吴乃虎基因工程原理复习提纲Word文件下载.docx
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b.真核基因的组成：
启动子序列区
终止子序列区
转录序列区
c.真核基因初级转录本的组成：
5，-UTR序列区
表达子（exon）
内含子（intron）
3，-UTR序列区
d.真核基因成熟mRNA的结构组成：
5‘-端帽的结构;
5，-UTR;
编码序列区;
3，-UTR;
3，-端poly（A）尾巴。
四、基因的类型
1.根据拷贝数分类
a.单拷贝基因
b.多拷贝基因
2.根据表达特性分类
a.组成型基因（Constitutivegene）又叫看家基因（Housekeepinggene）
b.诱导型基因（Induciblegene）
3.根据产物类型分类
a.结构基因（Structuralgene）
b.调节基因（Regulatorgene）
4.根据实验用途分类
a.选择基因（Selectablegene）
b.标记基因（Markergene）
c.报告基因（Reportergene）
5.根据排列组合特性分类
a.基因家族（Genefamily）
b.基因簇（Genecluster）
c.弧独基因（Orphons）
6.根据细胞类型分类
a.原核基因（Prokaryoticgene）
b.真核基因（Eukaryoticgene）
7.根据结构特点分类
a.断裂基因（Splitgene）
b.移动基因（Movablegene）
c.假基因（Pseudogene）
8.根据序列重复特性分类
a.重叠基因（Overlappinggene）
b.嵌套基因（Nestedgene）
c.重复基因（Repeatedgene）
9.根据同源性分类
a.同源基因（Honologousegene）
b.共生同源基因（Paralogousgene）
c.直向同源基因（Orthologousgene）
d.孤独基因家族（Orphonfamily）
10.根据碱基突变分类
a.野生型基因（Wildtypegene）
b.突变型基因（Mutanttypegene）
五、基因图与基因作图
1.基因图（genemap）包括：
a.遗传图（geneticmap）
厘摩（centimorgan,cM）
遗传图距或是染色体上基因间的距离以摩尔根单位表示（morganunit）,摩尔根单位等于100%的重组率（交换值）。
1厘摩（cM）则等于1%的重组率。
人类基因组1cM相当于1000Kb
拟南芥基因组1cM相当于290Kb
蕃茄基因组1cM相当于750Kb
小麦基因组1cM相当于3500Kb
b.物理图（physicalmap）
c.限制图（restrictionmap）
2.基因作图（genemaping）
六、DNA非编码序列的功能
1.中心法则质疑
2.RNA的功能
a.假基因的功能
b.反义RNA的功能
c.RNA的干扰作用
d.微RNA（microRNA）的功能
e.核糖开关
3.表观遗传学
a.遗传印记（Geneticimprinting）
b.遗传印记与遗传性疾病
表观遗传信息层（Epigeneticlagerofinformation）生命有机体遗传信息的第三层次，它贮藏在围绕DNA分子周围并与DNA分子结合的蛋白质及化学物质中，表观遗传信息层可能比RNA甚基因更为重要。
c.甲基化作用与遗传印记
d.甲基化药物与癌症治疗
七、基因扩增
1.基因增加与基因减少
2.基因扩增的五种情况：
a.PCR基因扩增
b.克隆基因扩增
c.环境压力基因扩增
d.程序基因扩增（Programmedgeneamplipication）
e.生物进化基因扩增
八、基因表达
1.正义链与反义链
2.基因表达定义：
基因通过DNA的转录和RNA的转译等过程，将其遗传信息转变成蛋白质（RNA转录本）的过程，叫做基因表达。
3.基因表达产物
a.有些基因如tRNA基因和rRNA基因最终表达产物是RNA
b.大部分基因的表达的最终产物是蛋白质
4.基因表达的时空特异性
5.基因表达活性的调控
九、基因克隆与基因工程
1.克隆的词义
2.基因克隆与DNA克隆
3.基因克隆的方法
a.互补作用基因克隆
b.cDNA克隆
c.基因组DNA克隆
d.基因定位克隆
4.基因克隆与基因分离
第二单元DNA分子的体外切割与重组
一、基因克隆涉及的一些重要的酶
1．核酸酶（Nuclease）
a.核酸外切酶
b.核酸内切酶
2．蛋白酶（Proteinase）
3．基因工程中涉及的主要的酶
a.2型核酸内切限制酶
b.DNA连接酶（Ligase）
c.DNA聚合酶
d.反转录酶（Reversetranscriptase）
e.多核苷酸激酶（Polynucteotidekinase）
f.末端转移酶（Terminaltransferase）
g.核酸外切酶（Exonuclease）
h.碱性磷酸酶（Alealinephosphatase）
小牛肠碱性磷酸酶（CIP）
细菌碱性磷酸酶（BAP）
i.TagDNA聚合酶（TagDNApolymerase）
二、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割
1．寄主控制的限制与修饰现象
2．核酸内切限制酶及其类型：
1型核酸内切限制酶
2型核酸内切限制酶
3型核酸内切限制酶
3．2型核酸内切限制酶的特点
a．识别序列
b．粘性末端（Cohesiveends）
c．平末端（Bluntends或flushends）
平末端连接方法：
T4DNA连接酶连接法;
同聚物加尾法;
衔接物（Linker）连接法;
DNA接头（Adapter）连接法。
4．同裂酶与同尾酶
a．同裂酶（Isoschizomers）
具有同样的识别位点，产生同样的粘性末端，但是从不同的细菌中分离出来的类核酸内切限制酶。
b．同尾酶（Isocaudamers）
一组来源不同、识别序列各异，但能够切割形成相同的粘性末端的核酸内切限制酶。
5．异裂酶（Neoschizomer）
这是一组来源不同，但具有相同的识别序列和不同的切点（cleavepoint）的核酸内切限制酶。
6．影响核酸内切限制酶活性的因素
三、DNA连接酶与DNA分子的体外连接
1．DNA连接酶（DNAligase）
简称连接酶，是指利用ATP分子中的r-磷酸基团为能量，催化在两条并排DNA链的5，-磷酸基团和3，-羟基之间或是双链DNA单链断裂位置形成一个磷酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来的一种酶。
2．DNA分子连接的条件：
a．3’-端具有一个游离的羟基（-OH）;
b．另一条DNA链的5，-末端具有一个磷酸基团（-P）;
c．连接反应需ATP的参加。
3．影响DNA分子体外连接反应的因素：
ATP浓度;
连接酶浓度;
反应时间;
反应温度;
插入片段与载体分子间的摩尔比值。
第三单元：
基因克隆的载体
一、质粒载体
1．质粒载体定义
2．质粒DNA分子的构型及其在凝胶电泳申泳中的位置
a．SC构型（双链、共价、闭合的超盘旋DNA）-走在凝胶最前面;
b．OC构型（单链断裂的开环DNA）-走在凝胶最后面;
c．L构型（双链断裂呈线型DNA）-走在凝胶的中间位置。
3．质粒载体的组成：
a．具有复制区或复制因子（replicator）
b．具有1-2个抗菌素抗性基因;
c．具有若干种限制酶的单一识别位点;
d．具有较小的分子量和较高的拷贝数。
4．质粒DNA的自我转移
5．质粒DNA的迁移作用（mobilization）
迁移作用的分子机理
6．质粒的拷贝数
7．质粒的不亲和性
8．质粒DNA的复制与拷贝数的控制
质粒复制控制的分子模型：
抑制蛋白稀释模型;
自体阻遏蛋白质模型
9．严紧型质粒与松驰型质粒
10．质粒载体的类型：
a.插入失活型载体
b.表达型质粒载体;
c.正选择质粒载体
11．重要的质粒载体：
pBR322质粒载体:
pUC质粒载体。
二、噬菌体载体
1．噬菌体的一般生物学问题;
a.烈性噬菌体与温和噬菌体;
b.混浊型噬菌斑和清亮型噬菌班;
c.噬菌体的溶源化与溶源性细菌;
d.噬菌体的整合作用与原噬菌体;
e.超感染免疫
2．l噬菌体载体
a．cos位点（粘性末端位点）
b．l噬菌体载体构建原理;
c．插入型l噬菌体载体与替换型l噬菌体载体;
d．具有内删除作用的l噬菌体载体;
lZAP载体的结构：
含有一个发生内删除作用的pBluescript噬菌粒的DNA区段;
在pBluescript的两侧含有f1的起始子（I）和终止子（T）;
在pBluescript的内部具有LacZ基因;
在LacZ基因内部具有两端分别为T3和T7噬菌体启动子和多克隆位点区（MCS）;
e．内删除作用的原理
3．l重组体DNA分子的体外包装
a．体外包装原理
b．包装限制
c．l噬菌体载体的克隆能力（23Kb理论值）
三、柯斯质粒载体
1．柯斯质粒载体的定义
2．柯斯质粒载体的组成部分：
a．质粒的复制起点;
b．带有1-2个抗菌素抗性基因;
c．来自l噬菌体DNA的cos位点;
d．来自质粒的相当数量的核酸内切限制酶单一识别位点
3．柯斯质粒载体的特点：
a．来自l噬菌体的特点，体外包装后可高效转导感受态细胞，导入细胞后可重新环化，无法进入溶菌周期，因此无法形成子代噬菌体。
b．具有质粒载体的特点，带有质粒复制子，可像质粒一样复制，在有氯霉素下扩增;
具有抗生素抗性基因，因此可像质粒载体一样筛选重组体。
c．具有高容量的克隆能力（31-45Kb）
四、单链噬菌体载体
1．M13单链噬菌体的一般生物学特性
2．M13克隆体系列组成：
a.M13克隆载体;
b.M13的寄主菌株
3．X-gal显色反应原理
4．顺反子内互补作用（a-互补作用）
5．M13载体系列的优点：
a．制备单链DNA序列
b．重组子可用组织化学检测
c．LacZ基因上有一段多克隆位点序列区（MCS）
d．可定向克隆
五、噬菌体展示载体
1．构建噬菌体展示载体的原理
2．丝状噬菌体展示载体
3．噬菌体表面展示文库
六、噬菌粒载体
1．噬菌粒载体的定义
2．噬菌粒载体的组成：
来自质粒部分：
a.来自ColE1的复制起点（ori）;
b.抗菌素抗性标记;
来自噬菌体部分：
a.f!
单链噬菌体的复制起点（ori）;
b.与形态发生有关的DNA序列。
3．噬菌粒载体的优点：
a.可像质粒一样复制，产生双链DNA;
b.复制方向可改变，形成单链DNA，
c.不必亚克隆，可直接用于测序;
d.可产生大片段的外源单链DNA。
4．pBluescript噬菌粒
a．体外转录载体定义;
b．pBluescript结构特点
c．pBluescript噬菌粒载体的组成：
*a.具ColE1质粒的复制起点（ori），可产生双链DNA;
*b.具Ampr抗性基因，提供转化子筛选;
*c.具pUC19的多克隆位点（MCS），克隆外源基因;
*d.在MCS两端具有T3和T7启动子，指导外源基因录
*e.具LacZ基因，可组织化学选择重组子;
*f.具M13单链噬菌体的复制起点，可产生单链DNA亚克隆可进行测序
第四单元基因克隆与基因分离
一、基因克隆
1.基因克隆的概念
a．基因克隆与DNA克隆
b．基因克隆的基本过程
c．基因文库的类型（基因组文库与cDNA文库）
2.基因克隆与分离的实验策略
a．物理策略
b．生物学策略
c．克隆样品的选择：
从蛋白质出发;
从mRNA出发;
从DNA大分子出发。
3.基因文库库容测算
4.cDNA基因克隆
d．概述
e．cDNA文库的构建：
第一步：
分离细胞总RNA，根据poly（A）尾巴用oliga（dT）柱分离纯化出mRNA;
第二步：
用适当的引物，通常用oliga（dT）和反转录酶合成第一链cDNA;
第三步：
双链cDNA的获得:
用RNaseH酶降解mRNA-cDNA分子中的mRNA链,再用第一链为模板合成第二链cDNA。
第四步：
与适当载体重组，将重组体分子导入大肠杆菌寄主细胞增殖，即构成cDNA文库。
f．cDNA克隆的优越性：
*a.以mRNA出发，对一些在增殖过程中不经过DNA中间过程的RNA病毒，特别适用;
*b.从mRNA出发，其复杂度要比蛋白质低10-100倍;
*c.假阳性比例低。
每一个克隆都含有一个mRNA;
*d.具有特殊用途：
克隆的真核基因在原核细胞中表达;
*e.测定基因核苷酸序列;
发育调节基因表达特性分析，即时空特异性。
d.全长cDNA的合成
5.基因组DNA克隆
a.cDNA克隆的局限性
b.基因组DNA克隆的过程：
*a.分离基因组DNA;
*b.体外切割片段化（超声波处理;
机械切割;
限制酶局部消化）与适当载体重组;
*c.转化大肠杆菌细胞增殖即构成基因组文库。
c.基因组文库的优越性：
*a.基因类型的全面性，一个完整的基因组文库中，该生物有机体的基因都有一个克隆;
*b.基因结构的完整性，包括启动子、表达子、间隔子、终止子等所有结构;
*c.基因的恒定性，即不受材料组织部位和发育阶的影响;
*d.基因的功能性，适于研究基因的表达与调控。
6.基因的定位克隆（用于分离编码产物未知基因的方法之一）
a.定位克隆的程序和条件
b.分子标记RFLP在定位克隆中的应用
c.RFLP作图过程
d.染色体步移
e.大尺度物理图谱的构建
二、目的基因的分离
1.分离克隆基因的若干方法：
a.应用核酸探针分离克隆的目的基因
b.应用差别杂交法和扣除杂交法分离克隆的基因
c.PCR技术.
d.mRNA差别显示技术（产物未知基因分离方法）
e.表达文库技术
f.酵母双杂交体系（Y2H,产物末未知基因分离方法）
g.定位克隆分离产物未知基因
h.DNA标签法分离产物末未知基因
i.应用DNA芯片技术
2.应用mRNA差别显示技术分离产物末未知基因
a.mRNA差别显示的原理：
基本原理是，以多细胞（或但组织）的总RNA反转录成的cDNA群体为模板，通过合理设计的5，端与3，端引物的配对组合，将细胞（或组织）中表达的约15%的基因片段扩增，直接显示在DNA测序胶上，从而找出一对细胞或组织中表达有差异的cDNA片段。
*a.高等真核生物的mRNA3，端大多具有poly（A）尾巴,故可用oligo（dT）作引物，反转录成cDNA;
*b.根据mRNApoly（A）前2个碱基可把所有的mRNA分成12类群，如按一个碱基可归为3大类群,3，端作锚定引物也就为3大类群;
*c.根据数理统计，5，端的随机引物需80种，因此80x3=240组合对;
就有可能分离到目的基因。
基因差异表达（differentialexpression）：
在生物个体发育的不同阶段，或在不同组织或细胞中发生的，不同基因按时间、空间进行有序表达的方式，叫做基因差异表达。
b.mRNA差别显示技术的优点和缺点
3.应用DNA标签法分离产物未知的基因
原理：
DNA标签法（DNAtagging），是根据DNA的插入作用发展出来的。
其原理：
a.当一段己知的特定DNA序列插入到基因组中目的基因的内部、或附近，便会诱发该基因发生突变，并最终导致表型变化，形成突变体（突变株）
b.以特定的己知序列为DNA杂交的分子探针，从突变株的基因组DNA文库中筛选到突变的基因。
c.利用标签序列以外的突变基因序列为探针，再从野生型基因组DNA文库中克隆出野生型的目的基因。
类型：
d.转位子标签法：
可分为一元转位子标签法（One-elementtaggingsystebm）二元转位子标签法（Two-elementtaggingsystem）
e.T-DNA标签法
4.酵母双杂交体系（Y2H）分离产物未知的基因
a.转录因子定义
b.转录因子的结构：
（a）DNA结构域（DNA-BD）
（b）转录调节域：
（转录激活域（AD）;
转录抑制域）
（c）核定位信号区
（d）寡聚化位点
c.酵母半乳糖苷酶基因的转录因子-GAL4
d.E.coli-Yeast穿梭质粒（定义）
穿梭质粒（Shuttlevetor）：
是一类人工构建的具有两种不同的复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中进行复制和存留的质粒载体。
这种质粒载体可以携带外源DNA在原核细胞和真核细胞往返穿梭。
e.酵母双杂交体系
（a）构建两种穿梭质粒载体
DNA-BD质粒载体（具有色氨酸编码基因Trp）——产生第一种杂种蛋白
AD质粒载体（具有亮氨酸编码基因Leu）——产生第二种杂种蛋白
（b）酵母双杂交体系的寄主菌株
特点：
*a.丧失了表达内源GAL4转录因子的能力;
*b.具有LacZ报告基因;
*c.trp1和ler2转化标记，在缺少色氨酸和亮氨酸的培养基中无法生长。
5.酵母单杂交体系（Y1H）
酵母单杂交体系是一种体内分析系统，用于分离与顺式作用调控元件结合的特定蛋白质之编码基因。
许多真核转录因子都是结构上可以分开、功能上相互独立的两个结构域组成。
用一种未知蛋白质代替BD和AD形成融合蛋白质，如果此未知蛋白质能够与调控序列结合，它就可以携带AD靠近起始复合物，从而起动基因转录。
通过筛选cDNA-AD表达文库，可以分离与鉴定新的DNA结合蛋白质。
6.酵母三杂交体系（Y3H）
第五单元新基因的功能鉴定
一、新基因功能鉴定的技术
1．转基因技术与基因过表达技术：
a.转正义基因（目的基因）
b.转基因（目的基因）的过表达。
2．基因剔除技术（基因打靶）
3．RNA干扰技术与新基因功能鉴定
4．基因序列同源比对技术，验证新基因的功能
5．蛋白质产物的结构与功能的检测
6．基因定点突变途径探索新基因的功能
7．报告基因技术
8．反义RNA技
9．化学遗传学方法;
10．遗传互补法
11．基因表达系列分析法
12．噬菌体表面展示技术与酵母双杂交技术
二、同源性分析与基因功能鉴定
1．序列同源性与相似性、一致性及保守性概念
2．基因序列同源性比对技术原理
a.DNA分子的核苷酸序列或是蛋白质多肽链的氨基酸序列，具有高度相似性或显著相似性的基因或蛋白质，往往是同源的。
b.亲缘关系密切的或相关的基因，具有相似的（或相近的）核苷酸序列结构，可以通过机算机的检索已经测序并己知其生物学功能的其它物种的相关基因（同源基因）并根据核苷酸序列比对分析所得出的相似性程度，推断待鉴定的新基因之可能的生物学功能。
c.同源基因的类型：
直向同源因（Orthologousgene）
共生同源基因（Paralogousgene）
三、基因失活与新基因功能鉴定
1．同源重组与基因失活
a.同源重组（Homologousrecombination）：
是指两条同源DNA序列之间发生的遗传信息的重组或交换的过程。
.
b.主要技术：
*a.醇酵母缺失盒技术;
*b.基因剔除技术
c.酵母缺失盒技术与新基因功能鉴定,其核心是使用一种特殊的分子结构即酵母缺失盒，通过同源重组途径，使待鉴定中的目的基因失活。
d.酵母缺失盒的分子结构：
*a.中央部分是一种抗菌素抗性基因的编码序列;
*b.在此基因的两侧各有一个核酸内切限酶的识别位点（R1和R2）;
*c.在缺失盒的5，端，位于限制位点R1和抭菌素抗性基因之间，还有一个酵母启动子。
2．基因剔除（基因打靶）与新基因功能鉴定
a.基因剔除技术主要应用于哺乳动物，其原理也是利用同源重组使基因失活。
b.基因打靶（Genetargeting）定义：
使外源基因定点地整合到核基因组上的一种特殊的基因工程技术。
也叫做基因定点重组或基因剔除
c.基因打靶的分子基础：
通过转染的细胞中发生的外源打靶基因与核基因组上的目标基因之间的DNA同源重组事件，使外源打靶基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。
d.基因打靶的类型：
（a）插入型基因打靶;
（b）取代型基因打靶
e.基因打靶载体（Genetargetionvector）
f.基因打靶的过程
g.基因打靶的应用：
（a）新基因功能鉴定;
（b）提高基因表达效率;
（c）遣遗传疾病的基因治疗
四、转译抑制与新基因功能鉴定
1．RNA干扰（RNAinterference,RNAi）概念：
a.近年来研究表明，一些小分子量的外源双链RNA（dsRNA）当其导入寄主细胞之后，便可促进与其同源的
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