细胞培养无菌操作和培养技术.ppt
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第二部分细胞培养技术,林红9-25-2010,一细胞培养无菌操作,常用仪器设备培养器皿培养基血清其他细胞培养试剂,常用仪器设备,超净台或生物安全柜：
细胞操作CO2培养箱：
细胞培养液氮罐：
细胞长期冻存37水浴：
培养溶液预热，细胞复苏倒置显微镜：
观察细胞离心机：
收集细胞，细胞常用300g转速5min冰箱：
细胞培养溶液分装储存负压吸引器：
细胞培养废液吸取,超净工作台,超净台或生物安全柜,垂直风超净台,水平风超净台,生物安全柜（Biologicalsafetycabinets，BSCs）是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护工作人员、实验室环境以及实验品，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。
超净工作台（超净台，cleanbench）是为了保护试验品或产品而设计的，通过吹过工作区域的垂直或水平层流空气防止试验品或产品受到工作区域外粉尘或细菌的污染。
实验前准备,预热实验用相关试剂（培养基、PBS、D-Hanks液、实验用水）预融实验用液体（血清、胰酶、双抗、实验添加剂）检查离心机、水浴箱、显微镜、超净台、培养箱是否处在正常状态用75%酒精涂手，清洁操作台检查超净台内各种实验器材（离心管、滴管、移液器、酒精灯、镊子、记号笔、培养瓶等）,使用前需打开无菌工作台及净化室的紫外灯，消毒半小时以上。
进入净化室前先关闭紫外灯，打开超净台风机，等待30min以上，以排尽臭氧。
穿好隔离衣，戴好口罩，帽子，换鞋。
风淋1-2min。
75%酒精擦手。
点燃酒精灯，注意酒精液面；超净台内应避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。
打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。
水平式风机的超净台，应使瓶口斜置，应尽量避免瓶口敞开直立。
每次从试管或者培养瓶中倾倒培养液的时候，都要使用火焰灼烧瓶或者管的盖子。
当转移培养物时，也应该常规性的灼烧。
灼烧的目的不是消毒，是为了加热试管以产生自瓶口处上升的热对流空气。
这种热的空气“保护伞”能够防止携带有污染性质细菌的尘埃落入试管。
Cultureflask,CulturePlate,培养器皿,移液管和移液器,同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。
漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。
细胞培养箱,工作原理通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境如恒定的酸碱度（pH值：
7.2-7.4）、稳定的温度（37C）、较高的相对湿度（95%）、稳定的CO2水平（5%），来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。
细胞培养基,干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。
缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F12等,培养基的选择,没有一定的标准，有几点建议可供参考：
建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。
可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。
其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。
用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。
血清,血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质主要为白蛋白和球蛋白。
氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物细胞本身不能合成（称为必需氨基酸），必须由培养液提供。
血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、类胰岛素生长因子等）；血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。
动物血清还可起到酸碱度缓冲液的作用。
因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加10%20%的血清，,血清的种类,何谓FBS,FCS,CS,HS?
FBS（fetalbovineserum）和FCS（fetalcalfserum）是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。
CS（calfserum）则是指小牛血清。
HS（horseserum）则是指马血清。
血清使用注意事项,血清必须贮存于20-70，若存放于4，请勿超过一个月。
如果一次无法用完一瓶，可将4045ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。
血清解冻步骤（逐步解冻法）:
-20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。
在溶解过程中须规则摇晃均匀（小心勿造成气泡），使温度与成分均一，减少沉淀的发生。
勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
热灭活（heat-inactivation）是指56,30分钟加热已完全解冻之血清。
此热处理之目的是使血清中之补体成份（complement）去活化。
除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。
勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质,凝絮物：
发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白（fibrin）造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。
若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。
不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。
显微镜下观察之“小黑点”：
通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。
有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此“微生物“，但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。
一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。
血清沉淀物,谷氨酰胺,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加配制好的培养液（含谷氨酰胺）在4放置2周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内使用终浓度为1-4mM一般配制为100倍浓缩液，即浓度为200mM（29.22g/L）配制方法为：
谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM,酚红,大多数培养液中使用酚红作为pH指示红色表示中性pH黄色代表酸性pH紫色表示碱性pH培养基保存于4C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。
而培养基中之酸碱指示剂（通常为phenolred）的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。
培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。
若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。
在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：
酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用,细胞消化液,分离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）两种溶液，单独或混合使用胰蛋白酶溶液主要作用：
使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用EDTA4Na溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。
注意：
使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长,trypsin,细胞冻存液,保护剂：
甘油或二甲基亚砜（DMSO）能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
配制：
20%血清培养基+10%DMSO（或甘油）,细胞污染,主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。
一旦发现细胞污染，应直接灭菌后丢弃之。
严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
细胞污染的种类,细菌污染真菌污染细菌和真菌的清除支原体污染支原体的清除,细菌污染,细胞培养常见的污染最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
球菌污染,真菌污染,真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
细菌和真菌的清除,使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。
联合用药比单独用药效果好。
预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素（青霉素和链霉素，简称P/S）。
污染后清除用药需采用大于常用量510倍药物冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。
此法在污染早期有效。
支原体污染,支原体（mycoplasma）污染的细胞，不能以肉眼观察出异状。
除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。
危害：
世界性问题，平均发生率达到11%能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。
但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
来源：
操作环境不良操作人员的疏失实验器具不洁等已受污染的细胞已受污染的培养基、血清,支原体污染,阳性阴性,、用MRA处理用MRA（MycoplasmaRemovalAgent）处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康效果好2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法细胞营养驯化优质细胞群的筛选细胞清洗反复离心洗涤其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。
由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限.如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。
3、药物辅助加温处理先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。
支原体的清除,预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。
只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。
一般预防可从以下几方面着手：
1、添加抗生素2、从物品、用品消毒灭菌着手细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。
操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
污染的预防,3、从操作者做起
（1）进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。
工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。
（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。
操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
（3）操作时要常更换吸管，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。
实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。
4、防止细胞交叉污染在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。
在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养。
、无菌室的彻底消毒1）0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室；2）甲醛熏蒸法：
甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。
二细胞培养基本技术,细胞原代培养细胞换液、消化和传代细胞冻存与复苏细胞携带和运输细胞计数与活力细胞污染与控制,鼠胎组织细胞原代培养,取材：
用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
把整个孕鼠浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。
用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污切割：
用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。
静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清消化、接种培养：
加入0.25胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。
置37水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入510ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
常规观察包括：
（1）培养液的肉眼观察是常规检查的重要内容，重点观察培养液的颜色和透明度的变化。
（2）常规检查应特别注意细胞的生长增殖变化。
（3）细胞形态变化的常规观察。
（4）微生物污染的常规检查。
活细胞观察包括：
培养细胞的相差显微镜观察和培养细胞的动态观察（即培养细胞的附着、贴壁、伸展、移动、有丝分裂等活动是连续动态的，是培养细胞观察中最为生动的部分）。
细胞观察,换液或传代前准备,1、预热培养用液：
把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅内预热。
2、用75%酒精擦拭经过紫外线照射超净工作台和双手。
3、正确摆放使用的器械：
保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4、点燃酒精灯：
注意火焰不能太小。
5、准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
6、取出预热好的培养用液：
用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7、从培养箱内取出细胞：
注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8、打开瓶口：
将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
换液：
全量换液和半量换液换液时机的选择：
培养液pH值：
细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多，pH值下降，营养液酸化变黄。
细胞状态,细胞换液,复苏24h48h,细胞生长形态变化,贴壁细胞换液：
贴壁细胞换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
若希望细胞能在较长时间内能维持存活，并控制细胞增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。
若镜下观察杂质较多，可考虑用PBS或D-HANKS液冲洗。
悬浮细胞的换液：
将原培养瓶竖起，在30min内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸弃一半原上清，再加入等量的新鲜完全培养基。
若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000rpm10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。
细胞消化,对于贴壁不太紧的细胞如293或其他半贴壁细胞，可以直接吹散后分瓶。
而对于贴壁较紧的细胞如肿瘤细胞，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为（以下操作均按无菌操作的要求进行）：
将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去；加入0.25胰酶溶液，视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多，以使充分浸润；一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化，离心。
视实验要求分入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例。
经48小时培养后，细胞已长成致密单层。
致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈半透明，弃去培养液，在此可先摇动细胞瓶，使老化死亡贴壁情况不好的细胞随培养液弃去。
消化后的细胞,轻轻摇动培养瓶，细胞层呈片状从瓶壁上脱落下来，镜下观察，细胞回缩变圆，细胞间隙增大。
加入完全培养基25ml终止消化，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械力损伤。
离心1500rpm5min。
弃上清，用适量培养基稀释，调整细胞至适当浓度后再分瓶培养。
分装细胞1、分装：
将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2、显微镜下观察细胞：
倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。
注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5105/ml。
最后要做好标记（细胞名称和传代次数，培养基名称和传代时间）。
继续培养用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。
传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+，占50%为+占75%时为+。
细胞的传代,悬浮细胞的传代,悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。
细胞的换液、消化和传代注意事项：
严格的无菌操作适度消化,细胞的复苏和冻存,细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻速融,原理：
细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
试剂：
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
细胞冻存Cryopreservation,冷冻保存要点冷冻过程要缓慢：
保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。
细胞浓度控制在：
5x1062x107/ml。
常用细胞冷冻保存液5%或10DMSO完全培养液10甘油完全培养液,冻存方法,1.配制含10%DMSO或甘油、1020%小牛血清的冻存培养液；2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3.离心1000rpm，5min；4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5106/ml1107/ml；5.将细胞分装入冻存管中，每管11.5ml；6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7.冻存：
标准的冻存程序为降温速率-1-2/min；当温度达-25以下时，可增至-5-10/min；到-100时，则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞的冻存管放入-20冰箱2h，然后放入-70冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
注意事项:
1）液氮罐一般2周需充液氮一次，至少1个月充液氮一次，切勿忘记！
否则将造成所有细胞株断种。
2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。
3）液氮附属装置为挂架或吊桶时，提取要缓慢，避免液氮倾泻。
4）需要冻存的对数生长期细胞，在冻存前几天，培养液不要加双抗，以免造成种子假阴性污染。
5）为妥善起见，细胞冻存半年后，最好取出一支冻存细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
6）使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。
高压灭菌反而会破坏它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。
在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。
7）不宜将冻存细胞放置在0-60这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。
细胞复苏（thawing）,快速解冻保证细胞外结晶快速融化避免慢速融化水分渗入细胞内再次形成胞内结晶损伤细胞,细胞复苏（thawing）,基本原则快融保证细胞外结晶快速融化避免慢速融化水分渗入细胞内再次形成胞内结晶损伤细胞,细胞复苏,操作步骤1）实验前准备2）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出冻存管。
3）迅速放入37水浴中，并不时摇动，在1min内使其完全融化（不要超过3分钟）在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。
如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。
4）将细胞悬液移入15ml离心管中，加适量培养基稀释。
5）1000rpm，离心10min。
6）弃上层清液，加入适量完全培养液后接种于培养瓶并置37温箱静置培养。
细胞复苏,注意事项：
应注意融化冻存细胞速度要快，使之尽快通过最易受损的温度段（-50）。
解冻时避免水浴箱支原体污染液氮温度达-196，复苏时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起不必要的冻伤注意细胞接种浓度，要高些。
一般1支1.5ml冻存管离心获得的细胞悬浮于5mL新鲜培养液并全部接种于小细胞培养瓶（25mL容积）中进行培养。
细胞复苏,初学者易犯错误：
水浴锅未预热或者未预热到37。
水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
细胞携带和运输（transport）,由于培养细胞株（系）的商品化，细胞培养室之间的交流、交换和购买已成为生命科学研究中的一个重要组成部分，培养细胞的运输成为研究工作的一个重要环节。
如果不了解所要细胞的性状、培养液特点及培养注意事项，运输时不注意使用特殊容器或温度等，就可能影响细胞的生长，或出现差错，或导致培养失败等。
一、冷冻储存运输这是一种利用特殊容器内盛液氮或干冰的运输方法。
保存效果较好，但缺点是比较麻烦，不宜长时间运输，多需空运，代价较大。
二、充液法此种方法较为简单。
一般选择生长良好的细胞，以生长1/31/2瓶底壁为宜，去掉旧培养液，补充新的培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖，并用胶带密封，放在一运送盒内，用棉花等做防震防压处理。
运输时间需45天，一般放在贴身口袋即可，到达目的地后倒出多余的培养液，只需保留维持生长所需的培养液置37培养，次日传代。
如果在市内运输或仅需数小时运输路程，也可将细胞附着面朝上，或把培养液全部倒掉放在胸部口袋运送。
靠附着于细胞表面的培养液，可使细胞短时间不受损。
细胞运输方式,细胞计数（CellCounting）,细胞计数法是细胞学实验的一项基本技术，是用于了解培养细胞生长状态，测定培养基、血清、药物等物质对细胞发挥作用的重要手段。
血球计数板计数法电子细胞计数仪计数法,血球计数板计数法基本原理是利用血球计数板的特殊标准容量，将显微镜下肉眼观察的细胞数换算成每毫升的细胞数，即细胞浓度。
染料排除法是细胞计数法基础上建立的活细胞计数法，其基本原理是细胞损伤或死亡时，某些染料可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色；而活细胞能阻止这类染料进入细胞内，借此可以鉴别死细胞与活细胞。
常用的染料有台盼蓝、伊红和苯胺黑等。
电子细胞计数仪计数法其基本原理是用电解液（磷酸盐缓冲液）适当稀释细胞悬液，移入样品杯中，将样品杯放置在计数仪微孔管下，计数仪吸取0.5ml样品进行计数。
被吸取的细胞穿过微孔时改变了流经微孔的电流，产生一系列脉冲信号，计数仪借此进行分类、记数。
方法和步骤1）取酒精棉球清洁计数板和专用盖玻片，并用丝绸布或擦镜纸轻轻拭干。
2）用胰酶消化分散贴壁细胞或直接收集悬浮细胞制成均匀分散的单细胞悬液，必要时应进行适当的稀释或浓缩。
3）混匀后直接取少许细胞悬液，沿计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。
加样量以充满不外溢为宜，也不要过少或出现气泡。
4）或者可取9滴细胞悬液和1滴0.4%台盼蓝移入1.5ml离心管中进行活细胞计数。
5）在显微镜下用10物镜观察计数四角大方格中的细胞数。
代入下式得出细胞浓度。
细胞数=（4大格细胞数之和/4）104稀释倍数细胞存活百分率=（4大格活细胞数/4大格活细胞+死细胞数）100%,细胞计数及活力,注意事项：
1）
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