，在65℃恒温水浴中预热5min后，每管分别加入上述菌体悬浮稀释液1.0mL，65℃精确反应15min后。
每管加入2mLlmol／LNa2CO3溶液终止反应，3200r/min离心5min，取上清液在分光光度计上比色，读取420nm处的吸光度值。
取2支测定管的平均
值。
空白管以1.0mL0.1mol／LpH7磷酸缓冲液代替菌体悬浮稀释液，其余操作同上。
（2）固定化菌体细胞的酶活力测定：
精确称取固定化菌体细胞60mg于一试管内，加入1mL0.1mol／LpH7磷酸缓冲液，加入预热的2mmol／L底物ONPG溶液1.0mL，以下操作同菌体悬浮液酶活力的测定。
空白管内不加固定化菌体，也不需离心。
所测数据填入下表：
总量测定平均值（A420）稀释倍数总酶活力菌体悬浮液
3mLa固定化菌体细胞mgb5、计算
（1）菌体悬浮液总酶活力a（相对值）
测定平均值（A420）某3（总量）某稀释倍数
a＝-----------------------------------------1.0某15
（2）固定化菌体细胞总酶活力b（相对值）
测定平均值（A420）某固定化菌体总量（mg）b＝------------------------------------------60（mg）某15
（3）酶活力回收＝（b／a）某100％四、结果与讨论
（1）固定化细胞内酶活力回收值的高低与哪些因素有关
（2）固定化细胞的活力、底物专一性、反应温度、动力学常数与游离细胞相比有否不同
（3）比较各种细胞固定化方法的优缺点。
实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与纯度测定
酶的纯化
一、原理
酵母中含有丰富的蔗糖酶（EC.3.2.1.26），本实验以酵母为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤，提取蔗糖酶，并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行测定。
离子交换层析法（ion-e某changechromatogramphy,简称IEC）中常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。
蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH值有关，因为pH值决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。
盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷之间的静电引力，因此被的蛋白质的洗脱可通过改变pH值或离子强度（或两者同时改变）来实现。
与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。
梯度洗脱是在洗脱过程中，使洗脱液的pH值（或两者同时）发生连续的变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下被洗脱下来。
二、实验材料、仪器和试剂1、实验材料干酵母2、仪器
（1）高速离心机
（2）恒温水浴锅（3）层析柱（1.0cm某16cm）（4）梯度混合器（5）部分收集器3、试剂
（1）95%乙醇溶液
（2）DEAE-SepharoeFatFlow（3）1mol/L醋酸溶液（5）0.05mol/LTri-HCl缓冲液（pH值7.3）
（6）0.05mol/LTri-HCl缓冲液（内含1mol/LNaCl溶液）pH值7.3三、操作步骤1、破碎细胞
取15g干酵母，加5~10g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30ml去离子水，研磨30min，在冰箱中冰冻约20~30min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次，加5ml去离子水，置离心管中，12000r/min离心15min，留0.5ml上清液为第一组分。
2、加热除杂蛋白
将上清液倒入三角瓶，将1mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入到50℃的水浴中，保温30min。
在温育过程中，注意经常缓慢摇动试管或搅拌抽提液。
之后在冰浴中迅速冷却之，以12000r/min的转速离心20min，取0.5ml上清液为第二组分。
弃去沉淀。
3、乙醇沉淀
量出上清液的体积，并加入等体积的95%冷乙醇溶液（预先放在-20℃低温下的时间不少于30min），于冰浴中温和搅拌20min。
然后以12000r/min的转速离心25min，小心弃去上清液，沉淀沥干。
将沉淀溶解在6ml0.05mol/LTri-HCl缓冲液（pH值7.3）中，搅拌（5min以上）使其完全溶解，以12000r/min的转速离心25min，取出0.5ml上清液作为第三组分，剩余部分（乙醇抽提液）进行第4步骤操作。
4、上柱
装DEAE-SepharoeFatFlow离子交换柱层析，用0.05mol/LTri-HCl缓冲液（pH值7.3）平衡。
将乙醇抽提液上柱，上样后用0.05mol/LTri-HCl缓冲液（pH值7.3）平衡，然后用0.05mol/LTri-HCl缓冲液（内含1mol/LNaCl溶液）pH值7.3进行NaCl梯度（NaCl溶液浓度为0~1mol/L）洗脱，层析柱连上线性梯度混合器，混合器分别装30ml0.05mol/LTri-HCl缓冲液（pH值7.3）和30ml含有100mmol/LNaCl的0.08mol/LTri-HCl缓冲液（pH值7.3），每1min收集1管。
洗脱至混合器中液体流完为止，测定各接收管在280nm下的光吸收值，并用尿糖试纸进行半定量测定各管的酶活力，将最高酶活力的1管酶液作为第四组分用于纯度测定。
用尿糖试纸进行半定量测定：
在点滴板中滴3滴待测酶液，再加3滴含5％蔗糖的pH4.6的醋酸缓冲液，搅匀，37℃放置20min，浸入尿糖试纸，1后取出，60钟比较颜色的深浅，与比色卡对照。
尿糖试纸的原理：
尿糖试纸使将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶和无色的化合物固定在纸条上，制成的测试尿糖含量的酶试纸。
溶液（或尿液）中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，形成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧。
原子氧可将某种无色的化合物氧化成有色的化合物。
当这种酶试纸与溶液（或尿液）相遇时，很快就会因溶液（或尿液）中葡萄糖含量的少到多而依次呈现出浅蓝、浅绿、棕或深棕色。
尿糖试纸是固定化酶实际应用的范例之一。
四、结果分析
以梯度洗脱出的管数为横坐标，以吸光度A280、酶活为纵坐标，绘出层析曲线和酶活曲线图。
五、注意事项
梯度洗脱装置中的贮液瓶和混合瓶两者容量应相等，且置于同一水平位置。
混合瓶装起始洗脱液，贮液瓶装高浓度洗脱液。
洗脱前先开动搅拌器，后开启连接两瓶的活塞，这样使混合瓶中的洗脱液呈直线式递增。
圆盘电泳测定纯度
一、原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamidegelelectrophorei，简称）根据其有无浓缩效应分为连续的和不连续的两种。
前者电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下主要有电荷及分子筛效应；后者电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH值、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中的泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。
下面就这3种物理效应分别加以说明。
（1）电荷效应：
各种样品分子按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极、以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：
相对分子质量或分子大小和形状不同的样品分子，通过一定孔径分离胶时，受阻碍程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。
相对分子质量小、形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力较小，移动较快；反之，相对分子质量大、形状不规则的分子在电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：
待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：
①由于两层凝胶孔径不同，样品向下移动到两层凝胶接口时，阻力突然加大，速度变慢，这样就在两层凝胶交界处使待分离的样品区变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tri-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH值为6.7，下层分离胶的pH值为8.9。
HCI是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都发生电解，Cl-布满整个胶体。
待分离的样品加在顶部，浸在PH值8.3的Tri-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH值6.7的条件下，解离度仅有0.1%～1%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后面，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的接口。
在pH值6.7的条件下，带有负电荷的样品其有效泳动率介于快、慢离子之间，被夹持分布于接口附近，逐渐形成一个区带。
由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区及低电导区。
因为电位梯度U、电流I和电导率k之间有如下关系：
U=I/k
所以，在电流恒定条件下，低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。
这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于样品和甘氨酸慢离子，使其加速前进，追赶快离子。
本来夹在快、慢离子之间的样品区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。
这就是所谓的浓缩效应。
在此区带中，各种样品分子又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条分离得很近但又不同的“起跑线”。
后来，当样品分子和慢离子都进入分离胶后，pH值从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，其有效迁移率迅速加大到超过所有样品分子，此时，快、慢离子的接口跑到被分离的样品分子之前，不连续的高电位梯度不再存在。
于是，在此后的电泳过程中，样品在一个均一的电位梯度和pH值条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。
与连续系统相比，不连续系统的分离条带清晰度及分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。
二、仪器和试剂1、仪器
（1）稳流稳压电泳仪
（2）垂直式圆盘电泳槽（3）微量加样器（4）长针头注射器2、试剂
（1）凝胶贮存液（A液）：
聚丙烯酰胺32g、甲叉双丙烯酰胺1.0g，加水使其溶解后定容至100mL，过滤除去不溶物，置棕色瓶中，于4℃下贮存。
（2）凝胶缓冲液（pH值8.9）（B液）：
取24mL1mol/LHCl溶液、18.15gTri、0.25mlTEMED，加水定容至100mL。
（3）0.2%过硫酸铵溶液（C液）：
取0.2g过硫酸铵加水溶解，定容至100mL。
现配现用。
（4）上极电极缓冲液：
取6.32gTri、3.94gGly，加水溶解，定容至100mL，使用时稀释10倍。
（5）下极电极缓冲液：
取12.1gTri、50mL1mol/LHCl溶液，加水溶解，定容至100mL，使用时稀释10倍。
（6）溴酚蓝-甘油溶液：
取5mL50%甘油溶液、5mL上极电极缓冲液、5mL1%溴酚蓝溶液混匀。
（7）12.5%三氯乙酸溶液。
（8）染色液：
取0.25g考马斯亮蓝R250、90.8mL50%甲醇溶液、9.2mL冰乙酸混匀。
（9）脱色液：
取7.5mL乙酸溶液、5mL甲醇溶液。
加水87.5mL混匀。
三、操作步骤1、凝胶柱的制备
将A液、B液按1:
1的比例混合于烧杯中，另取2倍体积C液于另一烧杯中，有条件的可将它们一同放在真空干燥器里减压抽气，以排除溶液中的气泡。
每组准备好用封口膜封底的4支玻璃管后，取A液2.5ml，B液2.5ml，C液5ml置烧杯中，轻轻混匀，用移液管沿玻璃管壁小心向每支玻璃管中加2ml混和液，用手指轻弹管壁，以将管中胶液可能含有的气泡赶出，然后用滴管在胶液面上小心注入蒸馏水至管顶，以防胶液凝结时表面形成弯月面并隔绝空气。
当水层与胶液交界处出现一清晰界面时，表明胶已聚合。
2、样品的制备
取第一组分50μL，加10μL样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液）取第二组分50μL，加10μL样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液）取第三组分80μL，加20μL样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液）取第四组分250μL，加50μL样品缓冲液（溴酚蓝-甘油缓冲液）混合后供电泳分析用。
3、加样和电泳
聚合后,从玻璃上小心去掉封口膜，用滤纸吸干凝胶上层的水，把凝胶管插入到圆盘电泳槽的槽洞橡皮塞中，上、下槽分别加入约600mL的上、下极电极缓冲液，使玻璃管上、下端及上、下电极均浸没在缓冲液中，并使两端管口都不存在气泡。
然后用滴管或微量进样器分别往凝胶管表面加入第一、二、三、四组分样品液。
上槽接负极，下槽接正极，以2mA/管的电流强度电泳30min后，电流强度加大到4mA/管，当指示剂溴酚蓝带移至凝胶柱下端约1cm处时，停止电泳。
4、脱胶、染色及脱色
把从电泳槽中取出的凝胶管用带长针头的注射器脱胶。
将吸满水的注射针头沿壁插入到玻璃管壁与凝胶之间，边注水边推进针头，并缓慢放置玻璃管，使凝胶与管壁分离，则胶柱自然滑出，若不能滑出可用洗耳球吹出。
将脱出的
凝胶放在盛有固定液的试管中固定30min，再转入染色液中染色30min，然后用脱色液浸泡至蛋白区带清晰为止。
四、结果分析
观察并记录实验结果，判断酶的纯度，画出圆盘电泳酶纯度的检验结果。
五、注意事项
（1）注胶前应检查准备好的玻璃管是否有漏。
（2）加满胶液的玻璃管应尽量放直静置，以使凝结后的胶面平整并与管壁垂直。
（3）脱胶时注意勿使针头损伤凝胶柱而妨碍观察谱带。
实验四酵母蔗糖酶活力测定及酶促动力学研究一、原理
酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数Km值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。
不同酶的Km值不同，同一种酶与不同的底物反应时，其Km值也不同，Km值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，Km值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；Km值越小，表明酶与底物的亲和力越强。
酶的活力就是酶所催活的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。
酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。
从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。
所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。
同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。
酶活力可以被某些物质改变，凡能降低酶的活力甚至使酶失活的物质，均称为抑制剂，其中又有可逆抑制和不可逆抑制两种类型。
而可逆抑制又包括竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。
在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如Km,Vma某等，可通过作图法求得，作图法很多，最常用的就是Lineweaver-Burk作图法（即双倒数作图法）。
二、仪器和试剂1、仪器
（1）恒温水浴锅
（2）电炉（3）722分光光度计2、试剂
（1）0.2mol/L乙酸缓冲液
（2）0.5mol/lL蔗糖溶液（3）8mol/L脲三、操作步骤1、时间作用曲线
试管加入试剂顺序12345678910110.2mol/L乙酸缓冲液（mL）0.5mol/L蔗糖溶液（mL）水（mL）Nelon试剂（mL）酶液（mL）0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2—0.020.040.060.080.100.20.40.20.4—0.60.580.560.540.520.500.40.20.40.2—————————1.01.0—0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2—Nelon试剂（mL）室温下放置10min1.01.01.01.01.01.01.01.0——1.0置沸水浴20min后冷却砷酸钾试剂（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0保温5min后加入7mL水比色A510nm计算个试管中的蔗糖浓度和反应速率V（单位：
），用反应速率对底物浓度作图，再用1/V对1/S作图，计算Km和Vma某。
3.脲对蔗糖酶的抑制
Nelon试剂（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.0——1.0置沸水浴20min后冷却
砷酸钾试剂（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0A510nm以反应速率对底物浓度作图，再用1/V对1/S作图，计算出表观Km、Vma某、Ki，说明其抑制类型。
四、注意事项
1．研究酶的活力应以酶促反应的初速度为准。
2．本实验采用的是一种定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作带来的误差。
因此，在配置各种底物浓度时，应用同一母液进行稀释，以保证底物浓度的准确性。
各种试剂的加样量也应准确，并严格控制酶促反应时间。
实验五植物体内可溶性蛋白质含量的测定
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。
在研究每一种酶的作用时，常以比活（酶活力单位／mg蛋白）表示酶活力大小及酶制剂纯度。
因此，测定植物体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项目。
常用测定方法有Lowry法和考马斯亮蓝G-250染料结合法。
本实验将分别介绍这两种方法。
一、考马斯亮蓝法
【原理】
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白
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