种子检验实验指导.docx

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种子检验实验指导

种子检验实验指导

（种科、农学专业适用）

种子科学与工程教研室

2015.4

实验一种子净度分析

一、实验目的与要求

学习净种子、其他植物种子和杂质的划分标准，掌握种子净度检验程序与方法。

二、实验材料与用品

1．实验材料水稻、玉米、小麦、蔬菜、牧草或其他当地常见作物种子。

2．实验用品净度分析台、风选净度仪、分样器、不同孔径的套筛、电动筛选器、吹风机、双目显微镜、手持（台式）放大镜、瓷盘、感量为1.0，0.1，0.01，0.001g和0.0001g的不同天平、直尺、镊子、标签、称量纸、记载本、铅笔等。

三、实验的方法步骤

1．送验样品的称重和重型混杂物的检查

⑴将送验样品倒在天平上称重，得出送验样品重量M。

⑵重型混杂物是指在大小或重量方面明显大于被检作物种子的混杂物。

如果送验样品中有重型混杂物，应先挑出来并称重，再分为其他植物种子和杂质。

做法是将送验样品倒在光滑的瓷盘中，挑出重型混杂物，在天平上称重，得到重型混杂物的重量m，再将重型混杂物分成其他植物种子和杂质分别称重，得到m1和m2。

2．试验样品的分取

（l）将除去重型混杂物的送验样品混匀，从中分取试验样品l份，或半试样2份，试样或半试样的重量参见表3-1。

如水稻种子1份全试样是40g，两份半试样分别为20g。

分样可使用分样器或采用四分法。

⑵用天平称出试样或半试样的重量，按规定留取小数位数[参见表3-1]。

3．试样的分析与分离将（半）试样倒在净度分析台或平整光滑的实验台桌面上，根据标准将（半）试样分离成净种子、其他植物种子和杂质三部分。

试样的分离也可借助放大镜、不同孔径的套筛、吹风机等器具，在不损伤发芽率的基础上进行。

借助不同孔径的套筛的分离方法为：

选用筛孔适当的两层套筛，要求小孔筛的孔径小于所分析的种子，而大孔筛的孔径大于所分析的种子。

使用时将小孔筛套在大孔筛的下面，再把筛底盒套在小孔筛的下面，倒入（半）试样，加盖，置于电动筛选机上或手工筛动2min。

筛理后将各层筛及底盒中的分离物分别倒在净度分析台上进行分析鉴定，区分出净种子、其他植物种子、杂质，并分别放入小碟内。

4．各分拣成分的称重将每份（半）试样的净种子、其他植物种子、杂质分别称重，称量的精确度与试样称重要求相同。

其中，其他植物种子还应分种类计数。

5．结果计算

（l）检查分析过程中重量增失不管是1份试样还是2份半试样，应将分析后的各种成分重量之和与（半）试样原始重量比较，核对分析期间物质的增失是否符合要求。

若增失量超过原始重量的5%，则必须重新进行分析，填报重做的结果。

⑵以三种成分的重量之和为基数计算试样（半试样）中净种子、其他植物种子及杂质的百分率。

若为全试样，各种组分的百分率应计算到1位小数，若为半试样，则各种组分的百分率计算到2位小数。

⑶求出2份（半）试样间三种成分的各平均百分率及重复间相应百分率差值，并核对容许差距（表3-2），若样间三种成分的重量百分率都在容许范围之内，则它们的平均数分别为P1、OS1和I1。

⑷含重型混杂物的结果计算

净种子：

其它植物种子：

杂质：

上式中：

M—送验样品的重量，g；

m—重型混杂物的重量，g；

m1—重型混杂物中的其它植物种子重量，g；

m2—重型混杂物中杂质的重量，g；

P1—除去重型混杂物后的净种子重量百分率，%；

OS1—除去重型混杂物后的其它植物种子重量百分率，%；

I1—除去重型混杂物后的杂质重量百分率，%。

⑸百分率的修约若得到的百分率取两位小数，则应按“四舍六入五留双”的规则保留1位。

各成分的百分率相加应为100.0%，如为99.9%或100.1%，则在最大的百分率上加上或减去不足或超过之数。

如果此修约值大于0.1%，则应该检查计算上有无差错。

6．其他植物种子数目的测定

（l）将取出（半）试样后剩余的送验样品按要求取出相应的数量或全部倒在净度分析台或平整光滑的实验台桌上或样品盘内，逐粒进行观察，找出所有的其他植物种子或指定种的种子并计数出每个种的种子数，再加上（半）试样中相应的种子数。

⑵结果计算。

可直接用检出的种子粒数来表示，也可折算为每单位试样重量（通常用每千克）内所含种子数来表示。

7．填写净度分析的结果报告单

净度分析的最后结果精确到1位小数，如果某种成分的百分率低于0.05%，则填为微量，如果某种成分结果为零，则须填报“—0.0—”。

最后应注意完成种子净度分析后，应将净种子留下供其他项目检验利用。

四、作业

1．每2人1组，按种子净度分析程序与方法进行一份供验种子样品的净度分析，并将本组净度分析结果与邻组同学进行容许差距分析，如果容许误差大于国家标准，则应分析其原因，重新核算或重新进行分析。

2．将供验样品净度的检验结果，填入种子净度分析记载表（表附-1）。

表附-1种子净度分析记载表

样品编号

作物名称

品种（组合）名称

送验

样品重

（g）

重型混杂物重

（g）

重型混杂物中

其他植物种子重（g）

重型混杂物中杂质重（g）

类别

重复

试样重（g）

净种子

其他植物种子

杂质

各成分

重量之和

重量

（g）

百分数

（%）

重量

（g）

百分数

（%）

重量

（g）

百分数

（%）

全试样

半试样

1

2

平均

实际差

（%）

容许误差

（%）

其他植物种子名称及个数

杂质种类

净度分析结果

净种子

（%）

其他植物种子

（%）

杂质

（%）

检测依据

说明：

全试样或半试样只需选择其中一种方法进行检测。

实验二种子发芽试验

一、实验目的与要求

通过本实验掌握水稻、小麦、玉米、油菜、大豆等种子的发芽条件，学习标准发芽试验和快速发芽试验的方法。

二、实验材料与用具

1．材料水稻、小麦、大麦、玉米、油菜、大豆等作物种子。

2．用具发芽箱、出糙机、透明塑料发芽盒、玻璃培养皿、发芽纸或滤纸、砂、镊子、标签、数种仪（板）等。

三、实验的方法步骤

（一）标准发芽试验

1．发芽床的选用一般大粒种子（玉米、大豆等）用砂床（0.05～0.8mm的细砂），中粒种子（水稻、小麦、大麦等）用砂床或纸床，小粒种子（油菜、芝麻等）用纸床。

2．发芽床的准备取塑料发芽盒或发芽皿4套。

将砂（石英砂或河砂）用0.8mm筛孔的钢丝网筛进行筛理，经洗涤后与玻璃培养皿等一起进行高温消毒（160℃，2h或120℃，4h）。

然后在发芽皿中放入4层发芽纸（或滤纸）并加水湿透，或放入消毒砂（每100g加水约20ml）。

3．试样的数取取经净度检验的净种子400粒（水稻种子需要预先在30℃温水中浸种24h），每重复100粒，播于纸床或砂床中。

播种时种子分布要均匀，彼此之间保留一定距离，用砂床时应将种子轻轻压入砂中，种子与砂相平，然后加盖。

4．贴标签将发芽盒或发芽皿贴上标签，注明品种名称、重复号、处理温度、置床日期、测定人姓名等，并登记在发芽试验记载表上。

5．培养将发芽盒或发芽皿放入规定温度和光照条件的发芽箱内发芽。

可根据农作物种子的发芽技术规定选择恒温或变温处理，以后每日检查温度和水分。

水分不足时要及时补充，并保持发芽箱内温度和水分与要求一致。

6．管理发芽床上如有种子表面生霉，可取出用清水洗涤后再放回发芽床上；如已经霉烂，则应从发芽床上取出并登记。

如霉烂种子达5%以上，应更换发芽床或进行种子消毒后重新试验。

7．幼苗鉴定每株幼苗都必须按标准进行鉴定，鉴定要在幼苗主要构造发育到一定时期进行。

每个种的试验持续时间详见表4-1。

到达初次计数天数时，计数正常幼苗，并将发育良好的正常幼苗从发芽床中拣出；对可疑的或损伤、畸形或不均衡的幼苗，通常到末次计数。

严重腐烂的幼苗应从发芽床中除去，并随时增加计数。

末次计数时，按正常幼苗、不正常幼苗、新鲜不发芽种子或硬实和死种子分别计数和记载。

如果样品在规定时间内只有几粒种子开始发芽，则试验时间可延长7d，或延长规定时间的一半。

根据试验情况，可增加计数的次数。

反之，如果在规定时间结束前，样品已达最高发芽率，则该试验可提前结束。

8．结果计算根据试验记录分别计算正常幼苗、不正常幼苗、新鲜不发芽种子或硬实、死种子百分率。

如果一个试验的四次重复正常幼苗百分率在最大容许差距范围内，则其平均值表示试验样品的发芽率。

其余成分的百分率按四次重复平均数计算。

种子发芽试验记载表见表附-2.

表附-2种子发芽试验记载表

样品登记号

作物名称

品种（组合）名称

检测依据

重复

日期

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

Ⅳ

结果

％

发芽床

温度℃

置床日期

实验持续时间天

发芽前处理方法

容许误差

实际误差

不正常幼苗种类

正

不

死

正

不

死

正

不

死

正

不

死

正常幼苗（正）

新鲜不发芽种子

硬实

不正常幼苗（不）

死种子（死）

检验员：

日期：

校核人：

日期：

审核人：

日期：

四、作业

四人一组，选择一种作物种子进行标准发芽试验和快速发芽试验，并比较两种方法测定的结果。

实验六种子生活力的四唑染色测定

一、实验目的与要求

1．了解四唑染色快速测定种子生活力的原理。

2．掌握四唑染色快速测定主要作物种子生活力的方法和种子生活力有无的鉴定标准。

二、实验材料与用具

1．材料　小麦、玉米、水稻、大豆、棉花、蔬菜等作物种子。

2．器材　培养箱、镊子、解剖针、刀片、吸水纸等。

3．试剂　红四氮唑、磷酸缓冲液、乳酸苯酚透明液、过氧化氢等。

三、实验的方法步骤

1．小麦、玉米种子四唑染色测定随机数取净种子100粒，2次重复，放在30℃水中3～4h或湿润的纸间12h，沿种胚纵切，各取半粒放入小培养皿或小烧杯中，倒入0.1%四唑盐溶液淹没种子，35℃染色0.5～1h，计算生活力。

2．水稻种子四唑染色测定随机数取净种子100粒，2次重复，去壳，放在30℃水中或湿润的纸间12h，沿种胚纵切，各取半粒放入小培养皿或小烧杯中，倒入0.1%四唑溶液淹没种子，35℃染色1～2h，计算生活力。

3．大豆种子四唑染色测定机数取净种子100粒，2次重复，放在湿毛巾间12h，剥去种皮，放入小培养皿或小烧杯中，倒入1%四唑液淹没种子，35℃染色2～3h，计算生活力。

4．棉花种子四唑染色测定随机数取净种子100粒，2次重复，放在湿润的纸间预湿，30℃12h，纵切一半种子，或剥去种皮，放入小培养皿或小烧杯中，倒入0.5%四唑液淹没种子，35℃染色2～3h，计算生活力。

5．高粱种子四唑染色测定随机数取净种子100粒，2次重复，放在30℃水中3～4h或湿润的纸间12h，纵切种胚，放入小培养皿或小烧杯中，倒入0.1%四唑液淹没种子，35℃染色0.5～1h，计算生活力。

6．辣椒、茄子和番茄种子四唑染色测定随机数取净种子100粒，2次重复，放在20℃-30℃水中3～4h或湿润的纸间12h，在种子中心刺破种皮和胚乳或纵切种子使胚露出或撕开胚乳使胚露出，倒入0.2%四唑液淹没种子，35℃染色0.5～1.5h，计算生活力。

7．黄瓜、西瓜和南瓜种子四唑染色测定随机数取净种子100粒，2次重复，放在20℃-30℃水中6～8h或湿润的纸间24h，纵切种子、剥去种皮和内膜，倒入1%四唑溶液淹没种子，35℃染色1～2h，计算生活力。

四、作业

1．分析无生活力种子种胚不染色的可能原因。

实验四蛋白质电泳鉴定玉米种子纯度

1、实验的目的与要求

学习、掌握蛋白质电泳法鉴定玉米品种纯度的基本原理、操作步骤和电泳谱带鉴定标准。

二、实验的材料与用具

1．材料玉米干种子

2．仪器设备电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、感量0.001g的电子天平或分析天平、样品钳或单粒种子粉碎器、存放试剂的广口瓶、移液管及移液管架瓶、吸耳球、滴瓶、微量进样器、注射器、研钵等。

3．试剂试剂:

丙烯酰胺（Acr），甲叉双丙烯酰胺（Bis）,KOH，过硫酸胺（AP）,冰乙酸，四甲基乙二胺（TEMED）,甘氨酸，三氯乙酸，考马斯亮兰R250,无水乙醇，甲基绿。

所有试剂为分析纯级。

三、溶液的配制

1号：

90g丙烯酰胺（Acr）+3g甲叉双丙烯酰胺（Bis）加水溶解并定容至500ml

2号：

60g脲加水溶解并定容至200ml

3号：

48ml1mol/L的KOH+17.2ml乙酸加水定容至100ml

4号：

48ml1mol/L的KOH+2.9ml乙酸加水定容至100ml

5号：

四甲基乙二胺（TEMED）原液

6号：

10%过硫酸胺

电极液：

甘氨酸0.44g加水溶解+4.5ml乙酸再加水定容至1100ml

指示剂：

0.1%甲基绿水溶液

染色剂：

10%三氯乙酸200ml+1%考马斯亮兰乙醇溶液10ml

提取液：

80g脲+80ml乙酸+加水定容至500ml

四、操作步骤

蛋白质提取:

将每粒种子样品用单粒粉碎器磨碎后倒入1.5ml离心管中，加入适量提取液，静置0.5小时以上或5000rpm离心15分钟，上清液即可点样。

凝胶室的制作:

将预先洗净晾干的玻璃板装入胶条中，配浓缩胶溶液封好底缝，并把胶条固定在电泳槽中，保持水平，拧紧螺栓。

灌分离胶:

依次取1号22.5ml、2号5ml、3号3.75ml、6号1.6ml、5号0.2ml混合后倒入制好的胶室至距顶端2cm左右为止，约20-30分钟胶可聚合，吸去析出水分。

灌浓缩胶:

依次取1号3ml、2号2ml、4号5ml、6号0.3ml、5号0.04ml混合后倒在分离胶上，并插入梳子，约10-20分钟，待浓缩胶聚合后轻轻拔出梳子，准备点样。

点样:

用微量进样器取每粒种子样品的上清液15-20μl注入浓缩胶上的凹穴内，每点完一粒样后要清洗进样器。

电泳:

加样完毕后，小心倒入电极液，并在上槽加入3-4滴甲基绿指示剂，接通电源，稳压180V，约需2-2.5小时。

染色:

将电泳后的凝胶放入染色液中，在30℃恒温条件下染色约需2-3小时。

五、观察鉴定

在白瓷盘上对比鉴定的种子和已知真实种子或父母本的蛋白谱带来鉴定品种，根据杂交种的数量计算出纯度，同时也可将异交种和自交粒数统计出来。

六、结果保存

结果保存的方式有多种，最简便的方式为湿法保存胶板和照相。

1．湿法保存用7％乙酸溶液浸泡胶板，然后将胶板放人塑料袋中，用家用保鲜热合机密封，该保存条件在室温下可保存半年以上，缺点是不小心易碰破胶板。

在保存过程中如出现谱带变浅可将胶板取出重新放人染色液染色。

2．照相凝胶板拍照，难度较大，要想得到较好效果的照片，必须采用大型翻拍机。

实验五玉米品种鉴定SSR标记法

一、实验目的与要求

通过本实验，了解SSR标记法鉴定玉米的基本原理，掌握SSR标记法鉴定玉米品种的操作方法和鉴定标准。

二、实验材料与用具

1.材料玉米种子、幼苗、叶片、苞叶、果穗等组织或器官。

2.仪器设备PCR扩增仪、高压电泳仪（规格为3000V、400mA、400W，具有恒电压、恒电流和恒功率功能）、垂直电泳槽及配套的制胶附件、普通电泳仪、水平电泳槽及配套的制胶附件、高速冷冻离心机（最大离心力不小于15,000rpm）、水平摇床、胶片观察灯、电子天平（感应为0.01g、0.001g）、微量移液器（规格分别为10L、20L、100L、200L、1000L，连续可调）、磁力搅拌器、紫外分光光度计（波长260nm及280nm）、微波炉、高压灭菌锅、酸度计、水浴锅或金属浴（控温精度±1℃）、冰箱（最低温度-20℃）、制冰机、凝胶成像系统或紫外透射仪、DNA分析仪、基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核苷酸大小的差异。

3.试剂十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O）、三羟甲基氨基甲烷（Tris-base）、盐酸（37%）、氢氧化钠（NaOH）、氯化钠、10×Buffer缓冲液（含Mg2+25mmol/L）四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP，每种10mmol/L）、TaqDNA聚合酶、矿物油、琼脂糖、DNA分子量标准、核酸染色剂、去离子甲酰胺（Formamide）、溴酚蓝（BrphBlue）、二甲苯青FF、甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide）、丙烯酰胺（acrylamide）、硼酸（BoricAcid）、尿素、亲和硅烷（BindingSilane）、剥离硅烷（RepelSilane）、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、甲醛、DNA分析仪专用丙烯酰胺胶液、DNA分析仪专用分子量内标Liz标记、DNA分析仪专用电泳缓冲液。

三、溶液配制

（一）DNA提取溶液的配制

1.0.5mol/LEDTA溶液186.1gNa2EDTA.2H2O溶于800mL水中，用固体NaOH调pH值至8.0，定容至1000mL，高压灭菌。

2.1mol/LTris-HCl溶液60.55gTris碱溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，定容至500mL，高压灭菌。

3.0.5mol/LHCl溶液25mL浓盐酸（36-38%），加水定容至500mL。

4.CTAB提取液81.7g氯化钠和20gCTAB溶于适量水中，然后加入1mol/LTris-HCl100mL，0.5mol/LEDTA40mL，定容至1000mL，4℃贮存。

5.SDS提取液1mol/LTris-HCl50mL，0.5mol/LEDTA50mL，5mol/LNaCl50mL，SDS7.5g，定容至500mL。

6.TE缓冲液1mol/LTris-HCl5mL，0.5mol/LEDTA1mL，加HCl调pH至8.0，定容至500mL。

7.5mol/LNaCl溶液146g固体NaCl溶于水中，加水定容至500mL。

（二）PCR扩增溶液的配制

1.dNTP用超纯水分别配制A、G、C、T终浓度100mmol/L的储存液。

各取20μL混合，用超纯水720μL定容至每种终浓度2.5mmol/L的工作液。

2.SSR引物用超纯水分别配制前引物和后引物终浓度均40μmol/L的储存液，等体积混合成20μmol/L的工作液。

注：

干粉配制前应首先快速离心。

3.6×加样缓冲液去离子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，溴酚兰0.125g，二甲苯青0.125g。

（三）变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制

1.40％PAGE胶丙烯酰胺190g和甲叉双丙烯酰胺10g，定容至500mL。

2.4.5%PAGE胶尿素450g，10×TBE缓冲液100mL，40%PAGE胶112.5mL，定容至1000mL。

3.Bind缓冲液49.75mL无水乙醇和250μL冰醋酸，加水定容至50mL。

4.亲和硅烷工作液在1mLBind缓冲液中加入5μLBind原液，混匀。

5.剥离硅烷工作液2％二甲基二氯硅烷。

6.25%过硫酸铵溶液0.25g过硫酸铵溶于1mL超纯水中。

7.10×TBE缓冲液Tris碱108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至1000mL。

8.1×TBE缓冲液10×TBE缓冲液500mL，加水定容至5000mL。

（四）银染溶液的配制

1.固定液100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。

2.染色液2g硝酸银，加水定容至1000mL。

3.显影液1000mL蒸馏水中加入30g氢氧化钠和5mL甲醛。

注：

除银染溶液的配制可使用符合GB/T6682规定的三级水外，试验中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682规定的一级水。

四、操作程序

（一）样品制备

送验样品可为种子、幼苗、叶片、苞叶、果穗等组织或器官。

对玉米自交系和单交种，随机数取至少20个个体组成的混合样品进行分析，或直接对至少5个个体单独进行分析；对于其它杂交种类型，随机数取至少20个个体单独进行分析。

（二）DNA提取

1.CTAB提取法：

幼苗或叶片约200-300mg，置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨，或取种子充分磨碎，移入2.0mL离心管；每管加入700µL65℃预热的CTAB提取液后，充分混合，65℃保温60min，期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇混合液，充分混合后，静置10min；12,000rpm离心15min后，吸取上清液至一新离心管，再加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，在-20℃放置30min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清液；加入70%乙醇，旋转离心管数次，弃去乙醇；将离心管倒立于垫有滤纸的实验台上，室温干燥沉淀6h以上；加入100µL超纯水或TE缓冲液，充分溶解后备用。

2.SDS提取法：

剥取干种子的胚，放入1.5mL离心管中，加入100µl氯仿后研磨，加入300µlSDA提取液，混匀后于10,000rpm离心2min，吸上清液加入预先装有300µl异丙醇和300µlNaCl溶液的1.5mL离心管中，待DNA成团后挑出，经70%乙醇洗涤后加入200µlTE缓冲液，待充分溶解后备用。

试剂盒提取法：

使用经验证适合SSR指纹技术的商业试剂盒，按照试剂盒的使用说明操作。

注：

以上为推荐的DNA提取方法，其它达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用。

（三）PCR扩增

1.引物选择首先选择表附-4中前20对引物进行检测，当样品间检测出的差异位点数小于2时，再选用表附-4中后20对引物进行检测；必要时，进一步选择特定标记进行检测。

2.反应体系各组分的终浓度如下：

每种dNTP0.10mmol/L，正向、反向引物各0.24mol/L，TaqDNA聚合酶0.04U/l，1×PCR缓冲液（含Mg2+2.5mmol/L），DNA溶液2.5ng/l，其余以超纯水补足至所需体积。

如果PCR过程中不采用热盖程序，则反应液上加盖15μL矿物油，以防止反应过程中水分蒸发。

3.反应程序94℃预变性5min，1个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

（四）PCR产物检测

1.普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

（1）清洗玻璃板用清水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。

在长板上涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5mL剥离硅烷工作液。

操作过程中防止两块玻璃板互相污染。

（2）组装电泳版待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。

（3）灌胶在100mL4.5%PAGE胶中加入TE