道地中药材中多种有机氯.docx

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道地中药材中多种有机氯

杀虫剂残留量检测方法的研究

工程完成人贾益群牟峻＊谢文兵汪冬梅王畅郭鹏然

工程完成单位国家电化学和光谱研究分析中心

中华人民共和国吉林出入境检验检疫局＊

摘要本方法对人参、淫羊藿、刺五加中15种有机氯农药的毛细管气相色谱测定和GC/MS确认方法的研究。

样品经有机溶剂均质提取，Florisil柱净化后，采用不分流进样方式，用PAS-1701弹性石英管柱经柱程序升温技术别离，并用电子捕获检测器检测，外标法定量。

气相色谱-质谱〔GC/MSD〕选择离子检测进行确证。

结果三水平的平均回收率为80.6～108.1%，相对标准偏差为2.86～7.73%。

并进行了国外与国内产的Florisil净化效果的比较，本法简便，重复性及净化效果好，可用于人参、淫羊藿、刺五加中15种有机氯农药〔六氯苯、α-BHC、五氯硝基苯、γ-BHC、七氯、艾氏剂、β-BHC、δ-BHC、环氧七氯、p,p'-DDE、狄氏剂、异狄氏剂、o,p'-DDT、p,p'-DDD、p,p'-DDT〕残留量检测。

关键词人参淫羊藿刺五加有机氯农药毛细管气相色谱GC/MS

一、前言

关于多种有机氯农药残留量的分析方法，文献报道较较多，目前普遍采用气相色谱电子俘获检测器法〔GC-ECD〕测定，而采用气相色谱-质谱法〔GC-MSD〕进行阳性确证方面的研究报道极少。

GC-ECD方法灵敏度高，别离效果好，定量准确。

经过多年实践运用，已经证明是一种经典适用的分析方法，具有其他方法无可比较的优点。

但在气相色谱分析中，干扰物与待测物在同一根色谱柱具有相同保存时间的现象经常发生，特别是对污染物的不明样品更容易造成假阳性。

因此，气相色谱/质谱选择离子法来进行确证是解决这一问题的有效手段。

本研究在采用气相色谱电子俘获检测器法〔GC-ECD〕测定的同时，重点对气相色谱/质谱选择离子〔GC-MSD/SIM〕确证条件进行研究试验。

经样品前处理条件试验，气相色谱条件选择试验，气相色谱/质谱阳性确证条件试验，回收率试验，精密度试验，方法验证试验。

结果说明，各项技术指标均完全满足残留检测和目前国外检测限量〔MRL〕的需要。

二实验局部

1试剂材料

除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.1无水乙醚：

重蒸馏。

1.2石油醚：

沸程60～90℃，重蒸馏。

1.3无水硫酸钠：

650℃灼烧4h，贮于密封容器中备用。

1.4硫酸钠水溶液：

20g/L。

1.5弗罗里硅土：

（国产为中国医药〔集团〕上海化学试剂公司；进口为BDHChemicalsLTD）层析用，100～200目，650℃灼烧5h，用前于130℃活化4h，冷却后参加2%〔m/m〕水脱活，贮于密封容器中备用。

1.615种有机氯杀虫剂标准品：

α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、p,p'-DDE、o,p'-DDT、p,p'-DDD、p,p'-DDT、六氯苯、五氯硝基苯、七氯、环氧七氯、艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂，纯度均≥99％。

1.7混合标准溶液：

分别准确称取适量的每种有机氯杀虫剂标准品，用石油醚分别配制成浓度为100μg/mL的标准储藏液。

根据需要再用石油醚逐级稀释成不同浓度的系列混合标准工作溶液。

2仪器和设备

2.1日本岛津公司GCMS－QP5000气相色谱-质谱仪。

2.2美国惠普公司HP5890Ⅱ气相色谱仪，配有电子俘获检测器〔ECD）。

2.3德国HeidolphDIAX900高速均质器。

85A旋转蒸发器。

〔id〕。

2.7微量注射器：

10µL。

3测定步骤

3.1提取

取100g代表性的中药试样，磨碎混均，从混合样中称取试样约5g〔〕于250-mL具塞锥形瓶中，参加100mL石油醚，用高速均质器振荡提取3min。

将提取液过滤于250-mL分液漏斗中，残渣再用50mL石油醚重复提取一次，合并滤液于上述分液漏斗中。

然后参加200mL硫酸钠水溶液，振摇3min，静置分层，收集上层有机相。

水相再用2×50mL石油醚重复提取两次，合并有机相。

经无水硫酸钠柱脱水，收集于250-mL梨形瓶中，于40℃水浴中旋转浓缩至近干，参加10mL乙醚-石油醚〔5+95〕以溶解残渣。

3.2净化

在弗罗里硅土层析中柱自下而上依次填装2cm高无水硫酸钠、10g弗罗里硅土、2cm高无水硫酸钠，并用50mL石油醚淋洗。

然后将溶解液倾入弗罗里硅土柱中，用50mL石油醚进行淋洗，弃去流出液，再用50mL乙醚-石油醚〔5+95〕进行洗脱。

收集全部洗脱液于250-mL梨形瓶中。

于40℃水浴中旋转浓缩至干，用石油醚，供气相色谱测定或气相色谱-质谱确证。

3.3测定

3.3.1气相色谱〔GC/ECD〕条件

a〕色谱柱：

25m×0.32mm〔内径〕×0.25μm〔膜厚〕，PAS-1701石英毛细管柱或相当者；

b〕色谱柱温度：

50℃〔2min〕20℃/min180℃〔1min〕4℃/min250℃〔1min〕；

c〕进样口温度：

280℃；

d〕检测器温度：

300℃；

e〕载气、尾吹气：

氮气，纯度≥9％，柱流量1.4mL/min，尾吹流量50mL/min；

f〕进样方式：

无分流进样，1.5min后开阀；

g〕进样量：

1μL

3.3.2气相色谱测定

根据样液中有机氯杀虫剂含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液。

标准工作溶液和待测样液中各有机氯杀虫剂的响应值均应在仪器检测的线性范围内。

对标准工作溶液与样液等体积参插进样外标法测定。

在上述气相色谱条件下，15种有机氯杀虫剂的出峰顺序为：

六氯苯、α-BHC、五氯硝基苯、γ-BHC、七氯、艾氏剂、β-BHC、δ-BHC、环氧七氯、p,p'-DDE、狄氏剂、异狄氏剂、o,p'-DDT、p,p'-DDD、p,p'-DDT。

3.4确证

3.4.1气相色谱-质谱〔GC/MSD〕条件

a〕色谱柱：

30m×0.25mm〔内径〕×μm〔膜厚〕，DB-1701石英毛细管柱或相当者；

b〕色谱柱温度：

50℃〔2min〕30℃/min200℃〔1min〕4℃/min260℃〔4min〕；

c〕进样口温度：

270℃；

d〕色谱-质谱接口温度：

270℃；

e〕载气：

氦气，纯度≥99.99％，1.5mL/min；

f〕电离方式：

EI；

g〕电离能量：

70eV；

h〕测定方式：

选择离子监测方式〔SIM〕；

i〕选择监测离子〔m/z〕：

15种有机氯杀虫剂的特征选择离子〔m/z〕；

j〕进样方式：

无分流进样，1.5min后开阀；

k〕进样量：

1μL

3.4.2气相色谱-质谱阳性结果确证

根据上述测定结果，如果样液与混合标准工作溶液在相同保存时间有色谱峰出现，那么对所需确证的某种有机氯杀虫剂按照表１选择其特征选择离子，在3.4.1操作条件下，对混合标准工作溶液与样液等体积参插进样测定，如果样液与混合标准工作溶液的SIM质谱图中的三个碎片离子的种类和丰度比均一致，可作出样品中有该种有机氯杀虫剂阳性检出的判断。

三、实验结果讨论

〔1〕提取方法：

据文献报道，有机氯农药残留分析，提取一般多项选择用①索氏〔Soxhlet〕提取法、②浸渍提取法、③振荡提取法、④均质法、⑤超声波提取法等。

本方法采用均质法提取，根据相似相容原理，以石油醚为提取溶剂，经提取效率试验，即采用添加法制备有机氯含量为1.00mg/kg的2个人参平行样品、2个刺五加平行样品，振摇混合均匀，密闭冷藏放置7天后进行测定；同时将经提取后的残渣作为另一样品单独进行测定，结果说明，回收率为95.8%以上，残渣再测定样品均未检出有机氯，可见，本法提取效率较高，且提取时间仅需3min。

实验结果见表1。

表1提取效率实验结果

添加浓度1.00mg/kg

人参样品（回收率％）

刺五加样品（回收率％）

平均

样品

残渣

N.D.

〔2〕净化方法：

据文献报道，有机氯农药残留分析，净化一般多项选择用液-液分配法、液-固分配法即层析柱法或凝胶渗透法、化学处理法即磺化法等。

磺化法净化虽然简单，净化效果较好，但对五氯硝基苯、七氯、艾氏剂、环氧七氯、狄氏剂、异狄氏剂回收率较低〔回收率为43-67%〕、而凝胶渗透法仪器设备昂贵，不易推广使用。

因此，本方法结合中药材提取液中色素、油脂等杂质含量较多的特点，选用液-液分配法和层析柱法净化，即采用石油醚-水相液液分配后，弗罗里硅土层析柱净化。

经洗脱回收试验，净化效果令人满意。

同时，做了国外与国内产的Florisil净化效果的比较，比较说明国外的Florisl净化效果明显好于国产，结果见表2。

表2弗罗里硅土洗脱回收试验

Florisil

洗脱液

石油醚

乙醚-石油醚（5+95）

50mL

10mL

20mL

30mL

40mL

50mL

总计

进口

回收率%

色素

无

浅黄

国产

回收率%

15.3

31.2

色素

无

浅黄

黄

深黄

黄

深黄

〔3〕气相色谱条件选择

μm〕石英毛细管柱，采用色谱柱程序升温，利用毛细管不分流进样及其溶剂效应技术，取得了良好别离效果，且定量准确。

经条件试验，在选定的色谱条件下，标准物的气相色谱图见图1，淫羊藿样品空白色谱图和添加色谱图见图2。

图１有机氯杀虫剂标准物气相色谱图

1.六氯苯〔10.531min〕

2.α-BHC〔11.510min〕

3.五氯硝基苯〔11.838min〕

4.γ-BHC〔12.554min〕

5.七氯〔13.120min〕

6.艾氏剂〔13.886min〕

7.β-BHC〔14.884min〕

8.δBHC〔15.598min〕

9.环氧七氯〔16.329min〕

10.p,p'-DDE〔18.002min〕

11.狄氏剂〔18.486min〕

12.异狄氏剂〔19.218min〕

13.o,p'-DDT〔19.755min〕

14.p,p'-DDD〔20.096min〕

15.p,p'-DDT〔21.760min〕

图2-1淫羊藿样品空白的色谱图

图2-2淫羊藿μg/g〕

〔4〕气相色谱/质谱阳性确证

首先通过全扫描方式做出总离子流图〔TIC〕图，并在农药库中检索，证明确系每一种有机氯杀虫剂，以保证确证的可靠性。

然后对每一种有机氯杀虫剂根据其TIC图中的碎片离子，选择三个丰度相对较高、分子量较大的碎片离子作为该有机氯杀虫剂确证的特征目标监测离子，并计算其三个碎片离子的丰度比。

最后采用气相色谱/质谱选择离子〔SIM〕方式进行样品测定，并根据每一种有机氯杀虫剂三个碎片离子的种类和丰度比作为其阳性确证结果。

试验结果说明，该方法确证结果准确可靠，每一种有机氯杀虫剂的特征选择离子见表3，标准物的气相色谱/质谱图见图3。

表3有机氯杀虫剂的特征选择离子表

序号

有机氯杀虫剂名称

分子式

CASNo.

特征选择离子及丰度比

六氯苯

α-BHC

五氯硝基苯

γ-BHC

七氯

艾氏剂

β-BHC

δ-BHC

环氧七氯

p,p'-DDE

狄氏剂

异狄氏剂

o,p'-DDT

p,p'-DDD

p,p'-DDT

C6Cl6

C6H6Cl6

C6Cl5NO2

C6H6Cl6

C10H5Cl7

C12H8Cl6

C6H6Cl6

C10H5Cl7O

C14H8Cl4

C12H8Cl6O

C14H9Cl5

C14H10Cl4

C14H9Cl5

118-74-1

319-84-6

82-68-8

58-89-9

76-44-8

309-00-2

319-85-7

319-86-8

1024-57-3

72-55-9

60-57-1

72-20-8

789-02-6

72-54-8

50-29-3

282〔47〕，284〔100〕，286〔75〕

217〔80〕，219〔100〕，221〔52〕

237〔100〕，249〔88〕，295〔90〕

217〔78〕，219〔100〕，221〔50〕

270〔56〕，272〔100〕，274〔73〕

261〔59〕，263〔100〕，265〔58〕

217〔74〕，219〔100〕，221〔48〕

217〔79〕，219〔100〕，221〔53〕

351〔54〕，353〔100〕，355〔78〕

246〔100〕，316〔57〕，318〔79〕

263〔100〕，277〔86〕，380〔49〕

245〔53〕，263〔100〕，281〔66〕

235〔100〕，236〔18〕，237〔67〕

235〔100〕，236〔15〕，237〔64〕

235〔100〕，236〔16〕，237〔68〕

图3有机氯标物的选择离子色/质谱图

1.六氯苯〔9.846min〕

2.α-BHC〔1min〕

3.五氯硝基苯〔1min〕

4.γ-BHC〔1min〕

5.七氯〔1min〕

6.艾氏剂〔1min〕

7.β-BHC〔1min〕

8.δBHC〔1min〕

9.环氧七氯〔1min〕

10.p,p'-DDE〔16.873min〕

11.狄氏剂〔1min〕

12.异狄氏剂〔1min〕

13.o,p'-DDT〔1min〕

14.p,p'-DDD〔min〕

15.p,p'-DDT〔2min〕

〔5〕线性关系

在本法所确定的实验条件下，对15种有机氯杀虫剂进行测定，试验结果说明，在表4所列的范围内与响应值均有良好的线性关系。

〔6〕测定低限

本方法的测定低限和确证低限是根据对各种有机氯杀虫剂测定的灵敏度而制定的，完全满足国外最高残留限量〔MRL〕对各种中药材中多种有机氯杀虫剂的检测需要。

详见表4。

表415种有机氯杀虫剂在ECD的线性关系和测定低限

有机氯杀虫剂

名称

标准物进样量

范围〔ng〕